Ph.D. Értekezés Tézisei. A kilégzett levegő kondenzátumának adenozin szintje: módszertani és klinikai vonatkozások. Dr. Vass Géza

Átírás

1 Ph.D. Értekezés Tézisei A kilégzett levegő kondenzátumának adenozin szintje: módszertani és klinikai vonatkozások Dr. Vass Géza Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Témavezető: Dr. Horváth Ildikó Budapest, 2005

2 2

3 Bevezetés Az alsó légutak vizsgálhatók közvetett úton (pl. légzésfunkció) vagy közvetlen, de megterhelő, invazív módszerekkel (pl. bronchoscopia). Ezek hasznos kiegészítő módszere lehet a kilégzett levegő kondenzálása, mivel noninvazív és összetevői elsősorban az alsó légutakból származnak. Lényege, hogy a kilélegzett levegő páratartalmát egy hűtött csövön keresztülvezetve kondenzáljuk, s az így nyert folyadékban különféle molekulák szintjét vizsgáljuk. Előnyei ellenére klinikai alkalmazását korlátozza, hogy a benne található mediátorok szintje igen alacsony, ezért mérésük nehézkes. Nem tisztázott kérdés, hogy a mintagyűjtés alatti belégzési mód (mely történhet orron vagy szájon át) hogyan befolyásolja a kilélegzett levegő összetételét. Orrcsipesz viselése mellett csak a száján keresztül lélegezhet be-ki, míg az orrcsipesz elhagyása esetén az orrán át is vehet levegőt. Végül, de nem utolsó sorban, nem tudni, hogy a szájüreg milyen mértékben befolyásolja a kilégzett levegő összetételét. Kísérleteinkben három mediátor szintjét vizsgáltuk (adenozin, ammónia, thromboxánb 2 TXB 2 ). Ezek közül kiemelt figyelemmel kísértük az adenozint. Számos in vitro és állat kísérlet igazolta szerepét asztmában, és ismert, hogy szintje megemelkedik asztmás személyek tüdőmosó- 1

4 folyadékában. Ezért a metodikai kísérleteken túl vizsgáltuk szintjét asztmások kilégzett levegőjében. Közismert, hogy asztmások közel egyharmadában rhinitis alakul ki, és az is, hogy sok nem-asztmás rhinitises személy alsó légutaiban tünetmentes gyulladás áll fönn. Hasznos lenne olyan eszköz, mely egy ilyen szubklinikus folyamatot szűrni tudná, s a kilégzett levegő kondenzálása alkalmas módszernek tűnik. Ezért vizsgáltuk nem-asztmás allergiás rhinitises személyek kondenzátumának adenozin szintjét is, és megvizsgáltuk, hogy az mutat-e összefüggést más gyulladásos mediátorral (kilégzett nitrogén monoxid FeNO). Asztmás légutak ph-ja savas irányba változik, ennek kialakításában játszhat szerepet az ammónia. A TXB 2 pedig a pro-inflammatorikus TXA 2 stabil, mérhető metabolitja. Kérdéseink a következők voltak: Metodikai vizsgálatok 1. Van-e a belégzés módjának hatása a kilélegzett levegő kondenzátumának összetételére ill. térfogatára? 2. Mennyiben befolyásolja a szájüreg a kilégzett levegő összetételét? 2

5 Vizsgálatok asztmásokkal és rhinitises betegekkel 3. Emelkedett-e a kilégzett levegő kondenzátumának adenozin szintje allergiás asztmásokban, és mutat-e összefüggést más gyulladásos markerrel (FeNO)? 4. Emelkedett-e a kilégzett levegő kondenzátumának adenozin szintje nem-asztmás rhinitises betegekben, és mutat-e összefüggést más gyulladásos markerrel (FeNO)? 5. Van-e az orron át történő belégzésnek hatása a kilégzett levegő adenozin szintjére allergiás rhinitisesekben? Módszerek Vizsgálati csoportok és a vizsgálatok kivitelezése Metodikai vizsgálatok A belégzés módjának vizsgálatához 25 egészséges személytől (24±5év) kétszer gyűjtöttünk mintát percig egy 15 perces szünetet tartva: az elsőt orrcsipesz viselése mellett (belégzés szájon át), a második gyűjtést orrcsipesz viselése nélkül végeztük (belégzés orron át). A minták térfogata, valamint adenozin, ammónia, TXB 2 és nyál-amiláz (nyál-kontamináció kizárására) szintje került megmérésre. Tíz mesterségesen lélegeztetett betegtől (4 ARDS, 3 szepszis, 3 posztoperatívan lélegeztetett beteg, 57±22év) kondenzátumot gyűjtöttünk úgy, hogy a kondenzáló 3

6 berendezést az intratracheális tubus kilégző szárához csatlakoztattuk (felső légutak kizárva). Vizsgálatok asztmásokkal Egészségesek Szteroid naiv betegek Inhalációs szteroiddal kezelt betegek n kor, év 31,8±2,3 32,6±2,5 35,1±3,0 FEV 1 % 91,2±2,1 85,3±1,9 81,6±2,0 BDP, μg 1246±152 Vizsgálatok nem-asztmás allergiás rhinitises betegekkel Egészségesek Allergiás rhinitises betegek n kor, év 25,7±1,2 35,0±2,4 FEV 1 % 96,3±2,4 97,2±2,3 A rhinitisesekkel végzett kísérletek során is kétszer gyűjtöttünk mintát minden bevont személytől (orrcsipesszel és anélkül) a metodikai vizsgálatoknál leírt rendszerben. Kondenzátum gyűjtése A kilégzett levegő kondenzátumát -20 C-on gyűjtöttük (EcoScreen, Jaeger, Németország). A mintákat -70 C-on tároltuk az analitikai elemzés időpontjáig. 4

7 Mediátor mérés FeNO mérése kemilumineszcenciás alapelven mérő analizátorral történt. A kondenzátum adenozint HPLCmódszerrel, ammóniát spektrofotometriás úton, a TXB 2 -t RIA-val, az amilázt enzimatikus kinetikus módon mértük. Statisztikai analízis A két mintavételi mód közötti különbség elemzésére párosított t-tesztet, minden más esetben egyutas ANOVA-t használtunk. Az eredményeket átlag±szórás formájában adtuk meg. A p<0,05 értékeket fogadtuk el szignifikánsnak. Eredmények Van-e a belégzés módjának hatása a kilélegzett levegő kondenzátumának paramétereire egészségesekben? Orrcsipesz nélkül, tehát orron át való belégzés során szignifikánsan nagyobb mennyiségű kondenzátumot nyertünk, mint a hagyományos orrcsipeszes mintavétellel (2321±736μl vs. 1746±400μl, p=0,0001), míg a mediátor szintekben nem volt különbség (adenozin: 7,9±3,9nM vs. 8,3±4,3nM; ammónia: 74,0±57,0μM vs. 73,9±54,7μM; TXB 2 : 24,9±18,9pg/ml vs. 30,9±19,6pg/ml). Szignifikáns lineáris kapcsolat volt a két módszerrel nyert minták adenozin (r=0,783, p<0,0001) és ammónia (r=0,707, p<0,0001) koncentrációi között, de ugyanez az összefüggés nem volt kimutatható TXB 2 esetében (r=0,364, p=0,073) 5

8 Mennyiben befolyásolja a szájüreg a kilégzett levegő összetételét? n adenozin (nm) ammónia (μm) TXB 2 (pg/ml) nyál amiláz (U/l) kondenzátum 25 8±4 74±55 31±20 8±6 szájon át kondenzátum 10 29±23 11±16 44±11 tubus át p ns. p<0,05 ns. A nyállal való közvetlen szennyeződés valószínűleg elhanyagolható mértékű, mivel amiláz aktivitásuk több nagyságrenddel elmaradt a nyálban mérttől (>10 5 U/l). Az intubált betegek alsó légutaiból közvetlenül nyert minták ammónia koncentrációja szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az egészségesekben mért értékek, arra utalva, hogy a felső légutakban/szájüregben adódik a kilégzett levegőhöz. Emelkedett-e a kilégzett levegő kondenzátumának adenozin szintje allergiás asztmásokban? A kondenzátum adenozin szintje szignifikánsan emelkedett volt szteroid-naiv allergiás asztmásokban (14,8±7,2nM) szemben az egészségesekkel (9,3±6,4nM, p<0,01) és az inhalációs szteroid-terápiában részesülő 6

9 betegekkel (10,3±5,6nM, p<0,05), és szignifkáns korrelációt mutatott a FeNO-val (r=0,398, p=0,0081). Emelkedett-e a kilégzett levegő kondenzátumának adenozin szintje nem-asztmás allergiás rhinitises betegekben? A kondenzátumok adenozin szintje szignifikánsan magasabb volt allergiás rhinitises betegekben, mint az egészséges kontroll csoportban (12,4±1,3nM vs. 6,5±0,7nM, p=0,0019) (1.ábra), és szignifikánsan korrelált a FeNO-val (r=0,41, p=0,009, n=42). 30 p=0, p=0,0099 adenozin, nm kilélegzett NO, ppb egészséges allergiás rhinitis 0 egészséges allergiás rhinitis 1.ábra. Az egyes személyek kondenzátum adenozin és kilélegzett NO szintje. A kilégzett adenozin és FeNO szignifikánsan magasabbak voltak a rhinitisekben, mint az egészséges személyekben. 7

10 Van-e az orron át történő belégzésnek hatása a kilégzett levegő adenozin szintjére felső légúti gyulladásban szenvedő, allergiás rhinitises betegekben? A mintavétel alatti belégzési mód nem befolyásolta az egészségesek adenozin szintjét (6,5±0,7nM szájon át való belégzés során, 6,8±0,8nM orron keresztül való belégzés mellett). Ezzel szemben allergiás rhinitises betegekben áltagosan mintegy 50%-kal több adenozin volt mérhető az orron át történő belégzés mellett nyert mintákban, mint szájon keresztül való légzés során (17,7±2,8nM vs. 12,0±1,4nM, p=0,007) (2.ábra). kondenzátum adenozin, nm A ns. B p=0,006 0 belégzés: szájon át orron át Egészséges szájon át orron át Allergiás rhinitis 2.ábra. Egészségesek (A) és rhinitises (B) személy szájon át ill. orron át történő belégzés mellett nyert kondenzátumainak adenozin szintje. Allergiás rhinitises betegek adenozin szintje orron át történő belégzés mellet nyert mintákban szignifikánsan magasabb volt. 8

11 Megbeszélés Metodikai vizsgálatok Ha a vizsgálati személyek orrukon veszik a levegőt mintagyűjtés alatt, akkor több minta nyerhető ugyanannyi idő alatt. Ugyan egészségesekben a kondenzátum összetétele nem változik, gyulladt orrüregen keresztül való belégzés megváltoztatja a kondenzátum összetételét, ezért összességében célszerűbbnek tűnik a kondenzálást egységesen orrcsipesz viselése mellett végezni. Mivel a kondenzátumokban elhanyagolható mennyiségben lehet amiláz-aktivitást kimutatni, a nyállal való közvetlen kontaminációt minimálisnak véljük. Ez a feltételezés adenozin és TXB 2 esetében további megerősítést nyer intubált betegek alsó légutaiből közvetlenül nyert kondenzátum elemzése révén, melyben e két mediátor szintje a hagyományos módon szájon át nyert mintákkal azonos tartományban volt. Az ammónia azonban az alsó légúti mintákban gyakorlatilag nem volt kimutatható. Ez arra enged következtetni, hogy a kondenzátum ammónia tartalma a felső légutakból adódik a kilégzett levegőhöz, feltételezhetően illékony molekula lévén párolgás útján. Vizsgálatok asztmásokkal és rhinitises betegekkel Kísérleteink kimutatták, hogy az adenozin szintje emelkedett a szteroid kezelésben nem részesülő asztmás 9

12 betegek kilélegzett levegőjében egészségesekkel szemben. Ez a különbség a légutakban jelenlévő gyulladásos sejtek számának és aktivitásának növekedésére utal. Összefüggést találtunk az adenozin koncentrációja és a FeNO szint között. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a kilégzett adenozin potenciális alsólégúti gyulladásos marker. Az irodalomból tudjuk, hogy allergiás rhinitis és asztma sokszor együtt jelentkezik, és hogy sok rhinitises beteg alsó légutaiban tünetmentes gyulladás állhat fönn. Eredményeink szerint a kondenzátum adenozin szintje emelkedett nemasztmás allergiás rhinitises betegekben egészségesekkel szemben, arra utalva, hogy ezen betegek alsó légutaiban szubklinikus gyulladás áll fönn. Ezt támasztja alá, hogy a rhinitises betegekben mért adenozin szint ugyanabba a tartományba esett, mint amit asztmásokban mértünk, ill. hogy összefüggést mutatott az alsó légúti gyulladás markereként számon tartott FeNO-val. Érdekes megfigyelésre tettünk szert, ti. hogy rhinitises betegekben az orron át történő belégzés során szignifikánsan magasabb a kondenzátum adenozin szintje, mint a szájon át történő belégzéshez mellett. Mivel ugyanez a különbség nem volt kimutatható egészséges személyekben, feltételezzük, hogy ennek oka a gyulladt orrüreg magas adenozin tartalma. Ez azt jelenti, hogy gyulladásos mediátorok belégzés útján lejuthatnak a felső 10

13 légutakból az alsókba, s e folyamat krónikus fönnállása hozzájárulhat asztma kialakulásához rhinitises betegekben. Az új eredmények összefoglalása és következtetések Metodikai vizsgálatok Az orron keresztül való belégzés a mintagyűjtés alatt szignifikánsan növeli a kondenzátum mennyiségét, nem változtatja a minták mediátor szintjeit egészségesekben, de befolyásolhatja rhinitises személyekben. Ezért célszerűbb egységesen orrcsipesz viselése mellett kondenzálni. A kondenzátum nyállal való közvetlen szennyeződése minimális. Az ammónia inkább a felső légutakból származik. Vizsgálatok asztmásokkal és rhinitises betegekkel A kondenzátum adenozin szintje szignifikánsan emelkedett szteroid-mentes asztmásokban és nem-asztmás rhinitises betegekben, és összefüggést mutat a FeNO-val, ami arra utal, hogy a kilégzett adenozin az alsó légúti gyulladás markere. Az orron keresztül való belégzés allergiás rhinitises betegekben szignifikánsan növeli a kilégzett levegő kondenzátumának adenozin szintjét. Ez arra utal, hogy gyulladásos mediátorok a felső légutakból belégzés útján lekerülhetnek az alsó légutakba. 11

14 Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt és elsősorban Dr. Horváth Ildikónak, témavezetőmnek mondok köszönetet mindenkori szakmai segítségéért, önzetlen hozzáállásáért, mely lehetővé tette nemzetközi konferenciákon és kétéves amerikai szakmai tanulmányúton való részvételemet, és mindig odaadó, mindenkor szolgálatkész, vidám személyiségéért. Nagyon sok hálával tartozom az Országos Korányi Intézet kórélettani osztálya minden tagjának, különösen is a jó hangulatú munkahelyért. Köztük is elsősorban Dr. Huszár Évának, aki közvetlen munkájával legtöbbet támogatott és bíztatott mind szakmailag mind emberileg. Köszönetet mondok Dr. Szőnyi Lászlónak, akinek baráti tanácsára az egyetem után ösztöndíjas PhD hallgató lettem, és Dr. Kollai Márknak, aki lehetőséget adott, hogy laborjához csatlakozzam. Végül, de nem utolsó sorban nagyon sok hálával és köszönettel tartozom Dr. Haczku Angélának, aki a Philadelphiában töltött kétéves szakmai utam során témavezetőm és mentorom volt. 12

15 Az értekezés témájában megjelent közlemények Vass G., Huszár É., Barát E., Valyon M., Horváth I. Comparison of nasal and oral inhalation during exhaled breath condensate collection. Am J Respir Crit Care Med. 2003;167: IF: 8.876, független citációk száma: 12 Vass G., Huszár É., Barát E., Horváth I. A kilégzett levegő kondenzálása és a kondenzátum elemző vizsgálata. Új módszer a tüdőgyógyászatban. Orvosi Hetilap 2003;144: Vass G., Huszár É., Barát E., Horváth I. Egy légút, két betegség? Az allergiás rhinitis és az asztma közötti kapcsolat. Allergológia és Klinikai Immunológia 2004;7:8-17. Huszár É., Vass G., Vizi É., Csoma Zs., Barát E., Molnár-Világos Gy., Herjavecz I., Horváth I. Measurement of adenosine in EBC in healthy volunteers and patients with asthma. Eur Respir J. 2002;20: IF: 2.999, független citácók száma: 9 Huszár É., Vass G., Csoma Zs., Vizi É., Barát E., Herjavecz I., Horváth I. Adenozin koncentráció egészségesek és atópiás asztmás betegek kilégzett levegő kondenzátumában Medicina Thoracalis 2002;55: Az értekezés témájában megjelent előadáskivonatok Huszár É., Vass G., Horváth I., Herjavecz I. Expired adenosine in breath condensate of healthy subjects, allergic- and asthmatic patients. Am J Respir Crit Care Med. 2001;163:A48. Vass G., Huszár É., Barát E., Molnár-Világos Gy., Valyon M., Horváth I., Kollai M. The effect of the use of nose clip on exhaled breath condensate. Am J Respir Crit Care Med. 2002;165:A15. Vass G., Huszár É., Barát E., Horváth I., Kollai M. Measurement of prostaglandine 2 (PGE 2 ) and thromboxaneb 2 (TXB 2 ) in exhaled breath condensate (EBC) in healthy volunteers. Eur Respir J. 2002;20:510s. Vass G., Huszár É., Barát E., Molnár-Világos Gy., Valyon M., Horváth I., Kollai M. Az orrcsipesz használatának hatása a kilégzett levegő kondenzátumára. PhD Tudományos Napok Absztraktkönyv:100. Vass G., Huszár É., Barát E., Augusztinovicz M., Polony I., Horváth I. Allergic rhinitis is associated with elevated adenosine level in exhaled breath condensate in non-asthmatic patients. Am J Respir Crit Care Med. 2003;167:A978. Vass G., Huszár É., Barát E., Kiss D., Pénzes I., Kollai M., Horváth I. Comparison of mediator levels in exhaled breath condensate obtained through tracheostomy or orally. Eur Respir J. 2003;22:293s. 13