NITROGÉN-MONOXID METABOLITOK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMÁBAN OXIDATÍV STRESSZEL JÁRÓ KÓRÁLLAPOTOKBAN Dr. Bálint Beatrix Témavezető: Dr. Horváth Ildikó Egyetemi doktori (PhD) értekezés Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Budapest 2001
Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK 3 1. BEVEZETÉS 5 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 8 2.1. Nitrogén-monoxid (NO) 8 2.2. Kilégzett levegő kondenzálása 17 2.3. NO metabolitok a légutak gyulladásos betegségeiben 20 2.4. FENO és NO metabolitok cystás fibrosisban (CF) 22 2.5. FENO és NO metabolitok habituális dohányosokban 25 3. CÉLKITŰZÉSEK 28 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 29 4.1. Vizsgált csoportok 29 4.1.1.Cystás fibrosisban szenvedő betegcsoport 29 4.1.2.Egészséges, habituális dohányzók és nemdohányzók 30 4.3. Kilégzett NO mérés 32 4.4. Kilégzett CO mérés 32 4.5. Kilégzett levegő kondenzátum gyűjtése 32 4.6. Kilégzett levegő kondenzátumának kémia analízise 33 4.6.1. Nitrit, nitrit + nitrát mérése 33 4.6.2. Nitrotirozin mérés 33 4.7. Statisztikai analízis 34 5. EREDMÉNYEK 35 5.1. FENO és NO metabolitok CF-s betegcsoportban 35 5.1.1. FENO 35 5.1.2. Nitrotirozin a kilégzett levegő kondenzátumban 36 5.1.3. Nitrit és nitrit + nitrát a kilégzett levegő kondenzátumban 39 5.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok egészséges habituális dohányosokban 39 5.2.1. Alap FENO, kilégzett CO és NO metabolitok 39 5.2.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok cigaretta expozíciót követően 41 6. MEGBESZÉLÉS 43 6.1. NO metabolitok CF-ben 43 6.2 NO metabolitok dohányzás esetén 48 7. KÖVETKEZTETÉSEK 52 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 53 9. IRODALOMJEGYZÉK 54 10. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 63 10.1. Közlemények 63 10.2. Könyvfejzetek 63 10.3. Előadáskivonatok 63 10.4. A disszertációban fel nem használt közlemények 64 10.5. A disszertációban fel nem használt előadáskivonatok 64 11.A. ÖSSZEFOGLALÓ 66 11.B. SUMMARY 67 2
RÖVIDÍTÉSEK BAL Ca camp CF CFTR Cl cnos CO COPD DAN DLCO DNS enos EPO EIA FENO FEV 1 FVC IL inos LPS LTB MPO Na nnos NO NOS PG PMN Bronchoalveolaris lavage Kálcium Ciklikus adenozin-monofoszfát Cystás fibrosis, mucoviscidosis Cysticus fibrosis transmembran conductans regulátor Klór Konstitutív nitrogén-monoxid szintáz enzim Szén-monoxid Krónikus obstructív bronchitis Diaminonaftalén Diffúziós kapacitás Dezoxiribonukleinsav Endotheliális nitrogén-mnoxid szintáz enzim Eosinophil peroxidáz Enzim-immun assay Kilégzett levegő nitrogén-monoxid koncentráció Forszírozott kilégzési másodperctérfogat Vitálkapacitás Interleukin Indukálható nitrogén-monoxid szintáz enzim Lipopolysacharidok Leukotrién Mieloperoxidáz Nátrium Neuronális nitrogén-monoxid szintáz enzim Nitrogén-monoxid Nitrogén-monoxid szintáz enzim Prosztaglandin Polymorphonuclealis granulocyta 3
ppb ppm RV SOD TLC TNF Részecske per billió Részecske per millió Reziduális volumen Szuperoxid-dizmutáz Totálkapacitás Tumornecrosis faktor 4
1. BEVEZETÉS A tüdőgyógyászat egyik fontos betegségcsoportja a légutak különböző eredetű krónikus gyulladással járó elváltozásai. Ide tartozik az asztma, krónikus obstruktív bronchitis (COPD), cystás fibrosis, azaz mucoviscidosis (CF) és bronchiectasia. Ezek a betegségek mind pathomechanizmusukban mind tüneteikben nagyon különböznek. Maga a gyulladás jellege is eltérő, melyet elsősorban invazív úton nyert biológiai mintákból tudunk megállapítani (biopszia, indukált köpet, hörgőmosófolyadék). Példának okául COPD esetén a gyulladás kezdetben a kis bronchusok és bronchiolusok szintjén alakul ki, majd fokozatosan terjed a tüdőparenchymára. Itt elsősorban makrofágok, T limfociták és polymorphonuclealis granulociták (PMN) felszaporodása jellemző. Ezzel ellentétben asztma esetén a gyulladásos sejtes infiltrációban az eosinofil leukociták és hízósejtek dominenciája észlelhető. Ugyanakkor CF-s betegek légútjaiban a gyakori bakteriális exacerbáció, csaknem állandó bakteriális kolonizáció a PMN-k túlsúlyát okozza. E patológiai különbségeknek természetesen kórélettani és ebből következően terápiás következményei is vannak. A gyulladás folyamata a szervezetben különböző funkciójú immunológiai védekező rendszerek indukciójával jár együtt. Ezek egyike a nitrogén-monoxid (NO) képződésében résztvevő enzim, a nitrogén-monoxid szintáz (NOS) aktivációja. A NOSnak 3 izomere ismert, melyek közül gyulladásos folyamatok esetén az indukálható NOS-nak (inos) van a legnagyobb jelentősége. Az inos képződés különböző légúti sejtekben gyulladást okozó baktériumok, lipopolysacharidok (LPS), és citokinek expozíciójának hatására jön létre (1, 2). NOS indukcióját követően a sejtekben L- argininból L-citrullin keletkezik, miközben NO szabadul fel (3). A hörgőrendszerben így képződött NO a kilégzett levegőben detektálható (4). Különböző kóros és nem kóros állapotokban eltérő koncentrációjú NO mutatható ki a kilégzett levegőben (5). Általában véve jellemző, hogy a gyulladásos eredetű kórállapotokban a kilégzett NO (FENO) szintje emelkedik. Így asztma esetén (6, 7), COPD akut exacerbációjában (8), bronchiectasiában (9), légúti infekció kapcsán egyaránt magasabb FENO értékeket mérhetünk (10). Munkánkban két csoportot tanulmányoztunk, melyek közös tulajdonsága, hogy oxidatív stressz fennállása ellenére az FENO koncentráció csökken. CF-ben az oxidatív
stressz az állandó gyulladás miatt a légutakon belül képződő oxidatív hatású anyagok miatt jön létre, míg rendszeres dohányzás esetén oxidatív hatású molekulák exogén úton a dohányfüst belégzése által jutnak a szervezetbe. CF a külső elválasztású mirigyek veleszületett működési zavara, melynek következtében az emésztőszervi és légúti váladék besűrűsödik. Az exokrin mirigyek besűrűsödött váladéka eltömeszeli a légutakat, ami kedvez az infekciók kialakulásának. Ebben a betegségben a légutak intenzív gyulladása ellenére, meglepő módon az FENO szintje nem nő, hanem csökken (11-15). A jelenség magyarázatát keresve két lehetőség merül fel. Egyrészt ismert tény, hogy a CF-s légúti epitheliás sejtek inos expressziója csökken, melynek megfelelően arányosan kevesebb NO tud képződni (16, 17). Másrészt, az okok között - feltételezhetően - az NO légutakban zajló fokozott metabolizmusa (oxidációja) is szerepel. Gyulladás jöhet létre a légutakban külső károsító tényezők provokáló hatására is. Ilyen exogén noxának tekinthető a dohányzás is. Az FENO-t illetően hasonló, paradox helyzetet tapasztalhatunk habituális dohányosokban, mint CF-ben, ahol a várttól eltérően az FENO szignifikáns csökkenését észlelték egészséges nem dohányzó egyének adataival összehasonlítva (17, 18). Ennek oka egyelőre még nem teljesen tisztázott. Cigaretta elszívását követően oxidáns hatású vegyületek sora (NO, superoxid, peroxinitrit) kerül a légutakba (19), ugyanakkor a habituális dohányzás légúti gyulladásos sejtek (PMN-k, makrofágok) felszaporodását is kiváltja. Az ezekből felszabaduló oxidáns hatású szabadgyökök az NO oxidációját okozhatják (21, 22). Továbbá a cigaretta füstből a szervezetbe kerülő NO feed-back mechanizmus útján gátolhatja az endogén NO képződését (23). Az NO igen reaktív molekula, gyorsan kötődik szabadgyökökhöz, például superoxidhoz, melynek következtében különböző oxidációs számú NO metabolitok jöhetnek létre (24, 25). Az NO oxidációs végtermékei a nitrit és a nitrát. Légúti váladékok nitrit és nitrát tartalmának mennyiségi meghatározásával adatokat nyerhetünk az NO tüdőn belüli anyagcseréjére vonatkozólag. NO metabolitokat mérhetünk köpetben (26), hörgőmosófolyadékban (BAL) (27) és a kilégzett levegő kondenzátumában (12). Míg a köpet indukció és a BAL egyaránt az invazív vizsgálatok körébe tartoznak, melyek ismétlési száma egy-egy személyben 6
bizonyos időtartamon belül korlátozott, továbbá e mintavételi eljárások - invazivitásuknál fogva - önmagukban is befolyásolhatják a minta kémiai összetételét, addig a kilégzett levegő kondenzátum gyűjtése teljességgel non-invazív, tetszőleges gyakorisággal megismételhető, és a benne kimutatható különböző kémiai anyagok jól reflektálnak a légúti epithelialis folyadék összetételével (28, 29). A kilégzett levegő kondenzálása napjainkban kifejlesztett új, egyszerű módszer, melynek technikai alapja, hogy a kilégzés alatt a légutakból kijutó levegő bekerül a kondenzáló eszközbe, mely jéggel, vagy fagyasztó rendszer segítségével biztosítja annak azonnali hűtését. Az így nyert kondenzátum alkalmas kémiai analízisre. Számtalan anyag kimutatható a kondenzátumban: NO metabolitok, lipidperoxidációs termékek, citokinek, leukotrienek, prostaglandinok stb. Tanulmányunk célkitűzése az volt, hogy a kilégzett levegő kondenzátumában levő NO anyagcseretermékek analizálásával választ kapjunk arra a kérdésre, hogy a fent említett kórállapotokban a várttól eltérően miért csökken az FENO. Magyarázható-e a CF-ben illetve habitualis dohányosokban tapasztalható csökkent FENO az NO oxidatív stressz hatására létrejövő fokozott oxidációjával, azaz NO metabolitokká való átalakulásával? 7
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Nitrogén-monoxid (NO) Az utóbbi 10 esztendő egyik legkedveltebb kutatási témája a "Janus arcú" NO molekula. Az orvostudomány csaknem valamennyi ága foglalkozik ezzel a biomolekulával, mely az élettani folyamatok regulációjában, a szervezet védekező mechanizmusában és patológiai folyamataiban egyaránt szerepet játszik. Jelentőségét és a rendkívüli érdeklődést mutatja, hogy az irodalomban 43121 NO-val foglalkozó publikáció található (Medline 1990-2001). Természetesen a pulmonológia is komoly részt vállalt az NO körüli kutatásokban, számtalan tanulmánnyal hozzájárulva az NO tüdőben betöltött szerepének tisztázásához, különböző kórállapotokban való jelentőségének megvilágításához. Az NO tüdőgyógyászati vonatkozásait taglaló első cikkek 1990-es évek elején jelentek meg, és a korai felfedezések közül az egyik legjelentősebb az volt, hogy az NO detektálható egészséges és beteg emberek kilégzett levegőjében (7, 4). A tudósok ezzel utat nyitottak a további NO-val kapcsolatos széles körű klinikai kutatások számára azáltal, hogy kidolgozták a kilégzett NO mérésének egyszerű, non-invazív módszerét. Ezt követően tanulmányok sora foglalkozott azzal, hogy megállapítsa a különböző kóros és nem kóros állapotokban az FENO koncentrációját, annak viszonyát egészséges egyének hasonló adataihoz, így feltérképezve az NO biológiai, kémiai és patológiai összefüggéseit a tüdőben. Az NO gázhalmazállapotú mediátor, mely számos fiziológiai és patofiziológiai folyamat szabályozásában játszik szerepet (1). Ezek közé tartoznak az értónus regulációja, neurotranszmisszió, védekező- és sejtpusztító mechanizmusok (2). Az NO az emberi szervezet különböző sejtjeiben endogén enzimatikus úton képződik, a NOS enzim közreműködésével. Az enzim az L-arginint L-citrullinná alakítja, miközben NO szabadul fel (3). A felszabaduló NO az L-arginin terminális guanidino csoportjából származik (3). A reakcióban molekuláris oxigén és NADPH coszubsztrátként szerepelnek, mialatt a tetrahydrobiopterin (30), flavin nucleotidok és thiolok co-faktorként szolgálnak (31). N G -hydroxy-l-arginin, mint rövid életű köztitermék jön létre, míg az L-citrullin a melléktermék (3). A képződött L-citrullin ammónia beépülésével L-argininná alakul vissza, ami az L-arginin raktárak folyamatos
- biztosításának egyik fontos lépése lehet (32). (1. ábra: NO és O 2 légutakban) képződése a Nitrogén-monoxid (NO) és superoxid anion (O 2 - ) képződése a légutakban Epithelium N O N O N O inos inos inos 1. ábra. O 2 - N O O 2 - H 2 O 2 inos Erek Gyulladás kapcsán aktivizálódó sejtek 1. ábra 9
Az NO képződésében szerepet játszó enzimnek, a NOS-nak 3 fő izomere azonosítható. Az nnos (NOS1: neuronból felszabaduló NOS) és az enos (NOS3: endothelből felszabaduló NOS) konstitutívan expremálódnak, míg az inos (NOS2: indukálható NOS) indukálható úton termelődik különböző sejtekben (PMN-k, makrofágok, epitheliális sejtek) gyulladást okozó baktérium, LPS és citokin expozíciót követően (3). Az enos és nnos (konstitutivan felszabaduló NOS izoformok) aktivizálódása a sejtek citoplazmájának Ca 2+ /kalmodulin tartalmától függ és rövid időtartamra, kis mennyiségű NO képződését okozza. Ezzel ellentétben az inos - melynek aktivitása a Ca 2+ /kalmodulin rendszertől független - hosszú időtartamú, nagy mennyiségű NO felszabadulását generálja (3). Az NO felezési ideje in vivo körülmények között mindössze néhány másodperc (1, 2, 33). Ez azonban nem tekinthető állandó értéknek, mivel a felezési idő fordítottan arányos az NO koncentrációjával, így sokkal hosszabbá válik, ha az NO koncentrációja csökken (34). Az NO molekulában hét elektron a nitrogénből, nyolc pedig az oxigénből származik. Az NO párosítatlan elektronja miatt könnyen interakcióba lép olyan molekulákkal amelyek szintén tartalmaznak párosítatlan elektront. Ilyenek a szabad gyökök (pl. superoxid) és a metál ionok, mint a hem vas ionja. (24, 34). Figyelembe véve a reakciók sebességét az NO in vivo biokémiája három fő útra egyszerűsíthető le: 1 guanilátcikláz enzimhez kötődve, azt aktiválja 2 bekerülve a vörösvértestbe kötődik az oxihemoglobinhoz, majd átalakulhat methemoglobinná és nitráttá 3 superoxiddal reakcióba lépve peroxinitritté transzformálódhat (34). Az NO oxidációja vagy más biomolekulákkal való reakciója a mikrokörnyezet kémiai tulajdonságaitól függenek. Oxidatív metabolizmusa kapcsán reaktív nitrogén köztestermékek keletkeznek, melyekben a nitrogén oxidációs száma 1-5-ig terjedhet. Oxidatív anyagcseréjének végtermékei a nitrit és a nitrát (34). (2. ábra: NO oxidatív metabolitjai) 10
NO oxidatív metabolitjai Kémiai képlet Név Nitrogén atom oxidációs száma NO - Nitroxil anion + 1 N 2 O Nitros-oxid + 1 NO Nitrogén-monoxid (nitrogén-oxid) + 2 NO + Nitrozil kation + 3 NO 2 - Nitrit + 3 N 2 O 3 Dinitrogén-trioxid + 3 NO 2 Nitrogén-dioxid + 4 N 2 O 4 Dinitrogén-tetraoxid + 4 ONOO - Peroxinitrit + 5 NO 2 + NO 3 - Nitril (nitronium) kation + 5 Nitrát + 5 2. ábra 11
Az NO reakciója superoxiddal (O - 2 ) - csaknem diffuzió-limitált sebességgel - peroxinitritet (ONOO - ) eredményez (24, 25). A ONOO - tiol-tartalmú biomolekulában, mint a cisztein és a glutation S-nitrozotiol formájában képes raktározódni, de tovább is - oxidálódhat nitritté vagy nitráttá. Normál körülmények között az intracelluláris O 2 koncentráció nagyon alacsony (< 10 pm) és a ONOO - kialakulását az eukariota sejtek nagy superoxiddizmutáz (SOD) (4-10 µm) tartalma gátolja. Gyulladásos sejtek (PMN - és eosinophil granulocyták, macrophagok) aktivációja által jelentős mennyiségű O 2 termelődik, ugyanakkor az NO szintézis is fokozódik (inos indukció). Az ekkor képződő mikromoláris nagyságrendű NO már hatásosan versenghet a szuperoxiddizmutázzal (SOD) a O 2 -ért, hogy ONOO - -t képezzen. Továbbá a ONOO - nagy - reaktivitása miatt anitoxidáns rendszerek jelenlétében is képes elérni biológia célpontját (35). ONOO - képződés mutatható ki humán PMN sejtekben (36), patkány alveoláris macrophagjaiban (37) és szarvasmarha aorta endothel sejtjeiben is (38). A peroxinitritnek potens oxidáló és nitráló hatása van, képes elindítani a biológiai membránok lipid peroxidációját, hidroxilációját, az aromás aminosavak nitrálását és a proteinek sulfhidril oxidációját (2, 24, 25, 39-41). Ugyanakkor képes konvertálódni peroxinitrit savvá (ONOOH) miközben hidroxil gyök ( OH)-szerű aktivitással rendelkező molekulák szabadulnak fel (42). Toxicitását anionjának direkt reakciója, valamint savszerű reaktivitása (ONOOH) okozza. Állatkísérletekkel bizonyítottan légúti hiperreaktivitást indukál (43), gátolja a tüdő surfactantját (44), károsítja a tüdő epithelialis sejtjeit (39), és oxidálja a glutationt (41). Peroxinitrit fokozott termelődését tapasztalták számos olyan tüdőbetegségben, melyek krónikus gyulladással és/vagy oxidatív stresszel járnak (45, 46). Mind a peroxinitrit és a nitrogén-dioxid (NO 2 ) képesek nitrálni a fenol vegyületeket, így a tirozin és triptofán gyököt tartalmazó fehérjéket. Ennek a reakciónak kapcsán egy stabil vegyület, a 3-nitrotirozin képződik a tüdőszövetben (25, 42), mely reaktív nitrogén gyökök indikátorának tekinthető (25, 47). A fehérjék nitrálása biológiai folyamat, mely az NO és az NO-ból származó szekunder bomlástermékek reaktív oxigéngyökökkel való interakciója következtében jön létre (25, 47). Különböző körülmények között többféle kémiai úton jöhet létre a tirozin gyök nitrálódása, feltételezhetően nem mindegyik kémiai átalakulás releváns in vivo körülmények között (48). Nitrotirozin képződésének lehetőségei tehát egyrészt a 12
peroxinitrit út, másrészt - főként krónikus gyulladás esetén - a mieloperoxidáz (MPO) - dependens út, mely szintén hozzájárulhat a 3-nitrotirozin képződéséhez. A PMN leukocitákból felszabaduló MPO a nitritet gyulladásos oxidánsokká képes konvertálni. Valószínű, hogy hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) jelenlétében a nitritből (az NO fő végtermékéből) nitráló hatású köztestermék jön létre, mely szintén képes a tirozin gyök nitrálására (48). (3/A, 3/B ábra: Nitrotirozin képződés) Nitrotirozin képződés Tirozin NO 2 Nitrogén-dioxid 3-nitrotirozin H 2 O 2 / EPO, MPO HOCl / MPO ONOO - - NO 2 Peroxinitrit Nitrit 3/A ábra MPO: myeloperoxidáz, EPO: eozinofil peroxidáz. 13
Nitrotirozin képződés mechanizmusa a légutakban Epithelium Gyulladásos sejtek 3/B ábra 14
Az NO különböző oxidációs termékei különböző biológiai folyamatokban vesznek részt. A reaktív nitrogén gyökök többsége reakcióba léphet különböző biomolekulákkal, úgymint metál ionok a metalloproteinekben, aminosavak (tiol, amin, tirozin), nem szaturált lipidek, dezoxiribonukleinsav (DNS). Ezek az interakciók tehetők felelőssé a fokozott NO termelődéssel járó pathofiziológiai következményekért. A reaktív NO köztestermékek fő citotoxikus hatásai azon alapulnak, hogy többféle módon képesek az eukariota gének expresszióját gátolni (49). Az NO anyagcsere biológiai végtermékei a nitrit (NO - 2 ) és a nitrát (NO - 3 ), melyek gyorsan szétterjednek a szervezetben és kiválasztódnak a vizelettel (50). Az NO-val kapcsolatos biokémiai változások ismerete a későbbiekben lehetőséget teremthet megfelelő terápiás intervenciókhoz is. A tüdőben képződött NO a felső légutakat elérve a kilégzett levegőben kimutatható. Mérése ma már rutinszerűen történik megfelelő technikai eszközök birtokában. NO mérőműszerek általában kemilumineszcens módszeren alapulva detektálják az FENO koncentrációját, mely egészséges egyéneknél 3-9 részecske per billió (ppb) között változik (5, 51). Számos kórképben az FENO eltér egészséges egyének adataihoz viszonyítva, mely megkönnyítheti a diagnózis felállítását, segíthet a betegség súlyossági fokának megítélésében, a terápia beállításában és annak nyomon követésében. A betegségeken kívül, különböző élettani változások, exogén noxák, táplálkozási szokások, hormonális hatások is befolyásolják az FENO mennyiségét (5). (4 ábra: FENO különböző állapotok, betegségek esetén). 15
Kilégzett NO különböző állapotok, betegségek esetén Állapotok Allergén-, pollen expozíció Levegő szennyeződés Foglalkozási expozíció (ózon) Arginin, nirit, nitrát gazdag étrend Kilégzett NO Betegségek Asztma Instabil, súlyos COPD Rhinitis allergica Felső légúti infekció Influenza vakcináció Bronchiectasia Colitis ulcerosa Tbc Aktív sarcoidosis Tüdő carcinoma Állapotok Menstruáció Dohányzás Akut alkohol abuzus Szájöb lítés Kilégzett NO Betegségek CF 4. ábra (Kharitonov S A, et al. Eur Respir J 200; 16: 781-792) Krónikus köhögés (nem asztmás) Pulmonalis hypertonia Kartagener syndroma Primer ciliaris dyskinesis 16
A tüdő akut és krónikus gyulladásos betegségei kapcsán általában fokozott NO képződés tapasztalható, így asztma, rhinitis allergica, instabil COPD, felső légúti infekció, bronchiectasia, tbc egyaránt emelkedett FENO-val járnak (5). Ennek feltételezhetően az az oka, hogy a gyulladás kapcsán felszabaduló mediátorok hatására fokozott inos expresszió jön létre, melynek következtében több NO képződik. A magasabb NO koncentrációnak kettős hatása van a légutakra. Egyrészt lehet protektív az oxidánsok által provokált cytotoxikus reakciók kivédésében és antimikróbás hatásában, másrészt lehet káros a sejtfunkciókra, reaktív NO metabolitok kialakulásán keresztül (34, 53, 24). Az NO fokozott képződése az FENO szignifikáns emelkedésével mérhető (6, 9). Asztma betegségben antiflogisztikus gyógyszerek (pl. glucocorticosteroid) a fokozott NO képződést csökkentik, mely az FENO mérséklődésében nyilvánul meg (6). Az FENO koncentráció változásának detektálása különböző kórállapotokban arra is lehetőséget ad, hogy a tüdőben zajló pathologiai, fiziológiai folyamatokat felderítsük és azok következményeit megítéljük. Ehhez szorosan kapcsolódva indultak meg a kutatások az NO tüdőben zajló metabolizmusát megvilágítandó, az NO metabolitok in vivo szerepének megismerésére. NO anyagcseretermékek egyaránt kimutathatók a tüdő epitheliális folyadékában, BAL folyadékban és indukált köpetben. 2.2. Kilégzett levegő kondenzálása Az utóbbi évek új metodikája a légutakban képződő kémiai anyagok (markerek, mediátorok) feltérképezésére a kilégzett levegő kondenzátumának gyűjtése, a felfogott anyag kémiai analízise. A módszer azon a hipotézisen alapul, hogy a kilégzett levegőben levő részecskék szoros korrelációval jelzik a légúti extracellularis folyadék összetételét. Az epitheliális folyadékban antioxidánsok, szolubilis markerek, különböző molekulák találhatók, melyek mint első védelmi vonal jelzik a külső oxidáns hatások, (dohányzás, ózonexpozíció, nitrogén-oxidok), allergének, mikróbák és baktériumok káros hatásait. Ezek az anyagok képet adhatnak a tüdőt érintő oxidatív noxák, gyulladások által létrejött változásokról, ugyanakkor alkalmasak lehetnek a terápia hatásosságának megítélésére, sőt a betegség monitorozására is. 17
Az első publikációk a 80-as években jelentek meg a kilégzett levegő kondenzátumában kimutatható surfactantról és lipidperoxidációs termékekről (53). Újabban többféle citokint, interleukint (IL-1b, IL-2b, IL-6) tumor necrosis faktort (TNF), izoprosztánt (8-izoprosztán) és prosztaglandint (PG) mértek egészséges egyénekben valamint asztmás, COPD-s, CF-s és interstitialis tüdőbetegségben szenvedő egyénekben. (54-58). (5. ábra: Kilégzett levegő kondenzátumában kimutatott anyagok) Kilégzett levegő kondenzátumában kimutatott anyagok 1. Nitrogén-oxid metabolitok a. Nitrit (12, 62) b. Nitrát (63) c. S-nitrozotiol (75) d. Nitrotirozin (55) 2. Hidrogén-peroxid (54) 3. Lipidperoxidációs termékek: tiobarbiturátsav (84, 85) 4. Vazoaktív aminok: szerotonin, hisztamin (56) 5. Eicosanoidok a. Izoprosztán: 8-izoprosztán (57, 94) b. Leukotriének: LTB4, LTC4, LTE4, LTD4 (55) c. Prosztaglandinok: PGE2, PGF (58) 6. Citokinek: IL-8, Il-1β, IL-6 (63) 7. Hidrogén ion: ph (85) 5. ábra (A zárójelben levő számok az irodalomjegyzékben felsorolt referenciákra vonatkoznak.) 18
Potenciálisan, a kondenzátumban levő anyagok különböző markerekre és molekulákra utalhatnak, melyek eredhetnek a szájból (szájüreg, oropharynx), a tracheobronchialis rendszerből és az alveolusokból egyaránt. Hogy honnan, milyen arányból származnak ezek, még nincs teljesen tisztázva. Valószínű, hogy a nem gáz halmazállapotú komponensek, a véráram által a tüdőbe került anyagok - légúti sejtek által - metabolizált termékei (28). A kilégzett levegő kondenzátum gyűjtésének többféle technikai útja lehetséges. A legegyszerűbb módszer az, amikor a vizsgálati alany egy szájrészbe lélegzik, mely egy egyirányú (visszaáramlást gátló) szeleppel van ellátva. A szelep lehetővé teszi, hogy a ki- és belégzett levegő szeparálódjon. Kilégzés alatt a kilégzett levegő bekerül a kondenzáló eszközbe, mely jéggel, vagy fagyasztó rendszer segítségével biztosítja a kilégzett levegő azonnali hűtését. Az alacsony hőmérséklet igen fontos tényező, mivel vizsgálandó anyagok nagy része hő hatására kémia átalakuláson mehet keresztül, mely meghamisíthatja a vizsgálati eredményt. Általában 10-15 perc alatt 1-3 ml kondenzátum gyűjthető össze. Potenciálisan a nyál kontamináció befolyásolhatja a kondenzátum kémia összetételét. Ezt elkerülendő, meghatározhatjuk a kodenzátum amiláz tartalmát és ennek ismeretében kizárhatjuk a mérésekből a további vizsgálatra alkalmatlan (szignifikáns mennyiségű amilázt tartalmazó) mintákat. Ismert, például az eicosanoidok nagy mennyisége a nyálban asztmás roham esetén, a nitrit és nitrát mennyiségének emelkedése nitrit gazdag diétát követően (29). Mindezen tényezők természetesen megváltoztathatják a kilégzett levegő kondenzátum kémiai összetételét (28, 29). A kilégzett levegő kondenzátumának mennyisége független a percventillációtól, a kilégzett levegő hőmérsékletétől és páratartamától (59). (6. ábra: Kilégzett levegő kondenzálása: a készülék működési elve) 19
Normál Mintagyűjtő tartály (-20 C 0 ) Szobalevegő 2 4 ml kondenzátum / 5-10 perc 6. ábra Kilégzett levegő kondenzálása: a készülék működési elve 2.3. NO metabolitok a légutak gyulladásos betegségeiben Az NO metabolitok némelyike, pl. nitrit, nitrát kimutathatók az egészséges tüdő légúti epitheliális folyadékában (60), BAL folyadékban (27, 61), indukált köpetben (26, 62) és a kilégzett levegő kondenzátumában (12, 63, 64). Mennyiségükből, egymáshoz és az FENO-hoz viszonyított arányukból következtethetünk az NO tüdőn belüli anyagcseréjére, oxidatív hatású anyagok jelenlétére, koncentrációjára, ezek biokémiai hatásaira. A nitrit, nitrát, S-nitrozotiol és nitrotirozin közötti egyensúly az epitheliális folyadékban a kilégzett levegő kondenzátumának kémiai összetételét is befolyásolja. Ily módon a kondenzátum analízisének segítségével képet kaphatunk az NO termelődés gyorsan bekövetkező, illetve hosszabb távú változásairól. Többféle módszer ismert a nitrit, nitrát, nitrozotiol mennyiségi meghatározására, úgymint immunassay, fluorometriás, kolorimetriás és elektrokémiai módszerek (65-68). 20
Asztma akut exacerbációja kapcsán mind a köpetben (69), mind a kilégzett levegő kondenzátumában (64) magas nitrit koncentrációt találtak, melyből arra lehet következtetni, hogy az exacerbáció kapcsán a gyulladásos sejtekből felszabaduló oxidáns hatású molekulák lehetőséget teremtenek az NO fokozott oxidációjára. E megfigyelés akár az asztma exacerbáció házi monitorozására is felhasználható (64). Asztmás betegek légúti epitheliuma és gyulladásos sejtjei erős nitrotirozin immunreaktivitást mutatnak, jelezve a reaktív nitrogén gyökök részvételét a kóros folyamatban (48). Enyhe fokú, szteroiddal nem kezelt asztma esetén a kilégzett levegő kondenzátumában is kimutatható a nitrotirozin koncentráció emelkedése (55), míg súlyos, szteroiddal kezelt asztmásokban pedig az egészségeseknél magasabb, de az előző asztmás csoport adataihoz képest relatíve csökkent mennyiségű nitrotirozin detektálható a kondenzátumban (55). Mivel a kondenzátum magas nitrotirozin tartalma középsúlyos asztmában - szteroid terápia visszavonását követően - az asztmás tünetek súlyosbodásával és a légzésfunkciós adatok rosszabbodásával korrelál, valószínű, hogy a nitrotirozin koncentráció emelkedése (melyet a szteroid kezelés csökkent) nemcsak az asztma exacerbáció előrejelző faktora, hanem kulcsszerepet játszik az asztma pathomechanizmusában is (29). S-nitrozotiol mennyiségi csökkenése mutatható ki légzési elégtelenségben szenvedő asztmás gyerekek tracheájának epitheliális folyadékában (70). Ez arra utal, hogy az S-nitrozotiol, mint endogén hörgtágító mérsékelheti az asztmában tapasztalható bronchospazmust. Enyhe asztmában a kilégzett levegő kondenzátumának S-nitrozotiol tartalma nagy dózisú inhalatív szteroid hatására csökken (71). Ugyanakkor a kilégzett levegő kondenzátumának nitrit + nitrát mennyisége gyorsan és dózistól függően mérséklődik - szteroid kezelés hatására - ugyanezen betegcsoportban. Ezen adatok arra utalnak, hogy a nitrit + nitrát koncentrációjának változása érzékenyebben jelzi a gyulladásellenes terápia hatását, mint a nitrozotiol mennyisége. COPD. Nitrotirozin képződés fokozódik COPD esetén. Mennyisége negatívan korrelál a FEV 1 -el, jelezve, hogy súlyosabb állapotban a légutakban képződött NO felhasználódik - a gyulladásos sejtekból felszabadult - superoxid anionnal való reakció és/vagy peroxidáz-dependens mechanizmus által (72). 21
Sarcoidosis. BAL folyadék nitrit + nitrát koncentrációja emelkedett aktív tüdő sarcoidosis esetén, utalva az NO fokozott oxidatív metabolizmusára a kórkép aktivitása idején (61). 2.4. FENO és NO metabolitok cystás fibrosisban (CF) Mucoviscidosis, azaz cystás fibrosis (CF) az europid népesség leggyakoribb letális, örökletes anyagcserebetegsége. A kórképet magyar és német nyelvterületen mucoviscidosisnak, az angolszászok cystás fibrosisnak nevezik. Ma már felnőttkorban is találkozunk ezzel a kórformával, mivel a korán elkezdett terápia mellett a betegek megélhetik a felnőttkort. A kórkép előfordulási gyakorisága Európában 1:2000, hazai felmérések szerint Magyaroroszágon 1:4000 (73). A genetikai vizsgálatok szerint a betegség autoszomális, recesszív módon öröklődik, kialakulásáért a cysticus fibrosis transmembran conductans regulátor (CFTR) gén mutációja felelős. Ez a kóros gén a betegek 70 %-ban a deltaf508 gén, amely kódolja a CFTR fehérjét és azonos a ciklikus adenozin-monofoszfát (camp) által regulált kloridcsatornával (73). A külső elválasztású mirigyek működési zavarának következményeként a termelt váladék jelentősen besűrűsödik. A betegség biokémiai alapja az epitheliális sejtek apikális membránján keresztül történő kloridtranszport zavara. Az exokrin mirigyek működészavara következtében csökken a mirigyváladék víztartalma, kórosan megemelkedik a nátrium (Na) és klór (Cl) tartalma, így az exkrétumok sűrűvé és tapadóssá válnak. A besűrűsödött váladék eltömeszeli a kivezetőcsöveket amiből a különböző szervi megbetegedések adódnak. Felnőttkorban leggyakrabban légzőszervi manifesztációk figyelhetők meg. Károsodik a mukociliáris transzportfunkció, az elzáródott légutak mögött atelektáziás tüdőrészek alakulnak ki. A beteg dyspnoéssé válik, majd cyanotikussá. A légutakban pangó váladék elősegíti a lokális fertőzések kialakulását. A légúti hám károsodása, a peribronchialis fibrosis és a bronchusfal elvékonyodása következtében pedig bronchiectasia jöhet létre. A légutakban kezdeti stádiumban leggyakrabban Staphylococcus aureus és Haemophilus influenzae, később pedig Pseudomonas aeruginosa megtelepedése figyelhető meg. A Pseudomonásnak létezik egy CF-re 22
specifikus nyáktermelő kolonizációja, a Pseudomonas cepacia mely kizárólag ebben a kórformában szokott előfordulni, elsősorban a végstádiumban és a tüdő gyors károsodását okozza. A kórképre jellemző krónikus endobronchialis infekció, visszatérő akut exacerbációkkal, bakteriális superinfekciókkal, tovább rontja a beteg pulmonológiai státuszát. A tüdőbetegség súlyosságának megítélése, megfelelő kezelése azért is fontos, mert a beteg életminőségét és életkilátását leginkább a tüdőmanifesztáció befolyásolja. A csaknem állandó bakteriális kolonizáció és ennek következményeként létrejövő masszív PMS akkumuláció, fokozott oxidatív stresszt jelentenek a légutakban. Ismert tény, hogy CF esetén az FENO szintje csökken hasonló korú egészséges egyének adataihoz viszonyítva (11-15). Ez egyaránt megfigyelhető újszülött, gyermek és felnőttkorú CF-s betegekben (11-14). Az FENO koncentráció csökkenését nem befolyásolja a genotípus - vagyis hogy a beteg deltaf508 homozygota, vagy heterozygota -, és nem különbözik szteroiddal kezelt és nem kezelt betegcsoportban (15). Továbbá akut exacerbáció esetén, amikor a gyulladás fokozódása következtében nagy mennyiségben gyulladásos mediátorok szabadulnak fel - melyek inos expressziót indukálnak - sem emelkedik az FENO (13). Ezen adatok alapján levonhatjuk azt a következtetést, hogy az asztmában a gyulladás nyomon követésére, a terápia hatásosságának megítélésére oly jól hasznosítható FENO mérés CF-ben nem ad lehetőséget a gyulladás markerezésére. Joggal merül fel a kérdés, hogy a perzisztáló gyulladás, csaknem állandó bakteriális kolonizáció ellenére miért csökken az FENO ebben a betegcsoportban. Egyrészt kimutatható a CF-s epitheliális sejtek csökkent inos expressziója, melynek következtében gyulladásos mediátorok felszabadulását követően elmarad az NO képződés várt emelkedése (16, 17). Másrészt, valószínű az NO fokozott metabolizmusának lehetősége is, melynek következtében az NO átalakulva NO metabolittá, úgymond "felhasználódik" a kémiai reakciók során. Az, hogy a légúti epitheliális sejtek csökkent NO képződésén kívül, milyen szerepe van az NO fokozott anyagcseréjének, nevezetesen az NO oxidációs átalakulásának még nem teljességgel tisztázott. Továbbá nyitott kérdés, hogy az alacsony légúti NO koncentrációnak milyen 23
hatásaa van a légutak kórokozókkal szembeni csökkent ellenállóképességét és a tüdő funkcionális és organikus károsodását illetően. A kérdést megválaszolandó, különböző légúti váladékok NO metabolitjait széles körben vizsgálják. Az NO metabolitok koncentrációját CF-ben számtalan faktor befolyásolhatja. Ezek: a gyulladás súlyosságának foka, a gyógyszeres kezelés, a légúti váladék gyűjtésének módja és az NO metabolitok detektálási technikája. Valószínűleg ez az oka az irodalomban ismertetett némiképp ellentmondásos adatoknak. Köpet nitrát koncentrációja emelkedett stabil CF-s betegekben egészséges egyének trachea váladékához viszonyítva. A betegek nyálában levő nitrát mennyisége szintén magasabb, mint a kontrollcsoport adatai (62). Sem a nyál, sem a köpet nitrit + nitrát mennyisége nem különbözik stabil állapotú és exacerbációban szenvedő betegekben (62). Más megfigyelések szerint a CF-s köpet nitrit + nitrát mennyisége szignifikánsan emelkedett CF akut exacerbációjában, stabil állapotú CF-s betegek és egészséges egyének adataihoz képest, és ez 2 hetes antibiotikus kezelést követően is emelkedett maradt (26). E szerint a köpet nitrit + nitrát koncentráció változásának mérése lehetőséget teremthet az akut infekció monitorozására is (26). Jones és munkatársai ugyanakkor azt állapították meg, hogy CF-s köpet nitrát, nitrotirozin és MPO koncentrációja emelkedett, ellenben a nitrit mennyiséggel. E megfigyelés alapján nagyobb mennyiségű endogén NO képződésre következtetnek, mint amennyi a kilégzett levegőben detektálható (74). Más tanulmány nem találta magasabbnak a CF-s köpet nitrit és nitrát mennyiségét, de itt is magasabbnak bizonyult az MPO tartalom (75). Kilégzett levegő kondenzátum nitrit szintje szignifikánsan emelkedett CF-s betegcsoportban egészséges egyének adataival összehasonlítva (12, 56). A kondenzátum nitrit koncentrációja pozitívan korrelált a szérum fehérvérsejt számmal, de nem korrelált az FENO-al és a légzésfunkciós paraméterekkel. Ez azt a hipotézist támasztja alá, hogy a gyulladásos légutakban az NO szignifikáns mennyisége oxidációs átalakuláson megy keresztül és nitritté és/vagy nitráttá alakul. NO és glutation interakciója kapcsán S-nitrozotiol jön létre, mely képes az NO káros hatásait csökkenteni. Nitrozotiol detektálható CF-s betegek kilégzett kondenzátumában (76). Kimutatták, hogy a nitrozotiol koncentráció emelkedik felnőtt, 24
súlyos állapotú CF-s betegcsoportban mind stabil periódusban mind az akut exacerbáció ideje alatt (76). 2.5. FENO és NO metabolitok habituális dohányosokban A dohányzás számos káros hatása ismert, melyek leginkább a kardiovaszkulárisés a légzőrendszert érintik. Sok információval rendelkezünk az ártó tényezők mibenlétét illetően, de a pontos mechanizmus még nem teljesen ismert. A hátrányos hatások kialakulásában a füst alkotóelemeinek az epitheliális sejtek funkciójára gyakorolt toxikus effektusa, a tüdő öntisztulási folyamatának károsodása, az alveoláris macrophagok tevékenységének csökkenése és fokozott PMN akkumuláció egyaránt szerepet játszanak. A kardiovaszkuláris betegségek magasabb rizikója a populáció e csoportjában jól ismert tény, feltételezhetően a cigaretta füst részecskéinek endothel sejtekre gyakorolt hatása miatt. Valószínűleg az NO és anyagcseréje kapcsán képződött oxidációs metabolitok is részt vesznek a fennt említett pathológiai folyamatok létrejöttében. Az irodalomban széles körben publikált azon tény, hogy dohányosokban az FENO szignifikáns csökkenése tapasztalható, egészséges, hasonló korú, nem dohányzó egyének adataihoz viszonyítva. Továbbá szignifikáns korelációt állapítottak meg a napi cigaretta fogyasztás mennyisége és az NO csökkenés mértéke között (18, 19). Cigaretta expozíciót közvetlenül követően további tranziens, kisfokú FENO koncentrációesést mutattak ki (18). A dohányzásról való leszokás után az FENO szint visszatér a normál értékhez (77). Az alacsony NO koncentráció a légutakban - legalábbis részben magyarázhatja a dohányosok hajlamát bizonyos betegségekre. Az NO antimikróbás hatása miatt az endogénen képződött NO-nak szerepe van a légúti infekciók elleni védelemben. Az NO a légúti epitheliális sejtek ciliáris működésének szabályozásában is részt vesz, mely fontos mechanizmus a felső és alsó légutak váladéktól, szennyeződéstől való megtisztításában. Ismert az NO PMN sejtek adhézióját gátló és kemotaxisát befolyásoló effektusa (78). Az NO mennyiségének endogén csökkenése PMN dominanciájú infiltrációra hajlamosíthat, mely gyakran megfigyelhető rendszeres dohányzóknál (79). 25
Az NO képződés csökkenése tehát - többféle módon - prediszponálhat légúti infekciókra. A kardiovaszkuláris betegségek közül a dohányosoknak magasabb a rizikója hipertóniára és perifériás érbetegségekre (pl. érelmeszesedés, iszkémia). A bazális NO termelődés enos aktivitás útján, a szisztémás keringésben a vaszkuláris tónus egyik fontos szabályozója lehet. Ezt támasztja alá az a megfigyelés, hogy NOS inhibitor infúziója egészséges egyénekben vérnyomás emelkedést okoz (80). Az endotheliumból származó NO szerepet játszik a trombocita addhézió megakadályozásában és véd az ateroszklerózis kialakulásától (2). Amennyiben a dohányzás csökkenti a bazális endogén NO termelődését cnos gátlás mechanizmusán keresztül - ez magyarázatot adhat arra, hogy miért fordulnak elő gyakrabban kardiovaszkuláris betegségek habituáis dohányzók körében. Az NO csökkent képződése mellett természetesen az NO fokozott metabolizmusa is befolyásolhatja az FENO koncentrációját. Tekintettel arra, hogy a dohányzók légútjai állandó oxidatív stressznek vannak kitéve, és a cigaretta füst önmagában is nagymennyiségű oxidáns és magas koncentrációjú NO forrása, valószínűnek tűnik az NO légutakon belüli átalakulása káros hatású oxidációs termékekké (20). Dohányzókban a tüdő epitheliális folyadékában szokatlanul magas antioxidáns koncentráció mérhető, mely mutatja a szervezet alkalmazkodó képességét és védekezőreakcióját az oxidatív hatásokkal szemben. Az NO S-nitrozotiol formájában raktározódhat a légutak epitheliális folyadékában, vagy ebből való átalakulás után felszabadulhat peroxinitrit formájában, mely az FENO átmeneti növekedését okozhatja cigaretta elszívását követően (81). Krónikus oxidatív stressz, melyet a cigaretta okoz, csökkenti a tiol vegyületek hozzáférhetőségét, és fokozza a nitrozotiol lebomlását. Az NO metabolizmusát taglaló tanulmányok azt mutatják, hogy az NO oxidációra való hajlama miatt, anyagcseréjét egyik legjobban befolyásoló tényező a légutakat érő, vagy a külvilágból származó - exogén noxa - vagy belső, a léguti sejtek pathofiziológiai változása, például gyulladása kapcsán létrejövő - endogén noxa - oxidatív stressz. 26
Az NO metabolitok légúti váladékokban történő vizsgálata párhuzamosan az FENO detektálásával közelebb vihet bennünket a kérdés megválaszolásához, hogy miért tapasztalható egyes pulmonális betegségekben, állapotokban - a gyulladásos patológia és/vagy rekurráló oxidatív stressz fennállása ellenére - csökkent FENO érték. Légúti váladék non-invazív gyűjtésének egyik legegyszerűbb, újonnan kidolgozott metodikája a kilégzett levegő kondenzátumának analízise, mely lehetővé teszi a légutakban zajló biokémiai folyamatok pontosabb megismerését. 27
3. CÉLKITŰZÉSEK Jelen munkám közvetlen célkitűzései a következők voltak: Különböző NO metabolitok (nitrit, nitrát, nitrotirozin) koncentrációjának meghatározása a kilégzett levegő kondenzátumában, FENO detektálásával párhuzamosan, olyan kórállapotokban melyek exogén vagy endogén oxidatív stresszel járnak és közös jellemzőjük az FENO csökkenése. I. NO metabolitok koncentrációjának meghatározása CF-s betegek kilégzett kondenzátumában, ahol a krónikus légúti gyulladás és fokozott oxidatív stressz ellenére az FENO csökkenése detektálható. Van-e különbség a kilégzett kondenzátum NO metabolit koncentrációjában CF-s betegek és egészséges egyének között? Van-e különbség a kilégzett kondenzátum NO metabolit koncentrációjában az antiflogisztikus kezelésben (szteroid) részesült és nem részesült csoport között? Van-e valamilyen összefüggés az FENO, légzésfunkciós adatok és NO metabolitok között? II. NO metabolitok koncentrációjának meghatározása habituális dohányosokban, ahol a cigaretta füst által kiváltott exogén oxidatív stressz ellenére szintén az FENO csökkenése figyelhető meg. Van-e különbség a kilégzett levegő kondenzátum NO metabolitjának (nitrit, nitrát, nitrotirozin) koncentrációjában egészséges dohányos és nem dohányzó személyek között? Cigaretta expozíció után rövid idővel (30 perc) van-e változás az NO metabolitok koncentrációjában? Cigaretta elszívása után hosszabb idő elteltével (3 óra) tapasztalható-e változás a fenti NO metabolitok szintjében?
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Vizsgált csoportok 4.1.1.Cystás fibrosisban szenvedő betegcsoport A vizsgált személyeket a Royal Brompton Hospital (London, UK) Cystic Fibrosis Klinikájáról vontuk be tanulmányunkba. Burkholderia cepacia, meticillin rezisztens Staphylococcus aureus kolonizáció vagy akut légúti infekció kizáró tényezők voltak. A klinikai stabilitás kritériuma az akut exacerbáció kizárhatósága volt, melyet a következőképpen definiáltunk: fokozódó köhögés, fokozódó mennyiségű köpetürítés, változás a köpet minőségében (purulens, véres, putrid) fokozódó fulladás, szignifikáns FEV 1 csökkenés a beteg legutóbbi adataihoz viszonyítva, csökkent terhelési tolerancia. Amennyiben ezen tünetek közül bármelyik észlelhető volt a betegnél a tanulmányba nem vontuk be. 36 stabil állapotú, felnőtt, CF-ben szenvedő beteget vizsgáltunk meg (23 férfi, 29 ± 1 éves, FEV 1 59,7 ± 26,4 a várható érték %-ként kifejezve), közülük 16 tartós inhalatív és/vagy per os kortikoszteroid terápiát kapott (a dózistartomány napi 400 µg inhalatív szteroid és napi 8 mg per os szteroid között volt). Minden betegnél történt köpet bakteriológiai tenyésztése valamint vér laboratóriumi vizsgálata. Közülük 22 (61 %) köpetben volt kimutatható Pseudomonas aeruginosa (> 10 5 cfu/ml) kolonizáció, 12 (33 %) esetben egyéb kórokozót detektáltak (Staphylococcus aureus, Heamophilus influenzae), 2 köpetben volt normál flóra. 5 (14 %) köpetben tenyészett ki mind a Pseudomonas aeruginosa és a Staphylococcus aureus is. Fehérvérsejtszám 10,5 ± 0,5 g/l, a Westergreen érték pedig 18,3 ± 3,5 mm/óra volt. A kontrol csoport 14 egészséges, felnőtt, önkéntes egyénből állt (6 férfi, 34 ± 2 éves, FEV 1 101,8 ± 2,6 %), akik nem szedtek rendszeresen semmiféle gyógyszert, valamint anamnézisükben nem szerepelt légúti infekció a vizsgálatot megelőző két hétben. Minden vizsgálati személy (CF-s betegek, egészségesek önkéntesek) nem dohányzó voltak. A klinikai adatok a 1. táblázaton láthatók. 29
A tanulmány protokollját a Royal Brompton Hospital Etikai Bizottsága jóváhagyta, minden vizsgált beteg a beleegyező nyilatkozatot aláírta. 1. Táblázat CF-S BETEGCSOPORT ÉS EGÉSZSÉGES KONTROLL CSOPORT KLINIKAI ADATAI Szteroid nélkül kezelt CF-s betegek (n=20) Szteroiddal kezelt CF-s betegek (n=16) Egészséges normál egyének (n=14) Kor (év) 27 ± 2 30 ± 2 34 ± 2 Sex (F/N) 14/6 9/7 6/8 FVC (%) 86,3 ± 4,9 74,7 ± 5,5 100,5 ± 3,1 FEV 1 (%) 67,5 ± 6,5 51,9 ± 4,9 101,8 ± 2,6 PA köpet 9 13 0 bakteriológiai tenyésztésben Terápia Inhalatív szteroid Per os szteroid Per os + inhalatív szteroid 0 0 0 9 5 2 0 0 0 Rövidítések definíciói: FEV 1 = forszírozott kilégzési másodperctérfogat, FVC = forszírozott vitálkapacitás, PA = Pseudomonas aeruginosa. Az értékek átlag ± SEM-ben vannak kifejezve. 4.1.2.Egészséges, habituális dohányzók és nemdohányzók 30 egészséges önkéntes (13 férfi) adatait vizsgáltuk. Az alanyokat két csoportba osztottunk dohányzási szokásuktól függően: nem dohányzókra (n = 14, 34,8 ± 2,3 év) és 30
dohányzókra (n = 16, 31,7 ± 2,2 év). A habituális dohányzók cigaretta fogyasztása 7,3 ± 2,0 dobozév. A vizsgált személyek anamnézisében nem szerepelt légúti vagy kardiális betegség (hipertónia, asztma, légúti infekció a vizsgálatot megelőző két hétben). A vizsgált egyének a tanulmány idején illetve az azt megelőző két hétben semmiféle gyógyszert nem szedtek. A tanulmány során FENO-t, kilégzett szén-monoxidot (eco)-t, légzésfunkciós adatokat mértünk, valamint a kilégzett levegő kondenzátumát gyűjtöttük minden személynél. A légzésfunkciós paraméterek FEV 1, FVC normál tartományban voltak. A vizsgált személyek klinikai adatait a 2. táblázat tartalmazza. A vizsgálat megkezdése előtt a dohányosok legalább 4 órán keresztül tartózkodtak a dohányzástól. A kiindulási adatok lemérése, illetve a kondenzátum gyűjtése után a dohányzók 2 cigarettát szívtak el, majd ezt követően 30 és 90 perccel fenti adatok ismételt mérése, illetve kondenzátum gyűjtése történt. A tanulmány protokollját a Royal Brompton Hospital Etikai Bizottsága jóváhagyta, minden önkéntes vizsgálati alany a beleegyező nyilatkozatot aláírta. 2. Táblázat EGÉSZSÉGES DOHÁNYZÓK ÉS NEM DOHÁNYZÓK KLINIKAI ADATAI Egészséges dohányzók (n=15) Kor (év) 32 ± 2 35 ± 2 Egészséges nem dohányzók (n=14) Sex (F/N) 7/8 6/8 FVC (%) 97,1 ± 3,1 100,5 ± 3,1 FEV 1 (%) 90,1 ± 1,4 101,1± 2,6 Kilégzett NO (ppb) 4,3 ± 0,3* 5,5 ± 0,5 Kilégzett CO (ppm) 12,5 ± 2,2** 3,5 ± 0,3 Röviditések definiciói: FEV 1 = forszirozott kilégzési másodperctérfogat FVC = forszirozott vitál kapacitás, NO = nitrogén monoxid, CO = szénmonoxid. Az értékek átlag ± SEM-ben vannak kifejezve. *p < 0,05; **p < 0,001. 31
4.2. Légzésfunkció FVC-t és FEV 1 -t spirométerrel mértünk (Vitalograph, Buckingham, UK) három manőver közül a legjobbat a várható érték százalékában fejeztük ki. A totálkapacitást (TLC) és a reziduális volument (RV) pletizmográffal detektáltuk. (Transfer Factor Model B; PK Morgan; Rainham, UK). 4.3. Kilégzett NO mérés FENO mérése kemilumineszcens módszerrel történt (Model LR2000, Logan Research Ltd, Rochester, UK). A módszer szenzitivitása 1-500 ppb volumenenként, 0,3 ppb mellett. A műszer lehetővé teszi az FENO koncentráció online detektálást. A készüléket ismert NO keverékkel (nitrogénben) (55 ppb) kalibráltuk (BOC Special gases, Guilford, UK). Az FENO mérése lassú kilégzés alatt (5 to 6 L/min) a TLC 20-25. másodpercében történt 3 ± 0,4 Hgmm ellenállás mellett, azért hogy a nazális kontaminációt kiküszöböljük. A fenti ellenállás esetén záródik a lágyszájpad. Az NO értékét a kilégzett CO 2 koncentrációját jelző görbe platójának végpontján határoztuk meg, így az alsó légutakból származó mintát tudtuk detektálni. 4.4. Kilégzett CO mérés Kilégzett CO mérése módosított elektrokémiai szenzorral történt, melynek szenzitivitása 1 részecske per millió (ppm) - 500 ppm, (Logan Research Ltd, Rochester, Kent, UK). Két mérés átlagát jegyeztük fel. A levegő CO tartalmát minden esetben levontuk a mért értékekből. 4.5. Kilégzett levegő kondenzátum gyűjtése A kilégzett levegő kondenzátumának gyűjtése speciális kondenzáló eszközzel történt, mely lehetővé teszi a kilégzett levegő nem gáz jellegű komponenseinek non- 32
invazív összegyűjtését (EcoScreen, Jaeger, Würzburg, Germany). Szájöblítést követően, a vizsgált személyek egy szájrészen át lélegeztek, mely két szelepes billentyűvel volt ellátva (ez egyúttal nyálcsapdaként is szolgált). A vizsgált egyének 10 percen keresztül normál légzési volumennel és frekvenciával lélegeztek, miközben orrcsipeszt viseltek. A kondenzátumot, melynek mennyisége 10 perc alatt legkevesebb 1 ml volt, -20 C-on gyűjtöttük és -70 C-n tároltuk. 4.6. Kilégzett levegő kondenzátumának kémia analízise 4.6.1. Nitrit, nitrit + nitrát mérése NO 2 - mérése fluorometriás assay-vel történt, mely a nitrit és a 2,3- diaminonaphthalene (DAN) azon reakcióján alapult, hogy a képződött termék (1-(H)- naphthotriazol) fluorescens tulajdonsággal rendelkezik (68). Az assay detekciós limitje 0,1 µm. 100 µl mintát (a kilégzett levegő kondenzátumából) összekevertünk 10 µl 0,05 mg/ml-s koncentrációjú DAN reagenssel 0,625 M HCl-ban. A reakció szobahőmérsékleten, sötétben történt, melyet 10 µl 1,4 M NaOH-al állítottunk le. A fluoreszcens jel intenzitását fluorométerrel azonnal leolvastuk (Ex: 360 nm, Em: 460 nm: Biolite F1, Labtech, International Ltd, Uckfield, UK). A minták inkubálása nitrát reduktázzal lehetővé tette, hogy a mintában levő nitrát ugyanezen módszerrel mérhető legyen miután a mintában levő nitrát nitritté konvertálódott. 4.6.2. Nitrotirozin mérés A nitrotirozint specifikus enzim immunoassay-vel mértük (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Az assay-t ismert koncentrációjú nitrotirozinnal hitelesítettük (0,95). A kilégzett levegő kondenzátum nitrotirozin koncentrációját EIAval detektáltuk. Az assay detekciós limitje 3,9 ng/ml volt. Minden esetben a kilégzett levegő kondenzátumából származó mintákat száraz fagyasztó segítségével (Modulyo, Edwards, Crawley, UK) háromszorosára koncentráltuk és ezt követően analizáltuk. 33
6 mintában vizsgáltuk amiláz jelenlétét. Mivel amiláz nem volt kimutatható egy mintában sem, valószínűnek tartottuk, hogy a kondenzátum nem kontaminálódott nyállal. 4.7. Statisztikai analízis Az adatok mind átlag ± SEM vannak kifejezve. A vizsgálatban részt vevő személyek adatai normális eloszlást mutattak. A CF-s betegcsoport és az egészséges önkéntesek közötti statisztikai összehasonlítások Student-t teszttel történtek. Az FENO és nitrotirozin koncentráció, valamint a nitrotirozin szint és légzés funkciós adatok (FVC, FEV 1, RV, TLC) közötti korrelációt Pearson korrelációs koefficienssel, illetve multiplex regressziós analízissel határoztuk meg. Az egészséges dohányzó és nem dohányzó csoportok közötti statisztikai összehasonlítások Student-t teszttel történtek. Dohányzás hatásának vizsgálata az NO metabolitokra ANOVA-val történt. A szignifikanciát p < 0,05 értéknél fogadtuk el. A statisztikai analízis Statistica 5.1-s statisztikai programmal történt (StatSoft Inc, Tulsa, Oklahoma, USA). 34