A TERMÉSZETES ÖLŐSEJTEK (NK) MŰKÖDÉSE ÉS GENOMIKAI JELLEGZETESSÉGE Benczúr Miklós
Activated by DC pro-nk pre-nk i-nk CD56bright-NK CD56dim-NK CD117: őssejt növekedési faktor-r (SCFR) CD161: NKR-P1 (C-tip lektin) 1. NK TNF-alfa, GMCSF----DC 2. NK: NKp30aktiváló-R ----éretlen DC+ 3 DC membrán-kötött IL15 ---NK 1 2 3 4 5 HEMATOPOET CSV SEJT CD34+CD45RA+ EXTRAVASATIO A HEV TERÜLETEN PRO-NK BÓL KORAI-NK CD56brighjt és KÉSŐI-CD56dim-NK a KÉSŐI,ÉRETT-NK A KERINGÉSBE TÁVOZIK a KORAI-NK az INTERSTITIUMBAN a DC el LÉP INTERAKCIÓBA Caligiuri, Blood 112:461-9, 2013
gátol aktivál GÁTLÓ és AKTIVÁLÓ RCEPTORAI KIR2DS1 p50.1 CW4 NK SEJTEK KIR2DS2 p50.2 CW3? KIR2DS3 p50.3? NKG2D KIR3DL1 p70 / NKB1 B27, B51 BW4 BW6,B7,B8, B14 CD94-NKG2 NKG2D CD94-NKG2E (HLA-E,MICA) CD94-NKG2F (?) CD94-NKG2A (HLA-G?) CD94-NKG2B (HLA-E) DAP12 ITIM p140 HUMÁN NK SEJT A3, A11 ITIM DAP12 KIR3DL2 p58.1 KIR KIR2DL2 CW3-1-7-8) CW4-2-5-6 p58.2 KIR? p58.3 KAR KIR= killer immunglobulin-like receptor KIR2DL1 KIR2DL3
L-selectin JELLEMZŐIK: az NK sejtek 5-10%-át adják - nem, vagy csak kis sűrűségben hordozzák a CD16-FcRIII-R struktúrát, - kevés enzim molekula -jelentős mennyiségben termelnek számos citokint (IFN, TNF, -, -- GM-CSF, IL-10, IL13,) és citokin receptorokkal is bírnak IL2R --(szerin eszterázok granzimek, IL15R -az immunrendszer szabályozásában vesznek részt IL10 IFN IFN R TNF,- GM-CSF -nagy-kötőerejű IL2 citokin receptor (IL2-R ), csak ezen az NK sejtcsaládon kifejezett - a -IFN termelést csak egy CD8 negatív alosztályuk végzi - sejtek felszínén: L-selectin és integrinek Perif. vérben 1%
JELLEMZŐIK: - az NK sejtek 85-95%-át adják CX3CR1 CXCR1 IFN TNF, - GM-CSF IL2R IL15R IFN R LFA-1 PSGL-5 - sejt-sejt kapcsolat (LFA1, CD2, PSGL-1/PEN5, CD44). - citokin receptorok (IL7R, IL15R, IL2R, IFNg-R IL21R) - CD16/FcRIII receptor és a citoplazmában kifejezett azurofil granulumok -ozmotikus sejthalállal ( lyukfúrás ) - apoptózist indítanak be a (FASligand, TNF vagy TRAIL ligand útján)
LIGANDUM 3DL2 HLA-A3,A11, gátló P140 CD158k 3DL1 HLA-Bw4 B27 B51 gátló P70 2DS1 HLACw Lys80 aktiváló P50.1 CD158h 2DS2 HLAC1 Asn80 aktiváló P50.2 CD159j 2DS2/3 HLAC1 gátló P50 p 140 p70 NK SEJTEK (KIR) IgSF RECEPTORAI (Ig Super-gén Familia) a 19q 13.42 kromoszómán p58 p50 NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 ---S-S--- YXXL YXXL YXXL YXXL COOH COO H COOH COOH COOH 95aa. 84aa. 76-84aa. 39aa. YXXL = ITIM = immunoreceptor tyrosine-alapú inhibiciós/gátló motivum (AENTITYSLLKHP) (26 as-ból álló konzervatív elem jelátvitelben fontos)
Emberi NK sejtek receptorai 1. Immunglobulin-szerű, un. KIR-Receptorok (Killer Immunglobulin-like-Receptor) a KIR gének a 19q 13.42 kromoszómán kódoltak,legalább 15 haplotípus, az Immunglobulin szupergén család tagjai. Az intracitoplazmatikus szakasz lehet hosszú(l) általában 3 ITIM motívummal, a ligandummal való kapcsolat gátló szignált vált ki, vagy rövid (S), amelyek általában adaptor fehérjék közvetítésével aktiváló jelt generálnak Ligandumaik a Class-I struktúrák KIR LIGANDUM FUNKCIÓ EPITOP megjegyzés 2DS1 HLACw Lys80 aktiváló N77 K80 P50.1 protein CD158h 2DS2 HLAC1 Asn80 aktiváló S77 N80 P50.2 protein CD159j 2DS3 HLAC1 gátló? P50 protein bizonytalan 2DS4 HLACw Lys80? aktiváló P50.3 protein CD158l 2DS5? aktiváló P50 protein 2DS6 P50 protein CD158c KIRX 2DL1 HLAC2 Lys80 gátló N77 K80 P58.1, DAP12- adaptor molekulával CD158a 2DL2,3 HLAC1Asn80 gátló S77 N80 P58, DAP12- CD158b1/b2 2DL3? gátló S77 N80 P58 2DL4 HLA-G, HLA-A3, HLA-B46, HLA-B7 gátló/aktiváló P58 2DL5? gátló/aktiváló P58 3DL1 HLA-Bw4 B27 B51 gátló 77-83 P70 3DL2 HLA-A3,A11, gátló P140 CD158k 3DL3? gátló 3DS1 HLA-Bw4? aktiváló?
GÁTLÓ RECEPTOROK AKTIVÁLÓ RECEPTOROK FOSZFATÁZOK TIROZIN KINÁZOK Borrego, 2002. Mol. Immunol. Az aktiváló szignált kiváltó receptorok elsősorban a veleszületett immunrendszernek a pathogének elleni védekező funkció szolgálatában állnak és HLA Class-I struktúrákat felismerő képességük háttérbe szorul.
A HIÁNYZÓ SAJÁT antigén ( missing self ) minden magvas sejten kifejezett az MHC-I struktúra Ljunggren és Kärre, 1990
Az emberi NK sejtek a természetes immunrendszer részei Ezen funkciójukon túl az NK sejtek a T és B- sejtektől eltérően nem antigén receptor segítségével ismerik fel a szervezetben képződő idegen sejteket, hanem térlátásuk révén észlelik a saját sejtektől eltérő célsejtek (megváltozott saját, vírus-infektált, -mutáns sejtek) felszíni változásait. Ez elsősorban az MHC-I-et felismerő gátló receptoraik révén valósul meg. Scott D.B.2008
NK sejt vándorlás KEMOKINEK ENDOTEL GYULLADÁSOS CITOKINEK szövetek Nyirokcsomóban Paracortex Dendritic sejtek közelében (érés) lassú motilitás L-selectin CCR7 CXCR3 CXCR4 CCR5 Maghazachi 2005,Vivier 2006
KIR-RECEPTOROK (gátló és aktiváló) GÉNEK a 19q KROMOSZÓMÁN CHR19q 13.42 leukocyte receptor complex or cluster (LRC) (LAIR): leukocyte associated inhibitory receptors (ILTs): Ig-like transcripts (MIRs): monocyte inhibitory receptors Lanier Curr.Op.Immunol.2003
lektin receptorok EMBERI NK SEJTEK GÁTLÓ ÉS AKTIVÁLÓ RECEPTOROK GÉNJEI A 12-es KROMOSZÓMÁN Lanier Curr.Op.Immunol.2003
Mindennapos gyakorlatban: NK sejt = CD56+CD16+ CD3- Valamennyi emlősre funkcionálisan jellemző: NKp46+, CD3-, IL15 dependens, IL12-re válaszoló limfocita, -- amely az érés során az IFN-g, korai forrása, erős killer kapacitással bír a saját konstitutív molekulát elvesztő (Class-I), vagy stress indukált molekulát kifejező (NKG2D ligandum) célsejtekre. (Walzer et al. Curr Opinion Immunol.19:365. 2007
Emberi NK sejtek receptorai 2. Lektin receptorok 12. kromoszómán Kálcium függő transzmembrán proteinek, amelyek a C típusú lektinkötő külső doménnel bírnak (CD94). gátló, vagy aktiváló tulajdonságot hordoznak. Az NKG2D homodimer formában nem kapcsolódik a CD94-el. Az MHC komplexben kódolt, stressz indukált struktúrákat ismernek fel (MICA és MICB). NKG2 gének izoformjai (A-H) számos glikoprotein receptort alkotnak a diszulfid híddal kapcsolódó CD94-el. Ezek a proteinek egyrészt a nem klasszikus HLA E molekula receptorai (NKG2A) illetve, a további HLA-F és H molekulával (NKG2C- E -H) kapcsolódnak. A KIR és a lektin receptorok különböző kromoszómákon elhelyezkedő géncsaládok által kódoltak, ezért az MHC génektől (mind a receptorok, mind a ligandok) függetlenül szegregálódnak. Ez azt eredményezi, pl. hogy HLA-antigénekben egyező őssejt donorok az NK sejtek KIR receptoraiban inkompatibilisek lehetnek. A humán populáció jelentős részben olyan KIR receptorokkal is bír, amelyeknek ligandjai nem is fejeződnek ki a saját sejteken, (azonban minden NK sejtnek van a saját class-i ligandjára specifikus receptora). RECEPTOR LIGAND FUNKCIÓ megjegyzés CD94/NKG2A HLA-E gátló CD94-el kovalens kötés CD94/NKG2C HLA-E aktiváló CD94-el kovalens kötés
Emberi NK sejtek receptorai 3. CITOTOXIKUS / AKTIVÁLÓ -Receptorok Emberi NK sejtek TLR receptorokkal (TLR2,-3,-7,-8,-9 is bírnak, amelyek a patogén ágensek molekuláris mintázatát (PAMP) felismeri, így a természetes védekezés korai fázisában, direkt módon (is) képesek védeni a szervezetet. Az NK sejteken csak az ILT-2 (LIR-1, MIR7, CD85j) receptorok fordulnak elő, amelyeknek 4 exctracelluláris Ig doménjük + 4 ITIM motívumuk van, (reagál a HLA-G- és HLA-F-el is). Az NKp46, NKp30 és az NKp44- elsődlegesen citolitikus reakciót kiváltó NK receptorok. Receptor Ligand Funkció megjegyzés NKG2D MICA,MICB, aktiváló Homodimer molekula,nem kapcsolódik CD94-el, ULBP valamennyi nyugvó és aktivált NK sejten ILT HLA- gátló immunglobulin szerű átirat (Ig like transcript) LIR HLA-G gátló leukocita Ig-szerű receptor NKp30? aktiváló CD3 - malária falciparum NKp44? aktiváló Vírus hemagglutinin ligandum? de novo szintézis IL2-re NKp46? aktiváló Vírus hemagglutinin ligandum? NKp80? aktiváló, citotoxicitás 2B4(CD244)CD48 aktiváló koreceptor, citokin termelés CD2 LFA-2 aktiváló koreceptor LFA-1 ICAM-1 aktiváló koreceptor CD16 Fc IIIR aktiváló TLR PAMP aktiváló Toll receptorok Citokin közös -lánc IL2-,IL15- IL21 proliferáció, citotox. IFN -R IFN proliferáció citotox. c-kit proliferáció PEN5 CD62L -PSGL1- CD40L CD40 apoptozis indukció
NK sejtek a klinikumban Mandal,., Viswanathan, Hemat.Oncol Stem Cell Ther.82:47-55.,2015. BETEGSÉG., NK SEJT SZEREPE NK A BETEGSÉG ALATT TERHESSÉG SM AZ ELSŐ TRIMESZTERBEN A FOETUS MEGTARTÁSA GÁTOLJA A DEMYELINIZÁCIÓT KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN U-NK SEJTEK A DECIDUÁBAN, NK ALACSONY NK SZÁM ÉS AKTIVITÁS A VÉRBEN, TERÁPIÁS MEGKÖZELÍTÉS IVIG TERÁPIA RECURRENS ABORTUSBAN CYTOKINEK AZ NK AKTIVITÁS EMELÉSÉRE Petrányi t al.,2012.mofflett-king,et al., 2002.,Benczúr,M.,2009.,Benczúr,et al.1980. Hao, et al., 2010. TUMOROK IMMUN-SURVEILANCE ALACSONY AKT. ADOPTÍV TRANSZFER Street,et al.2004., Gellet, et a., 2011. VÍRUS INFEKCIÓK IMMUN VÉDELEM ALACSONY SZÁM ÉS Shift korai NK sejtekre ADOPTÍV TRANSZFER, HIV-1 specifikus NK-sejt receptor, CCR5 deficiens hesc_nk sejt transzfer Lunemann, et ak.,2014.,guo,et al. 2009. RA BETEGSÉG FOKOZÁSA ALACSONY NK SZÁM ÉS AKTIVITÁS A VÉRBEN, SYNOVIUMBAN ELLENKEZŐLEG SLE A BETEGSÉG KONTROLLJA, ALACSONY NK SZÁM ÉS AKTIVITÁS A VÉRBEN, KORAI NK SEJTSZÁM NŐ Anti-NKP-46 antitest Pázmány és Do, 2005 ADOPTÍV TRANSZFER Herviet, et al., 2011.,Park,et al.2009.
Családon belüli haplo-identikus őssejt átültetés (főként AML) NK sejtek nagy affinitással bírnak a csontvelői dendritikus sejtek iránt: repopulálódó leukemia sejtek, maradék leukemia sejtek (ez magyarázza, hogy az allo-reaktív NK sejtek nem váltanak ki GVH reakció) Ruggeri és mtsai 112 magas kockázatú akut leukémiás betegnél reaktív NK sejtek esetében nem alakult ki legalább II.fokozatú GVHD (0% vs.75%) Másik 85 progressziv stádiumú AML a relapsusok száma a reaktív immungenetikai viszonyban alacsonyabb volt (7% vs.79%) Hsu és mtsai azok az AML betegek éltek tovább relapsus mentesen, akikben hiányzott a donor KIR genotipusának megfelelő HLA ligand
NK sejt - őssejt transzplantáció GVH elkerülése: Haplo-identikus donor, aki KIR-Ligandumban NEM EGYEZŐ (un.mismatched) Megfelelő kondicionáló kezelés (Redukált Intenzitású Condicionálás RIC) meggátolja a transplantátum kilökődését Kevés donor-t sejt bevitele (depléció) Kontrollált donor limfocita infúzió (DLI) Alacsony NK-aktivációs ligandum jelenléte Kimutani, hogy a haploidentikus donor NK sejt megöli a recipiens DC-sejteket ADCC is részt vesz az új terápiás eljárásokban Rituximab(anti-CD20) Feltétel: MHC I incompatibilitás donor-nk és recipiens között TÖBB,MINT 200 KLINIKAI VIZSGÁLATI SOROZAT, AMIBŐL: PHASE I/II 11, PHASE II 17 PHASE III 3 10% SOLID TUMOR, 22 TRIAL ALLOGÉN hematop. őssejt ÖSSZESEN1863 beteg BETEG
1. NAGY GRANULÁRIS LIMFOCITÁK ( LGL) 2. AZ ŐSI, NEM ADATPTÍV, A TERMÉSZETES IMMUNVÁLASZ RÉSZÉT KÉPEZŐ SEJTEK, AMELYEK A KORAI T-SEJT DIFFERENCIÁLÓDÁSBÓL SZÁRMAZNAK 3. SZÁMOS CITOKINT TERMELNEK ÉS CITOKIN SZABÁLYOZÁS ALATT ÁLLNAK -- CITOTOXIKUS ÉS SZABÁLYOZÓ KÉPESSÉGGEL BÍRNAK 4. HIÁNYZIK A TCR-CD3 KOMPLEXÜK 5. JELLEMZŐEN NKp46+, CD3-, IL15 dependens, IL12-re válaszoló limfocita 6. GÁTLÓ RECEPTORUK VAN ELSŐSORBAN AZ MHC (CLASS-I) STRUKTÚRA FELISMERÉSÉRE 7. AZ AKTIVÁLÓ SZIGNÁLT KIVÁLTÓ RECEPTOROK ELSŐSORBAN A VELESZÜLETETT IMMUNRENDSZERNEK A PATHOGÉNEK ELLENI VÉDEKEZŐ FUNKCIÓ SZOLGÁLATÁBAN ÁLLNAK 8. MINTÁZAT FELISMERŐ KÉPESSÉGÜK RÉVÉN DIREKT MÓDON IS A TERMÉSZETES IMMUNRENDSZER EFFEKTOR SEJTJEI Összefoglalás NK SEJTEK FŐBB JELLEMZŐI
Köszöm a figyelmet!
p 140 p70 p58 p50 NH2 NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 ---S-S--- YXX YXXL YXXL L YXXL COOH CO CO COOH COOH OH OH 95aa. 84aa. 76-84aa. 39aa. KIR2DS1 (HLA-cW4) KIR2DS2 (HLA-C-?) KIR2DS3 (?) KIR2DS4 (HLA-C-?) KIR2DS5 (?) NKG2D (?) CD94-NKG2E (HLA-E,MICA) CD94-NKG2F (?) KIR2DL4 (HLA-G) KIR2DS1 (HLA-B) KIR2DL1 (HLA-CW2,-4,-6,-15) KIR2DL2 (HLA-CW1,-3,-7,-8) KIR3DL1 (HLA-CW1,-3,-7,-8) KIR3DL2 (HLA-A3?) CD94-NKG2A (HLA-E) CD94-NKG2B (HLA-E) Th1 citokin (IFN, IL2,) TERMELÉS, T-sejt és MF aktiválás (TNF, NO), trofoblaszt elleni citotoxikus reakció, abortus Th2 citokin (IL3,IL4,IL5,IL10,,) TERMELÉS, NK sejt gátlás PIBF(Szekeres-Bartho), MLR-Bf (Progesteron- Indukált Blokkoló Factor),
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imm.12224/full#imm12224-fig-0002
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imm.12224/full#imm12224-fig-0002
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imm.12224/full#imm12224-fig-0002
NK HAPLOTÍPUSOK Számos populációban igen gyakori egy egyszerű KIR haplotípus, amelyet A haplotípusnak is neveznek, 7 gént és 2 pseudo-gént jelent. A 7 gén 4 gátló receptort kódol a fő HLA struktúrákra és 3 gént azokra a receptorokra, amelyek funkciója kevéssé ismert (KIR3DL3, KIR3DS4 és a KIR2DL4 receptor), aktiváló receptorokban szegény A KIR2DL4 és KIR2DS4, közös alléljuk van, amelyek különböző okok miatt (a szerkezet megváltozását okozó deléció, illetve insertio) feltehetően nem funkcióképesek. Úgy tűnik, hogy milliók élnek aktiváló hatású NK receptorok nélkül (Parham, 2004 ) A másik un. B haplotípus főként aktiváló receptorokat kódol, KIR2DL2 KIR3DL3 minden NK sejten kimutatható gátló R KIR3DL4
nevezéktan
AZ NK PRECURSOR SEJT-specifikusan KIFEJEZŐDŐ GÉNEK (30 gén) Gének HSC pnk mnk ( OP9) mnk (+OP9) UniGene ID Lysozyme 12 1321 2 3 Mm.45436 Ferritin H chain 25 962 7 18 Mm.1776 Brevican 7 259 1 1 Mm.4598 Matrix metalloproteinase 12 0 69 0 0 Mm.2055 Cellular repressor of EIA-stimulated gene 5 45 7 1 Mm.459 c-kit ligand 0 62 0 0 Mm.4235 S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B) 1 42 0 1 Mm.2128 MPS1 protein 1 35 0 0 Mm.3999 Transglutaminase 2 0 25 1 1 Mm.18843 Serum and glucocorticoid-regulated protein kinase 0 20 0 0 Mm.28405 RIKEN cdna5830413l19 0 18 0 0 Mm.159648 β2-microglobulin mrna 0 17 0 0 Mm.163 Interferon-induced protein 0 17 0 0 Mm.951 Milk-fat globule membrane protein EGF factor 8 3 16 0 1 Mm.1451 Fcγ receptor 3 15 1 1 Mm.22119 Cell-surface glycoprotein p91 0 13 0 1 Mm.3189 Arginase 1 0 12 0 0 Mm.154144 Tumor necrosis factor receptor 1 1 12 0 2 Mm.2666 Retinoid-inducible serine carboxypeptidase 2 11 0 0 Mm.34126 Similar to hypothetical protein FLJ11000 0 11 2 0 Mm.46356 Interleukin-18 binding protein d precursor 0 10 0 0 Mm.45579 Chloride channel 7 0 9 1 0 Mm.22727 CD36 antigen 0 8 0 0 Mm.18628 Similar to putative zinc-finger protein 1 8 1 0 Mm.205022 Carbohydrate binding protein 35 0 7 3 0 Mm.2970 C-type calcium-dependent, carbohydrate 0 7 0 0 Mm.28263 Lipoprotein lipase 0 7 0 0 Mm.1514 v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene 0 6 0 0 Mm.67919 Interleukin 7 receptor 0 5 0 0 Mm.389 Chemokine (C-C) receptor 1 0 5 0 0 Mm.57051 Neuropilin (MGD MGI:106206) 0 5 0 0 Mm.27448 (Hyung et al. 2005 Genomics)
HLA Antigens Bw4 and Bw6 associated specificities The following specificities are generally agreed inclusions of HLA epitopes Bw4 and Bw6. Bw4: B5, B5102, B5103, B13, B17, B27, B37, B38(16), B44(12), B47, B49(21), B51(5), B52(5), B53, B57(17), B58(17), B59, B63(15), B77(15) A9, A23(9), A24(9), A2403, A25(10), A32(19) Bw6: B7, B703, B8, B14, B18, B22, B2708, B35, B39(16), B3901, B3902, B40, B4005, B41, B42, B45(12), B46, B48, B50(21), B54(22), B55(22), B56(22), B60(40), B61(40), B62(15), B64(14), B65(14), B67, B70, B71(70), B72(70), B73, B75(15), B76(15), B78, B81, B82 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imm.12224/full#imm12224-fig-0002
Humán NK SEJTEK HAPLOTÍPUSAI 50% FRAMEWORK Li Hao,2006
KIR PRIMEREK GENOTIPIZÁLÁSHOZ GAGNE és mtsai Human Immunol.,2002
GAGNE és mtsai Human Immunol.,2002
Az in vitro NK sejtek fejlődése differenciálódása, sejtfelszíni markerek, és potenciális szabályozó elemek. NÖVEKEDÉSI FAKTOROK Hematopoet. őssejt Közös Ly precursor T/NK precursor NK precursor Érett NK Érett NK TRANSZKRIPT FAKTOROK Stroma sejt (OP9) Tirozin kinase Fms-like tyrosine kinase ligand Stem-cell-antigen-1 SEJTFELSZÍNI MARKEREK Stage-specific expressing genes (SAGE) (Hyung-Sik et al.-)