Immunológia II GY 2018.04.13. Lukácsi Szilvia
7. Sterilitás, in vitro sejttenyésztés Az immunrendszer sejtjeinek izolálása, azonosítása és funkcionális vizsgálata: I. Monociták, makrofágok, dendritikus sejtek
Sterilitás, in vitro sejttenyésztés Pipetták Steril tenyésztőedények CO2 termosztát Steril fülke Steril tápfolyadék (savó (KHS,FCS),antibiotikum stb.)
Sejt koncentráció beállítás A BÜRKER kamra 0.1 mm Sejtek száma 25 db négyzetben * hígítás * 10 4 = sejt/ml
Monociták, makrofágok, dendritikus sejtek
A hemopoézis Plazma
A dendritikus sejtek differenciálódása makrofág
A veleszületett és az adaptív immunrendszer receptorainak jellemzői
Mintázatfelismerő és fagocitótikus receptorok fagocitákon
A makrofágok érése és aktivációja
Monociták és makrofágok legfontosabb sejtfelszíni molekulái
A makrofágok szerepe immunfolyamatokban
Az antigénprezentáló sejtek
A dendritikus sejtek érese és sejtfelszíni molekulái
IMMUNKOMPETENS SEJTEK IZOLÁLÁSA Primer sejtek (állati, emberi): - lép - tímusz - csontvelő - nyirokcsomó - hasüreg - vér Vér - vérplazma ( alakos elemek ) - eritrociták - trombociták - leukociták - granulociták - neutrofil - bazofil - eozinofil - limfociták - monociták Sejtvonalak: Korlátlanul osztódó állati és humán eredetű sejtek
Mo Sűrűség-grádiens centrifugálás: eltérő fajsúlyú sejtek elkülönítése Vér (alvadásgátolt) Ficoll Fajsúly: T 1.077g/cm Gr B Mo T és B limfocita Centrifugálás: 500g, 30 min Plazma Vvt+neutrofil Adherens sejtek (Mo) eltávolítása: adherencia (kitapasztás) PMNS: perifériás mononukleáris sejtek 85% T+B + NK 15% Mo
Sejtszeparálás mágneses mikrogyöngyökkel Dynabead gyöngyök fajspecifikus ellenanyaggal (anti-egér IgG) fedve Gyors, egyszerű, hatékony elválasztás pozitív negatív szelekció Alpopulációk pozitív szelektálása - Depléció Negatív sejtek 99% depléció Többféle ellenanyag keverve Sejtek érintetlenek Pozitív sejtek CD14 99% tisztaság mágnes
Sejtszeparálás mágneses mikrogyöngyökkel pozitív szelekció negatív szelekció
IMMUNKOMPETENS SEJTEK IZOLÁLÁSA Sejtpopulációk elválasztása: 1. Sűrűség grádiensen történő centrifugálás 2. Limfocita: T, B (B-sejtek tapadása nylon-vattához, T-sejt bvvs kötődés - rozetta-képzés) 3. Panning technikák 4. Komplement-mediált lízis 5. Monocita-granulocita: adherencia
Egér monociták és makrofágok izolálása - Egér makrofágok izolálása peritoneumból Mf száma növelhető, ha az állat hasüregében steril gyulladást idézünk elő paraffin olajjal, tioglikoláttal, ConA-val vagy keményítővel. A sejtek a peritoneum átmosásával, majd kitapasztással izolálhatók - Egér monociták izolálása vérből grádiens centrifugálással - Egér szöveti makrofágok izolálása lép, máj, csontvelői makrofágok illetve előalakok elkülőnítése enzimatikus kezelést követően
Emberi monociták és makrofágok izolálása 1. Monociták izolálása PMNS-ből Adherencia: zselatinnal és NHS-el fedett Petri-csészén Mágneses mikrogyögy pozitív szelekció: anti-cd14 ea. 2. Emberi makrofágok előállítása monociták tenyésztésével - az adherencia a monociták makrofággá érését stimulálja - a differenciálódást az M-CSF/GM-CSF serkenti - nem adherens módon tenyésztett sejtek differenciálódásához növekedési faktor szükséges Tenyésztés: NHS/FCS(magzati borjú savó)-tartalmú tápfolyadékban vagy speciális összetételű szérummentes médiumban
Emberi dendritikus sejtek izolálása 1. Dendritikus sejtek in vitro differenciáltatása CD34 + hematopoetikus progenitor sejtekből (csontvelő, köldökvéna vér) 2. Emberi dendritikus sejtek izolálása - vérből:1 %!,éretlen fenotípusú mieloid: mdc (CD11c + ), plazmacitoid: pdc (CD11c - ) - mandulából: LC (CD1a +,Birbeck granulum,langerin), interdigitális DC (CD40 +,CD80 +,CD83 +,CD86 + ), germinális centrum DC (CD11c +,CD4 +,CD3 - ), plazmacitoid pdc (CD11c -,CD4 +,CD3 - ) 3. a legelterjedtebb módszer: Emberi mieloid dendritikus sejtek in vitro differenciáltatása monocitából (MDC) IL-4 és GM-CSF jelenlétében
Makrofágok és dendritikus sejtek in vitro differenciáltatása In vitro differenciáltatás: ÉRETLEN MDC immdc makrofág GM-CSF + IL-4 MONOCITA CD14+ MHCII+ GM-CSF / M-CSF CD14- MHCII++ CD80++CD86++ CD83+ MR- CD14- MHCII+ CD80+CD86+ CD83- MR+ MAKROFÁG MM CD14+ MHCII+ GM-CSF + IL-4 TNF-α / Patogén stimulus ÉRETT MDC mamdc
Dendritikus sejtek érése CD 83 CD 86 MHC II mannóz- receptor éretlen DC érett DC
Funkcionális vizsgálatok
MONOCITÁK, MAKROFÁGOK ÉS DENDRITIKUS SEJTEK FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSÉRE LEGGYAKRABBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLATOK Korai aktiváció kimutatása intracelluláris szabad Ca 2+ ion koncentráció növekedés NF-κB magi transzlokációja aktivált dendritikus sejtekben Fagociták antigén felvétele Partikulum felvétel (nem-opszonizált, opszonizált) FITC-dextrán, torma-peroxidáz endocitózisa Kölcsönhatás más sejtekkel MLR Allogén CD4 + T-sejtek proliferációjának mérése Sejtek migrációja A kemokinek a sejtek kemotaxisát és endotélen keresztüli migrációját váltják ki. A migráció mértéke transwell plate-ben vizsgálható. Citokin termelés Pl. aktivált DC-k által termelt IL-12 meghatározása (mrns, microbead assay, ELISA, immunhisztokémia)
Intracelluláris szabad Ca 2+ ion koncentráció fluoreszcens detektálása észterázok AM AM Ca 2+ ion-szelektív kelátor csoport fluorofór hidrofób lánc (acetoxi-metil-észter) Kalcium indikátor (pl. FURA-2, INDO-1,FLUO-3,4) Ca 2+ -kötés: - indikátor spektrumainak eltolódása - fluoreszcencia intenzitás növekedés [Ca 2+ ] i = K d (F-F min ) (F max -F) K d : Ca 2+ -indikátor komplex disszoc. Állandó F: minta flureszcencia intenzitása F min : fluoreszcencia kioltás (Ca 2+ - Mn 2+ ) F max : maximális Ca 2+ -jel (ionomicin)
NF-kB magi transzlokációja aktivált sejtekben Kontroll LPS aktivált Konfokális lézer mikroszkópos vizsgálat Sejtmag, NFkB
MONOCITÁK, MAKROFÁGOK ÉS DENDRITIKUS SEJTEK FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSÉRE LEGGYAKRABBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLATOK Korai aktiváció kimutatása intracelluláris szabad Ca 2+ ion koncentráció növekedés NF-κB magi transzlokációja aktivált dendritikus sejtekben Fagociták antigén felvétele Partikulum felvétel (nem-opszonizált, opszonizált) FITC-dextrán, torma-peroxidáz endocitózisa Kölcsönhatás más sejtekkel MLR Allogén CD4 + T-sejtek proliferációjának mérése Sejtek migrációja A kemokinek a sejtek kemotaxisát és endotélen keresztüli migrációját váltják ki. A migráció mértéke transwell plate-ben vizsgálható. Citokin termelés Pl. aktivált DC-k által termelt IL-12 meghatározása (mrns, microbead assay, ELISA, immunhisztokémia)
Fagocitózis, Opszonikus fagocitózis
Monociták és makrofágok fagocitózis vizsgálata Fagocitált partikulum: latex, élesztő, baktérium opszonizált (IgG és/vagy komplement) formában is - Inkubálás: 1 óra, 37 C - Értékelés: fénymikroszkóppal, CLM vagy citofluoriméterrel pl. FITC-jelzett partikulumok fagocitózis index vagy fagocitózis % megállapítása, illetve fluoreszcencia intenzitás mérése (Egér és humán makrofág sejtvonalak használata) Emberi DC C3bi opszonozált élesztő fagocitózisa, konfokális lézer mikroszkópos felvétel
Oxidatív anyagcsere ( burst ) L-arginin oxigén stimuláció LPS által NOS stimuláció fagocitózis vagy PMA kezelés hatására NADPH oxidáz nitrogén-monoxid NO szuperoxid anion O 2 - Griess reakció nitrition NO 2 - egyéb reaktív termékek Szuperoxid SOD dizmutáz hidrogén peroxid HO 2 2 -Fe 3+, CitC redukció, -Kemiluminesc nitrátion NO 3 - hidroxilgyök OH RNI ROI A Mf-ok mikróba- és tumorsejt-ölő aktivitásában alapvető szerepet játszanak a stimulált sejtekben keletkező reaktív oxigén intermedier (ROI) és reaktív nitrogen interdedier (RNI) termékek. A reaktív intermedierek mennyisége meghatározható.
MONOCITÁK, MAKROFÁGOK ÉS DENDRITIKUS SEJTEK FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSÉRE LEGGYAKRABBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLATOK Korai aktiváció kimutatása intracelluláris szabad Ca 2+ ion koncentráció növekedés NF-κB magi transzlokációja aktivált dendritikus sejtekben Fagociták antigén felvétele Partikulum felvétel (nem-opszonizált, opszonizált) FITC-dextrán, torma-peroxidáz endocitózisa Kölcsönhatás más sejtekkel Allogén CD4 + T-sejtek proliferációjának mérése (APC, T különböző emberből) Citotoxikus reakció, ADCC (tumorsejt) Sejtek migrációja A kemokinek a sejtek kemotaxisát és endotélen keresztüli migrációját váltják ki. A migráció mértéke transwell plate-ben vizsgálható. Citokin termelés Pl. aktivált DC-k által termelt IL-12 meghatározása (mrns, microbead assay, ELISA, immunhisztokémia)
MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) Kevert limfocita reakció
MONOCITÁK, MAKROFÁGOK ÉS DENDRITIKUS SEJTEK FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSÉRE LEGGYAKRABBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLATOK Korai aktiváció kimutatása intracelluláris szabad Ca 2+ ion koncentráció növekedés NF-κB magi transzlokációja aktivált dendritikus sejtekben Fagociták antigén felvétele Partikulum felvétel (nem-opszonizált, opszonizált) FITC-dextrán, torma-peroxidáz endocitózisa Kölcsönhatás más sejtekkel Allogén CD4 + T-sejtek proliferációjának mérése Citotoxikus reakció, ADCC (tumorsejt) Sejtek migrációja A kemokinek a sejtek kemotaxisát és endotélen keresztüli migrációját váltják ki. A migráció mértéke transwell plate-ben vizsgálható. Citokin termelés Pl. aktivált DC-k által termelt IL-12 meghatározása (mrns, microbead assay, ELISA, immunhisztokémia)
Kemotaxis mérés transwell plate-ben - Kemotaktikumok kiváltják az immunsejtek migrációját - felső edényben sejtszuszpenzió, alsó edényben kemotaktikum (vagy ezt termelő sejtek) - a kettő között filter - kemotaktikus inger hatására membránon átjutó sejtek számának meghatározása - standard alkalmazása transwell plate
MONOCITÁK, MAKROFÁGOK ÉS DENDRITIKUS SEJTEK FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSÉRE LEGGYAKRABBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLATOK Korai aktiváció kimutatása intracelluláris szabad Ca 2+ ion koncentráció növekedés NF-κB magi transzlokációja aktivált dendritikus sejtekben Fagociták antigén felvétele Partikulum felvétel (nem-opszonizált, opszonizált) FITC-dextrán, torma-peroxidáz endocitózisa Kölcsönhatás más sejtekkel Allogén CD4 + T-sejtek proliferációjának mérése Citotoxikus reakció, ADCC (tumorsejt) Sejtek migrációja A kemokinek a sejtek kemotaxisát és endotélen keresztüli migrációját váltják ki. A migráció mértéke transwell plate-ben vizsgálható. Citokin termelés Pl. aktivált DC-k által termelt IL-12 meghatározása (mrns, microbead assay, ELISA, immunhisztokémia)
IL - 10 CITOKIN MÉRÉS ELISA TECHNIKÁVAL OD492 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,0087x - 0,0031 0 0 50 100 150 citokin (pg/ml) IFN-gamma 0,6 OD492 0,4 0,2 Szendvics ELISA: Ellenanyag citokin ellenanyag* Eltérő epitópokra specifikus ellenanyagok Kalibráció: ismert mennyiségű citokin hígítási sorral OD492 y = 0,0061x + 0,086 0 0 20 40 60 80 citokin (pg/ml) IL-4 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,0064x + 0,0126 0 0 50 100 150 citokin (pg/ml)
Ellenanyagtermelő B sejtek kimutatása Limfokintermelő T sejtek kimutatása B sejtek tenyésztése antigénnel CITOKIN fedett TERMELŐ edényben SEJTEK KIMUTATÁSA ELISPOT MÓDSZERREL A T sejtel tenyésztése a kérdéses limfokinre specifikus ellenanyaggal fedett edényben mosás mosás Enzimmel konjugált anti-ig-vel való inkubálás A limfokinnek egy másik epitopját felismerő, enzimmel konjugált ellenanyaggal való inkubálás mosás mosás Kromogén hozzáadása Szubsztrát és kromogén hozzáadása Kromogén hozzáadása pozitív sejtek megszámolása
3.16. ábra Az oxidatív burst folyamata (és NET-képződés) neutrofil granulocitákban Egy másik fagocita: a neutrofil granulocita Funkcionális vizsgálat: - reaktív oxigén gyök termelés - extracelluláris csapda (Neutrophil extracellular trap, NET)