Retinoid X Receptor, egy A-vitamin szenzor a tüdőmetasztázis kontrolljában Kiss Máté! Magreceptor Kutató Laboratórium Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar
Tumor progresszió és metasztázis bűntárs az immunrendszer Invázió makrofág neutrofil granulocita éretlen myeloid sejt Intravazáció Metasztázisképzés Extravazáció Módosítva Kitamura et al. Nat. Rev. Immunol. 2015 alapján
A primer tumor premetasztatikus tüdőt alakít ki Primer tumor Metasztatikus tumorsejtek Csontvelői sejtek Szekretált faktorok S100a8/9 SAA3 TNFα MMP Egészséges tüdő Premetasztatikus tüdő Metasztatikus tüdő
Célkitűzés Milyen útvonalak szabályozhatják a tüdő immunsejtjeinek átprogramozódását a premetasztatikus tüdőben?? S100a8/9 SAA3 TNFα MMP Egészséges tüdő Premetasztatikus tüdő
Premetasztatikus tüdő globális génexpressziós analízise 67NR benignus és 4T1 malignus egér emlőtumor Tüdő Daganatos állat Egészséges Benignus Malignus 581 gén Microarray kísérlet: Kowanetz et al. PNAS 2006 (GSE62817)
A premetasztatikus tüdőben felülreprezentáltak a Retinoid X Receptor (RXR)-szabályozott útvonalak Ingenuity útvonalak -log(p-érték) Granulocita adhézió és diapedezis 6.63 Leukocita extravazáció 4.26 Makrofágok, fibroblastok, és endothel sejtek szerepe rheumatoid arthritisben 4.19 IL-10 jelátvitel 4.00 TREM1 jelátvitel 3.78 LXR/RXR aktiváció 3.66 IL-17A szerepe a psoriasisban 3.65 Natural killer sejt aktiváció 3.08 Toll-like receptor jelátvitel 3.07 Kommunikáció a veleszületett és szerzett immunitás sejtjei között 2.91 LPS/IL-1-mediált RXR funkció gátlás 1.42 VDR/RXR aktiváció 0.94 PPARα/RXR aktiváció 0.90
A Retinoid X Receptor egy összetett hatású A-vitamin szenzor A-vitamin 9-cisz-retinsav Zsírsavak Morfogenezis Metabolizmus Immunitás
Premetasztatikus géncsoport qpcr validálása Lewis tüdő carcinoma (LLC) egér xenograft modell vs. egészséges tüdő premetasztatikus tüdő (LLC tumor) Változás (premetasztatikus/egészséges) p-érték n=3/3 S100a8 88.81 0.00001 Mmp9 85.29 0.0087 S100a9 77.67 0.00002 Il1r2 63.66 0.0041 MMP8 60.18 0.0033 Ngp 49.80 0.0001 Csf3r 38.61 0.0002 Il1b 34.37 0.0001 Sell 12.99 0.00001 Il1f9 12.24 0.0005 Camp 10.46 0.00001 Saa3 9.63 0.0317 Itgam 8.80 0.0001 Vcan 7.62 0.0074 Il18rap 7.10 0.0136 Lcn2 6.76 0.00001 Ltf 5.08 0.0012 Il1rap 3.40 0.0033 Il1rn 2.81 0.0017 Cd14 2.37 0.0074
A myeloid RXR hiányában egyes premetasztatikus gének kifejeződése fokozott a tüdőben vs. vs. KO egészséges tüdő premetasztatikus tüdő (LLC tumor) kontroll tüdő myeloid RXR KO tüdő Változás (premetasztatikus/egészséges) p-érték n=3/3 S100a8 88.81 0.00001 Mmp9 85.29 0.0087 S100a9 77.67 0.00002 Il1r2 63.66 0.0041 MMP8 60.18 0.0033 Ngp 49.80 0.0001 Csf3r 38.61 0.0002 Il1b 34.37 0.0001 Sell 12.99 0.00001 Il1f9 12.24 0.0005 Camp 10.46 0.00001 Saa3 9.63 0.0317 Itgam 8.80 0.0001 Vcan 7.62 0.0074 Il18rap 7.10 0.0136 Lcn2 6.76 0.00001 Ltf 5.08 0.0012 Il1rap 3.40 0.0033 Il1rn 2.81 0.0017 Cd14 2.37 0.0074 Változás (myeloid RXR KO/kontroll) p-érték n=6/6 S100a8 1.43 0.2808 Mmp9-1.33 0.3181 S100a9 1.34 0.3910 Il1r2 1.40 0.0593 MMP8 3.19 0.00001 Ngp 4.22 0.0285 Csf3r 1.08 0.7454 Il1b -1.41 0.4172 Sell 1.21 0.4189 Il1f9 1.07 0.8159 Camp 4.24 0.0496 Saa3 6.84 0.0197 Itgam 1.04 0.7804 Vcan -1.08 0.6227 Il18rap 1.03 0.8468 Lcn2 2.08 0.0114 Ltf 1.63 0.0686 Il1rap 1.08 0.2417 Il1rn -1.19 0.1982 Cd14-1.10 0.5209
A myeloid RXR hiányában egyes premetasztatikus gének kifejeződése fokozott a tüdőben vs. KO kontroll tüdő myeloid RXR KO tüdő Li et al. Oncogene 2013 Hiratsuka et al. Nature Cell Biology 2008 Leng et al. Cancer Research 2009 Változás (myeloid RXR KO/kontroll) p-érték n=6/6 S100a8 1.43 0.2808 Mmp9-1.33 0.3181 S100a9 1.34 0.3910 Il1r2 1.40 0.0593 MMP8 3.19 0.00001 Ngp 4.22 0.0285 Csf3r 1.08 0.7454 Il1b -1.41 0.4172 Sell 1.21 0.4189 Il1f9 1.07 0.8159 Camp 4.24 0.0496 Saa3 6.84 0.0197 Itgam 1.04 0.7804 Vcan -1.08 0.6227 Il18rap 1.03 0.8468 Lcn2 2.08 0.0114 Ltf 1.63 0.0686 Il1rap 1.08 0.2417 Il1rn -1.19 0.1982 Cd14-1.10 0.5209
B16-F10 melanoma metasztázis modell 0. nap 21. nap Intravénás injekció: 10 5 B16-F10 melanoma sejt / egér Tüdő eltávolítása
A myeloid RXR hiányában több B16-F10 melanoma metasztázis képződik a tüdőben Makroszkópos metasztázis szám Mikroszkópos metasztázis szám n=10 n=13 n=8 n=8 kontroll myeloid RXR KO kontroll myeloid RXR KO
A metasztázisok méretmegoszlása a myeloid RXR KO állatokban különbözik n=8/8
100 µm alatti metasztázisok myeloid RXR KO állat tüdejében 100 µm
Lewis tüdő carcinoma (LLC) spontán metasztázis modell 0. nap 21. nap Subcutan injekció: 2x10 6 LLC sejt / egér Tüdő eltávolítása
A myeloid RXR hiányában nő a spontán LLC tüdőmetasztázisok száma Primer tumor növekedés Tüdőmetasztázis gyakorisága Makroszkópos metasztázis szám
A myeloid RXR hiányában nem változik a tüdő myeloid sejt infiltrációja (CD11b + Ly6G + ) (CD11b + Ly6G - Ly6C + MHCII - ) (CD11b + Ly6G - Ly6C - MHCII + F4/80 + ) n=3/3
Összefoglalás A Retinoid X Receptor csökkenti egy metasztázist elősegítő géncsoport kifejeződését a myeloid sejtekben, és gátolja a tüdőmetasztázisok kialakulását. RXR Camp Ngp Lcn2 SAA3 MMP8
Összefoglalás A Retinoid X Receptor csökkenti egy metasztázist elősegítő géncsoport kifejeződését a myeloid sejtekben, és gátolja a tüdőmetasztázisok kialakulását. A-vitamin? Bexarotene? RXR Camp Ngp Lcn2 SAA3 MMP8
Köszönetnyilvánítás Magreceptor Kutató Laboratórium ÁOK BMBI, Debrecen Prof. Nagy László Czimmerer Zsolt Pap Attila Dr. Dániel Bence Szalka Beáta Andreas Patsalos Dr. Varga Tamás és minden további munkatárs. Sanford-Burnham Medical Institute at Lake Nona Orlando, FL, USA John Shelley (Histology Core Facility) Matthew Peloquin Dr. Masanobu Komatsu Vrije Universiteit Brussel, Lab of Myeloid Cell Immunology Brüsszel, Belgium Prof. Jo Van Ginderachter Jiri Keirsse Qods Lahmar Dr. Damya Laoui
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET! A bemutatott eredményekhez való saját hozzájárulás: microarray adatok elemzése GeneSpring 12.6 programmal útvonal analízis Ingenuity IPA alkalmazással RNS tisztítás tüdőkből primertervezés RT-qPCR futtatás, elemzés primer tumor és metasztázis egérkísérletek (LLC, B16-F10) tüdők perfúziója, fixálása H&E festett metszetek számítógépes morfometriája Leica Aperio ImageScope programmal tüdők immunsejtösszetételének vizsgálata FACS Aria III áramlási citométerrel
Lys-M-Cre RXRα fl/fl RXRβ-/- egér Lysozyme promóter! Cre rekombináz! loxp hely! RXRα! loxp hely! Cre Lysozyme-expresszáló sejtek (monocita, makrofág, neutrofil granulocita) egyéb sejtek 23
Tüdők myeloid sejt összetételének áramlási citométeres analízise Neutrofil granulociták Monociták Makrofágok