Melanoma malignum progressziójának követése tumormarkerekkel

1 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Onkológia program Melanoma malignum progressziójának követése tumormarkerekkel dr. Bánfalvi Teodóra Doktori értekezés (Ph.D.) Témavezeto: prof. dr. Tímár József Programvezeto: Prof. dr. Jeney András Országos Onkológiai Intézet Budapest, 2003

2 Tartalom I. Bevezetés 1. Melanoma malignum 3 2. Tumormarkerek általános jellemzoi 7 3. Melanoma malignum keringo tumormarkereinek áttekintése 8 4. Melanoma malignum szöveti immmunhisztokémiai markerei (S-100B protein, AMFR) 26 II. Célkituzések 1. Az S-100B protein és 5-S-ciszteinildopa szérum szintjének értékelése melanoma malignum valamennyi stádiumában 29 2. A laktátdehidrogenáz szérum koncentrációjának elemzése S-100B proteinhez és 5- S-Ciszteinildopához viszonyítva melanóma malignumban 29 3. Szérum S-100B protein értékek és szöveti S-100B expresszió közti össszefüggés analízise 29 4. AMF receptor expresszió vizsgálata primér melanomában 30 III. Anyag és módszer 1. S-100B protein meghatározás lumineszcens immunesszével 31 2. 5-S-ciszteinildopa mérés nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával 31 3. LDH meghatározás enzimatikus módszerrel 32 4. S-100B protein immunhisztokémiai vizsgálat 32 5. AMFR expresszió vizsgálata immunhisztokémiával 32 6. Beteganyag 34 7. Statisztikai analízis 40 IV. Eredmények 42 V. Megbe szélés 74 VI. Rövidítések jegyzéke 85 VII. Irodalom 86 VIII. Publikációk és absztraktok jegyzéke 103 IX. Egyéb közlemények 107 X. Köszönetnyilvánítás 110

3 I. Bevezetés 1. Melanoma malignum A melanoma malignum a neuroektodermalis eredetu melanocitákból kiinduló legrosszabb indulatú bordaganat. Incidenciája évente 3-7%-kal növekszik (49,110,132,140). Az epidemiológiai vizsgálatok rendkívül eltéro eredményeket mutatnak. Az elofordulási gyakoriság Ausztrália egyes tartományaiban a 12-28 szélességi kör között a legmagasabb (53,5/100000 lakos évente), míg az egyenlítotol távolodva csökken 30,3/100000-re (36). Európában, Észak-Amerikában ennél jóval kevesebb daganatot számlálnak, 8-10/100000 lakos/évente (110). Magyarországon a Nemzeti Rákregiszter 1288 új esetet észlelt 2000-ben (132). Etiológiájában fo szerepet játszik a nevus pigmentosusok nagy száma, diszplasztikus nevusok jelenléte, idoszakos intenzív napsugárzás, napégés (8,49,161). Bár az új betegek száma folyamatosan és jelentosen növekszik (hazánkban is), összességében a többi daganatos megbetegedéshez viszonyítva a melanoma malignum a ritkább tumorok közé sorolható. Mivel klinikailag, megtekintéssel jól diagnosztizálható, azonnal felmerül a szurovizsgálatok szükségessége. Válogatás nélküli, nagy beteganyagot felölelo szurovizsgálat azonban a fentiek alapján valószínuleg nem lenne igazán hatékony. Megkísérelheto azonban célcsoportok, vagyis várhatóan magas rizikójú egyének számára szurést szervezni. Ide tartoznak azok, akiknek családjában melanoma fordult elo, a bortípusuk alapján (szoke haj, kék szem, hajlam a napégésre) veszélyeztetettek, azok, akiknek korábban más típusú bordaganatuk volt, valamint egyes statisztikák alapján az 50-70 év közötti férfiak. A felvilágosító kampányok során ma már elsosorban az általános fénykerülést javasolják, mivel a fényvédo krémek alkalmazásának elonyei megkérdojelezodtek (21,180). A melanoma prognózisa korai stádiumban, megfelelo biztonsági zónával eltávolítva, rendkívül kedvezo. A sokszínu klinikai kép, a megjelenési formák igen nagy változékonysága miatt a diagnosztikus biztonság jól képzett, 10 éves szakmai gyakorlattal rendelkezo, szakambulancián dolgozó borgyógyász-onkológus esetében is csak 70-80%, mely az utóbbi idoben igen elterjedt dermatoszkóp alkalmazásával, különösen a korai formák esetében néhány százalékkal emelheto (9). A késon diagnosztizált betegek 5 éves túlélése azonban 50%-ra csökkenhet (54,76,109).

4 A melanoma stádium beosztása 2001-ben megváltozott. A továbbiakban a tumorvastagságot törtszámok helyett milliméterekben fejezik ki, a primér tumor ulcerációja bekerült a besoroló tényezok közé, szükséges a nyirokcsomó státusz patológiai felmérése, külön csoportba került az in transit/satellita áttét fogalma, besorolási faktorként szerepel az emelkedett LDH szint (128). Prognosztikus szempontból primér daganatnál elsosorban a tumor Breslow szerinti vastagsága, továbbá az exulceráció, a limfocitás infiltrátum megléte/hiánya, a szentinel nyirokcsomó pozitivitás/negativitás, a betegek neme, a primér tumor lokalizációja mérvadó. Regionális érintettségnél a nyirokcsomók száma, a tokáttörés és a környezo szövetek következményes infiltrációja, a blokkdisszekció utáni tünetmentes idoszak hosszúsága jelentos a túlélés szempontjából (56). Disszeminált esetekben elsosorban a metasztázis helye és száma, valamint az abnormális LDH érték korrelál a rövidebb túléléssel (17,48,56,94,98,109). Az elméleti kutatások kapcsán a szöveti prognosztikus markerekkel (AMF, NM23, CD44, MMP2,) kimutatott összefüggések és következtetések sokszor igen ígéretesek, sajnos azonban a klinikai gyakorlatba még nem épültek be (51, 167). A melanoma malignum terápiás stratégiájában az utóbbi 10 évben jelentos változás tapasztalható. A primér tumor ellátásánál a korábbi radikális sebészet megoldás (altatásban kivitelezett mutétek, körkörös 5 cm-es biztonsági zónával) helyett mára a helyi érzéstelenítésben elvégzett, a várható Breslow szerinti vastagságtól függoen megválasztott, 1-2-3 cm-es biztonsági zóna alkalmazása került elotérbe. Világossá vált, hogy a szélesebb excíziós szél csak a lokális recidívák kialakulásának gyakoriságát csökkenti (36). Áttöro újdonság a primér melanoma sebészi ellátásában a néhány évvel ezelott bevezetett szentinel technika. A módszer a korábban széles körben alkalmazott elektív blokkdisszekció hátrányainak kiküszöbölésére szolgál. Igazolódott, hogy a primér tumor nyirokrégiójának megfelelo, nem tapintható nyirokcsomók eltávolítása nem növeli szignifikánsan az átlagos túlélést, és lényegében egyetlen elonye a pontosabb stádium meghatározás. A mutéti beavatkozás veszélyei azonban fennállnak, szövodményei (pl. limfodema) kialakulhatnak. Ezek után a szentinel technika térhódítása viharos gyorsasággal ment végbe. A módszer lényege a szentinel, azaz orszem nyirokcsomó feltérképezése vitális kék festék és izotóptechnika együttes

5 alkalmazásával. A primér tumort és a 99 m Technéciummal és vitális kék festékkel jelzett nyirokcsomót dinamikus limfoscintigráfiát követoen egy lépésben, sokszor helyi érzéstelenítésben távolítják el. Amennyiben a kérdéses nyirokcsomóban, nagyon gondos szövettani revíziót követoen (sorozatmetszet, immunhisztokémia) daganatsejteket észlelnek, komplett blokkdisszekció következik. Ha a szentinel nyirokcsomó tumormentes, a tapasztalatok szerint a régió többi nyirokcsomója körülbelül 95%-os biztonsággal érintetlen. Ezzel a technikával pontos stádium meghatározás szintén lehetséges, és a beteg mentesül a nagyobb mutéti megterheléstol (36,140). Az adjuváns kemoterápia pozitív hatása az átlagos és tünetmentes túlélésre ugyancsak megkérdojelezodött. Napjainkban egyre inkább az interferon kezelés válik elfogadottá. Jelenleg is kérdéses azonban az interferon alfa adagolásának módja. Két, egymásnak ellentmondó szemlélet érvényesül, a rövidebb ideig tartó nagydózisú, és a közepes vagy alacsony adagú elhúzódó terápia állnak szemben egymással (36,140). A regionális nyirokcsomók ellátásában jelenleg is a sebészi megoldás, a blokkdisszekció elvégzése az elsodleges. Egyes irányzatok szerint, amennyiben a nyirokcsomó(k)ban a daganat áttörte a tokot, posztoperatív irradiáció válik szükségessé. A kemoterápia létjogosultsága ebben a stádiumban is kétségessé vált, a DTIC monoterápia mellett egyre inkább az interferon alfa alkalmazása kerül elotérbe. A melanoma progressziója során távoli metasztázis bárhol kialakulhat. A disszeminált melanoma terápiásan jelenleg hatásosan nem befolyásolható. Számos citosztatikus kezelési séma ismert. A DTIC monoterápián kívül leggyakrabban alkalmazott terápiás kombinációk a következok: DTIC-interferon alfa, DTIC-interferon alfa-interleukin-2, DTIC-BiCNU-bleomycin-vincristin kombináció, DTIC-platidiam, valamint egy összetett kezelése séma, azaz kombinált kemoterápia és bioterápia (interleukin-2 és interferon alfa) felváltva történo adagolása. Egyes szerzok szerint a kemoterápia és bioterápia együttesen 20%-ban hatékony a disszeminált betegeknél (56). A hepatikus áttéteknél, ahol a szisztémás terápia hatékonysága 1% körül mozog, alkalmazható kemoembolizáció vagy kemoperfúzió, melyet leggyakrabban ciszplatin, vagy az elobb említett citosztatikum és vinblastin, vincristine, dacarbazin különbözo kombinációjával végeznek (17). Végtagokon, többszörös boráttétek esetén szintén megkísérelheto végtagperfúzió (63).

6 Sugárkezelés alkalmazható irrezekábilis primér tumor esetében, mérlegelendo regionális nyirokcsomó érintettségnél tokáttörés kapcsán, és elotérbe kerül cerebrális, osseális, cutan, és extraregionalis nyirokcsomó metasztázis ellátásásánál (36). A palliatív terápia megválasztásánál a többi disszeminált daganatos betegség kezeléséhez hasonló elvek érvényesülnek (fájdalomcsillapítás, roborálás). Bár egyes esetekben, meghatározott áttéti lokalizációkban, mint a pulmonális, cutan vagy extraregionalis nyirokcsomó áttétek, megfelelo kezeléssel átmeneti remisszió, sot hosszabb rövidebb ideig tartó tünetmentes idoszakok is elérhetok, ennek ellenére a belso szervi metasztásisban szenvedo betegek túlélése rövid (17,76). Megfeleloen érzékeny, specifikus, olcsó, könnyen kivitelezheto és reprodukálható tumormarkerek alkalmazása nagy segítséget nyújthatna a pontosabb prognózis meghatározásában, elosegítené a metasztázis korai kiszurését, lehetové tenné a korai szisztémás kezelést, a terápia monitorozását és a betegek jobb követését. Azonban mindezidáig a keringo tumormarkerek alkalmazása melanoma malignumban nehézkes, az értékelés sokszor bizonytalan, a vizsgálatok a klinikai onkológiai, borgyógyászati gyakorlatba nem épültek be. Az értekezés a tumormarkerek szerepét vizsgálja a felvetett kérdések szempontjából.

7 2. A tumormarkerek általános jellemzoi Tumormarkernek nevezünk minden olyan anyagot, amelynek megjelenése vagy koncentrációjának megváltozása a szervezetben daganat kialakulását, progresszióját jelzi. A tumormarkerek képzodhetnek a daganatos sejtekben, ekkor tumor-derived markerekrol beszélünk. Kialakulhatnak azonban nem rosszindulatú, a tumor elleni immunitásban részt vevo sejtekben, amikor is tumor associated markerekrol van szó. Kimutatásukra számos, különféle módszer használatos. A kimutatás helye szerint megkülönböztetünk cellularis markereket, melyeket a daganatszövetbol azonosítunk, és keringo vagy extracellularis markereket, melyeket testnedvekbol izolálunk. Klinikai szempontból szurésre, differenciáldiagnózisra, stádium besorolásra, a prognózis jelzésére, terápia monitorozásra, betegkövetésre alkalmasak. A tomormarkerek jellemzoi: Szenzitivitás: meghatározott daganatnál az emelkedett marker koncentráció átlagos valószínuségét adja meg. Értéke függ a betegek számától, a stádiumtól és a cut off szinttol. Specificitás: megmutatja, hogy a marker mennyire képes kiválogatni a betegeket az összes közül. Pozitív prediktív érték : a kóros eredmény hátterében meghúzódó malignus folyamat valószínuségére utal. Negatív prediktív érték: jelzi, hogy egy normál eredmény mögött milyen valószínuséggel nincs malignus folyamat. A számítások alapjául szolgáló képleteket az anyag és módszer fejezetben ismertetem. Cut off érték : koncentrációs küszöbérték. Egy adott vizsgálatban nagysága megválasztható, általában a 95% specificitáshoz tartozó koncentrációt fogadják el. A tumormarkerek klinikai értéke a specificitásuktól, (fals pozitív eredmény lehetoleg nincs), valamint a szenzitivitásuktól (fals negatív leletek minél kisebb számban) függ. A pozitív és negatív prediktív érték szintén fontos faktor, melyet számításba kell vennünk egy marker alkalmazásánál. A tumormarkerek szérum analízise számos daganat kezelésében beépült a klinikai gyakorlatba. Prostata rákban a prostata specifikus antigén, colorectális daganatokban a

8 carcinoembrionalis antigén széles körben használt. A tumormarkerek egyik legsikeresebb alkalmazása a csírasejtes daganatok kezelésének monitorozása és a beteg utókövetése. Sajnos, a borgyógyászati onkológiában jelenleg nincsen olyan ideális tumormarker, mely minden stádiumban megfeleloen specifikus és kelloen szenzitív lenne. 3. Melanoma malignum keringo tumormarkereinek áttekintése 3.1. Melanomához asszociált antigének a. Melanoma inhibitory activity (MIA) 11 kda molekulasúlyú protein, melyet HTZ-19 melanoma sejtvonalból izoláltak 1989- ben (23). A növekedés gátló, az invázió és disszemináció szabályozásában feltehetoen részt vevo, a melanoma sejtek és az extracellularis mátrix kapcsolódását a fibronectin és laminin megkötésével akadályozó proteint melanocitás nevusok alacsony szinten, normál bor melanocitái, keratinociták, nem melanocitás tumorok azonban egyáltalán nem expresszálják (29). Nem tumoros szövetekben a MIA foleg fejlodo és érett porcszövetben található meg (27). Magas értéket észleltek még az esetek egy részében ovarium, emlo, pancreász, colon rosszindulatú daganatban. A proteint a 19q13.32-33 génszakasz kódolja és a DNS szekvencia teljes egészében ismert (26,101). A szérum koncentráció meghatározása MIA ELISA teszttel történik (27,28). Emelkedett szérum koncentráció a malignus melanociták fokozott expressziója következtében megfigyelheto melanoma malignumban, emellett elorehaladott emlo és colon carcinomában, glia-sejtes tumorokban (71). Klinikai értékelése kapcsán melanoma malignumban Bosserhof III-as és IV-es stádiumban 100% -os szenzitivitást észlelt, továbbá S-100B proteinnel és sicam-1 koncentrációkkal 462 betegen összehasonlítva a legérzékenyebb markernek találta. Azonban I-II-es stádiumban a MIA pozitiv betegek nem mutattak korrelációt a Breslow szerint mért tumorvastagsággal (27). Késobbi munkájában terápia monitorozásra és metasztázis kimutatásra egyaránt alkalmasnak tartotta (28). Stahlecker 326 beteget elemzo közleményében melanomában Stádium III- IV-ben szintén magas 60-89,5% szenzitivitást észlelt, betegkövetésre és metasztázis diagnosztizálására szintén megfelelonek találta (160).

9 A MIA meghatározásra újabban kifejlesztett RT-PCR technika segítségével figyelemre méltó pozitivitás (26,8%) mérheto melanomás betegeknél már stádium I-II-ben is. A IIes és IV-es stádiumban a MIA RT-PCR pozitivitás tünetes betegekben magasabbnak (34%) bizonyult, mint a tünetmentesekben (10%), stádium III-IV-ben pedig korrelált a tumortömeggel. Ugyanakkor az áttét diagnosztizálására nem volt alkalmas a teszt (121). A módszer értékelhetoségét befolyásolja, hogy alacsony szintu MIA RT-PCR pozitivitás azonban egészségesekben is kimutatható. Bár viszonylag kevés számú közlemény áll rendelkezésre MIA-val kapcsolatban, az eredmények jobbak vagy hasonlóak S-100B proteinéhez és korrelálnak az LDH szinttel IV-es stádiumú betegeken (27,28,29,46,71,113,152). b. Lipidhez kötött sziálsav, gangliozid (LKSZ) A lipidhez kötött sziálsav sejtmembrán gangliozidnak (glikolipid) felel meg, mely a szérum lipoprotein frakciójához kötodik. A sejt és extracellularis mátrix kapcsolatban, a sejtmotilitásban, az áttétképzodésben, a tumorimmunitásban szerepet játszó gangliozidokban különösen a neuroektodermális eredetu és daganatosan átalakult sejtek gazdagok. A LKSZ a sejtmembránról könnyen leválik, a szérumban lipoproteinhez kötve kering. Tumormarkerként való alkalmazására irányuló klinikai vizsgálatok 1958- ban kezdodtek, amikor Winzler, majd több szerzo, köztük Katopodis 1982-ben a LKSZ szintjét különbözo malignus tumorokban (pl. emlo és colorectalis carcinoma) emelkedettnek találta (183). Reintgen szerint az LKSZ használható markerként a progresszió megítélésére melanomában (139). Melanomában az elso nagyobb számú vizsgálatot (165 beteg/244 mérés) Gilde végezte. Vizsgálataikkal a LKSZ szint kóros emelkedését csak a melanoma áttétes formájában találták szignifikánsnak. Multiplex belsoszervi metasztázisnál magasabb arányú kóros értéket észleltek, mint többszörös boráttét esetén, amely ellene szól annak a hipotézisnek, hogy a LKSZ szintje a tumormassza nagyságát tükrözné (64). Ezzel szemben Buzaid 240 beteg vizsgálata kapcsán úgy találta, hogy a LKSZ szérum szintje korrelál a melanomás betegekben elorehaladott esetekben észlelt tumormasszával (37). A gyulladásos folyamatokban szerepet játszó akut fázis proteinek sziálsav gazdagsága miatt a meghatározásnak inkább a prognosztikus értéke van, diagnózisra és szurésre nem javasolt (33,72,143).

10 c. Neuronspecifikus enoláz (NSE) Az enolázok a glikolízis enzimjei, melyek a 2-foszfoglicerátot alakítják foszfoenolpiruváttá. Három, immunológiailag különbözo alegységbol állnak: alfa, beta, gamma. A neuron specifikus enoláz a gamma-gamma és alfa-gamma formát tartalmazza. A NSE-t 1965-ben Moore és McGregor írta le eloször (119). Megtalálható neuronokban, a periferiás neuroendokrin szövetekben, az APUD sejtekben, így a kissejtes tüdorákban és neuroblastomában. Az NSE kimutatható még egyes tumorokból, mint melanoma, seminoma, carcinoid, Merkel sejtes tumor (134). 1982-ben Prince javasolta serum markerként történo használatát neuroendocrin tumorokban (134). Azóta számosan megerosítették alkalmazhatóságát kissejtes tüdorákban, seminomában, neuroendocrin tumorokban (44). Kimutatása rádioimmunesszével történik monoklonalis antitest felhasználásával. Melanomában eloszor Lorenz és Dippold közöltek emelkedett szérum értékeket (108). Hornef szerint magasabb szérum koncentráció csak stádium IV-es melanomás betegekben észlelheto (83). Wibe vizsgálatai alapján az NSE pozitív betegek túlélése szignifikánsan rövidebb, mint az NSE negatívaké, de Bonfrer szerint a szenzitivitás az S-100B proteiné alatt marad (22,182). Klinikai alkalmazhatósága kérdéses, különösen alacsony specificitására való tekintettel. d. Tumor asszociálta antigén (TA-90 immunkomplex) A melanomás betegek szérumában a tumor asszociálta TA-90 antigen ELISA módszerrel meghatározható. Egy amerikai munkacsoport összesen 114 I-II-III-as stádiumú (AJCC stádium) melanomás beteget vizsgált. Közleményük alapján a TA-90 immunkomplex szintje korrelál a túléléssel. Multivariációs analízissel a legerosebb független prognosztikus faktornak bizonyult, mind az átlagos, mind a tünetmentes túlélést vizsgálva. A marker 78% szenzitivitással és 77% specificitással jelzi továbbá a szubklinikus metasztázisokat (99). e. S-100B protein Az S-100 protein 21000 Dalton molekulasúlyú, savas, Ca-köto kapacitással rendelkezo fehérje. 1965-ben Moore marhaagyból izolálta (119). Nevét telített ammónium sulfát

11 oldatban neutralis ph-nál történo 100%-os oldódásáról kapta. Az S-100 dimer fehérje, mely alfa és beta egységek különbözo kombinációiban (homo és heterodimer) fordul elo. Kezdetben neurospecifikusnak tartották, azonban fiziológiásan elofordul számos szövetben, így az?? dimér harántcsíkolt és szívizomban, vesében, makrofágokban, monocitákban és melanoma sejtekben. A?? dimér megtalálható a központi idegrendszer glia és Schwann sejtjeiben, az epidermalis Langerhans sejtekben. Az?? forma glia sejtekben és melanomában észlelheto. A 91 aminosavat tartalmazó szekvenciát Isobe 1978-ban határozta meg (87). Az S-100 proteinek a legnagyobb alcsaládot képviselik a Ca köto proteinek között. A családot kódoló génszakaszt 1995-ben izolálták az 1q21 kromoszóma régióban (77,148). Ezután még kilenc különbözo S-100 proteint meghatározó gént fedeztek fel. Ezt követoen a nómenklatúra megváltozott, a korábban S-100 alfa most S-100A, az S- 100 beta pedig S-100B nevet kapta (77,148). A sejtekben az S-100B kálciumot tartalmazó homo és heterodimer formában található meg, intracellulárisan, alapvetoen membránhoz kötötten. Az S100 protein család 19 tagja ismert, funkciójuk azonban ma sem teljesen tisztázott. Az elso megállapítások egyike, hogy érzékenyen jelzi az idegrendszer sérüléseit (57). Nagy valószínus éggel az intracellularis kálcium metabolizmusban játszanak szerepet. A sejtdifferentációban, motilitásban, endo- és exocitózisban, membrán permeábilitásban, apoptózisban is részt vehetnek. Baudier 1992-ben felfedezte, hogy az S-100B befolyásolhatja a tumorszupresszor protein p53-at. Az S-100B ugyanis akadályozza a p53 kalciumdependens foszforilációját in vitro. Ez vezethet a p53 tumorszupressziós funkciójának gátlásához (33). Gaynor 1980-ban mutatta ki az S100 protein jelenlétét humán melanoma sejtvonalakban. Felfedezését a melanociták neuroectodermalis eredetével magyarázta (61). A kimutatáshoz komplementfixációs tesztet használt. Napjainkban az S-100B proteint immunhisztokémiai vizsgálatok során széles körben alkalmazzák a melanoma diagnosztizálására és más malignus tumoroktól való megkülönböztetésül. A szérum S- 100B meghatározás korábban rádioimmunesszével, ma már lumineszcens immunesszével (LIA-mat Sangtec 100) történik, mely a beta alegységet detektálja, azaz mind az?? mind a?? dimért észleli (24,65). Ezért tünetmenetes melanomás betegen az S-100B protein a központi idegrenszer sérüléseinek következtében is emelkedhet.

12 Egyszerusége, reprodukálhatósága, radioaktivitásmentessége, megfelelo szenzitvitása miatt napjainkban általában a LIA-mat módszert alkalmazzák. A klinikai vizsgálatok során Fagnart 1988-ban észlelte, hogy a szérum S-100B érték disszeminált melanomában emelkedett (57). Ezt követoen keringo tumormarként való felhasználásának lehetoségeit számosan vizsgálták (175). A tanulmányok azonban, melyek a szérum S-100B szintet elemzik, az IRMA és LIA-mat módszert egyaránt alkalmazták, különbözo stádium beosztásokat használtak, változó cut -off értékkel számoltak kezelt és kezeletlen, tünetmentes és tünetes beteganyagon egyaránt. A legtöbb közlemény által alkalmazott IRMA módszer alsó határértéke 0,2 g/l volt, míg a LIA immunesszének a funkcionális alsó határa ennél tízszer alacsonyabb, 0,01 g/l. Ezért a különbözo eredmények összehasonlítása nehézkes. Egy német és egy svájci munkacsoport határozott meg eloször 126 és 73 beteg elemzése kapcsán stádiumfüggo emelkedett marker koncentrációkat. A szenzitivitás stádium I-II: 1,3/4%, stádium III: 8,7/21,4%, stádium IV: 74/79%-nak bizonyult (65,78). Az eredményeket egy svéd közlemény is megerosítette, 643 beteg eredményeinek feldolgozásával. Kifejezett korrelációt találtak a szérum koncentrációk és a túlélés között. Ennek alapján az S-100B megfelelo cut off érték esetén stádiumtól független prognosztikus markernek bizonyult melanomában (153). Egy késobbi közleményben ezt megerosítették, és javasolták, hogy az S100 kerüljön be a klinikai "staging"-be (154). Hauschield 1999-ben 412 melanomás beteg 1339 szérum mintájából hasonló eredményeket publikált. Cut off értékként 0,2 g/l-t alkalmazva stádium I-II-ben (primer tumor) 1,7%, stádium III-ban (locoregionális érintettség) 19,2%, stádium IV-ban 68% szenzitivitást észlelt. A cut off szintet meghaladó S-100B protein koncentrációjú betegek átlagos túlélése stádiumtól függetlenül szignifikánsan rövidebbnek bizonyult a többi betegénél (73). Wollina 371 mintában a stádium III és IV betegek értékei között szignifikáns különbséget észlelt. A marker 97% specificitással és 65% szenzitivitással különböztette meg a tünetmentes betegeket a tünetesektol (186). Bonfrer vizsgálatai során a kapott eredményeket erosen specifikusnak, de különösen kezdeti stádiumban alacsony szenzitivitásúnak észlelte, ezért további vizsgálatokat szorgalmazott (24). Hanson a magas rizikójú esetek kiszurésére és terápia monitorozásra tartotta alkalmasnak a vizsgálatot, és szoros összefüggést észlelt a túléléssel (68). A legnagyobb számú vizsgálatot Martenson végezte 1007 betegen. Eredményei alapján azt tapasztalta,

13 hogy az S-100B protein szint független prognosztikus faktor a klinikai II-es és III-as stádiumban, míg I-es stádiumban csak 12%-ban észlelt emelkedett értékeket (112). Guo 1995-ben eloször jelentette ki, hogy a vizsgálat metasztatikus melanomás betegeknél terápia monitorozásra alkalmas, amit a késobbiekben Henze ugyancsak alátámasztott (65,78). Kisszámú betegen ugyan, de Henze és Bonfrer hasonló eredményeket publikáltak. Bonfrer szerint 0,16 g/l cut off értéknél a betegek 63%-ában a marker 99%-os biztonsággal képes jelezni a daganatot (25). Hauschield nagyobb számú beteget felölelo közleményében korreláció mutatkozik a terápiás válasz és a szérum koncentrációk között. A kezelésre nem reagáló betegek szérum szintjei magasabbak voltak a terápia megkezdése elott, mint a javuló betegek koncentrációi (73). Számos szerzo szerint a terápia alatt az emelkedo S-100B protein értékek progresszióra utalnak, míg a csökkeno koncentráció a terápiás választ jelzi (65,74,78). Ez a megállapítás gyakorlati jelentoségu, mivel befolyásolhatja a terápiás stratégiát. A betegkövetés kapcsán a szérum S-100B koncentráció a klinikailag vagy eszközös vizsgálatokkal észlelheto metasztázis elott megemelkedhet. A közlemények ezzel kacsolatban rendkívül eltéro eredményeket közölnek. Schlagenhauf 411 monitorozott betegnél 41 esetben észlelt progressziót és 19,5%-ban az S-100B emelkedése volt e metasztatizáció elso jele (151). A szérum koncentráció kis számú esetben ugyan, de közel 50%-ban megelozte az áttét kimutatását Bonfrer vaccinával kezelt betegeiben (25). Jury melanoma monitorozása kapcsán 11 (85%!) esetben a 13 újonnan észlelt disszeminált melanomás beteg közül az S-100B emelkedése 5-23 héttel megelozte az áttét konvencionális módszerekkel történo kimutatását (92). Összehasonlító vizsgálatok során Miliotes a lipidhez kötött sziálsavat és az S-100B protein koncentrációkat értékelte közleményében. Az S-100B protein emelkedése szignifikáns korrelációt mutatott a recidíva megjelenésével és a túléléssel, szemben a lipidhez kötött sziálsavval (115). Berking az S-100B proteint tartja a legérzékenyebbnek (IV-es stádiumban szenzitivitás 80%) a metasztázis kialakulásának jelzésére, szemben a multimarker RT PCR-ral vizsgált tyrosinase, Melan-A, MAGE-3, gp-100 45,5%-os szenzitivitási értékeivel (20). Tofani 53 betegen elvégzett vizsgálata alapján I-II-es stádiumban csak NSE emelkedést észlelt. Összességében azonban NSE emelkedést 26%-ban, míg kóros S-100B proteint 30%-ban mért, stádium IV-ben pedig a szenzitivitás NSE esetén 34%-nak, míg S-100B proteinnél 55%-nak bizonyult (169).

14 Bonfrer 251 beteget felölelo az S-100B proteint és NSE-t értékelo munkájában az S- l00b protein 79%-os szenzitivitással szignifikánsan jobb markernek bizonyult a neuronspecificus enolase 42%-os pozitivitásánál (24). Djukanovic munkájában 65 beteg 271 mintáját elemezve S-100B protein esetében 81,5%-ban, míg MIA-nál 73,8%-ban észlelt korrelációt a markerkoncentrációk és a betegség lefolyása között. MIA esetében azonban a fals negatív eredmények száma 32,5% volt, szemben az S100B-vel kalkulált 20%-kal (50). Az S-100B protein és LDH közti összefüggést a LDH fejezetben elemzem. A legújabb közlemények már a klinikai gyakorlatba próbálják illeszteni az S-100B protein méréseket. Vizsgálják például, alkalmas-e az S-100B koncentráció mikrometasztázisok jelzésére a szentinel nyirokcsomóban. A nemleges válasz a fentiek alapján tulajdonképpen várható, hiszen a szenzitivitás az AJCC III-as stádiumban szinte minden korábbi értékelésben igen alacsonynak bizonyult (1). Elemzik továbbá a fals pozitív eredmények lehetséges okait: más tumorok máj metasztázisaiban, valamint primér májrákban, májcirrhozisban ugyancsak emelkedett értékeket észleltek. Egészséges egyéneknél bizonyos vesebetegségek állhatnak a fals pozitivitás hátterében (118). Vizsgálatok tárgyát képezte továbbá, a szérum S-100B eredete és fél életideje. A sejtelhalás következtében a keringésbe kerülo tumormarker fél életidejét 30 percben határozták meg izolált végtagperfúzió során (63). Gyermekekben, mivel az idegszövet és a porcszövet, amelyekben az S-100B protein szintén kimutatható, még jelentosen fejlodik, megfelelo referencia értékek meghatározása szükséges (85). A vizsgálatok értékelése kapcsán problémát jelenthet esetleges központi idegrendszeri sérülés, mely szintén növelheti a szérum S-100B protein szintet. Továbbá, hogy egészségesekben is mértek már magasabb szérum értékeket (X,XI,170). Összefoglalva elmondhatjuk, hogy az S-100B protein a legjobban vizsgált tumormarker. Klinikai alkalmazása legcélszerubb stádium II-III-IV-ben prognosztikus célból, terápia monitorozásra és betegkövetésre.

15 3.2. A melanin szintézis enzimjei és metabolitjai a. Tirozináz A tirozináz a melanin bioszintézis egyik kulcsenzime. Megfelelo lenne melanomában tumormarkernek, mivel a melanociták expresszálják. Sonesson egyik tanulmányában emelkedettnek észlelte a szérum tirozináz aktivitást elorehaladott melanomában (159). Az RT-PCR technika használata a melanocita sejtekre specifikus tirozináz mrna meghatározásával lehetové tette a tirozináz pozitív, azaz keringo melanoma sejtek kimutatását a perifériás vérben (158). Azonban Reinhold és munkatársai szerint a keringo melanoma sejtek közül csak néhány életképes és tartja meg proliferációs képességét. Az in vivo metasztázis képzo tulajdonság számos egyéb faktortól is függ, mint például a célszövetben való megtapadás, növekedési potenciál, a szervezet immunválasza. A tanulmány szerint kevesebb mint 0,01%-a ezeknek a keringo tumorsejteknek vezet végül metasztázis kialakulásához (98,138). A keringo melanoma sejtek inkább a meglévo mikrometasztázist jelzik, mint a szisztémás betegség lehetséges kifejlodését prognosztizálják (138). A nagyszámú megjelent publikációban IV-es stádiumban a módszer szenzitivitása rendkívül széles skálán mozog. Brossart 1993-ban 100%-os szenzitivitást észlelt disszeminált betegeknél, ezt azonban a késobbiekben megismételni nem sikerült (34). Tsao 127 közleménybol válogatott és végül is 23 publikációt és 1799 beteget tartalmazó rendkívül rés zletes elemzése alapján a specificitást 100%-nak találta. A szenzitivitás azonban a stádiumtól függoen változik. Stádium I/II-ben 18/29%, míg stádium III-ban 30% stádium IV-ben is csak 45% átlagosan (170). A legújabb vizsgálatok alapján disszeminált betegek esetében a szenzitivitás IV-es stádiumban 60-70% között mozog, az RT-PCR emelkedés egyértelmuen rövidebb túléléssel jár (135,137). Amennyiben az RT-PCR pozitivitás metasztatikus képességgel bíró keringo melanoma sejteket jelez, úgy stádium III-ban 60-70%, stádium IV-ben 100%-os pozitivitást kellene észlelnünk. Ez segítene meghatározni az adjuváns vagy agresszív, kombinált kemoterápia bevezetését. A módszert kérdésessé teszi, hogy a melanoma sejtek megjelenése a keringésben nem folyamatos, hanem intermittáló, amit a metasztázisok

16 random kialakulása is alátámaszt. Valamint, hogy a melanoma sejtek csak átmenetileg perzisztálnak a véráramban (138). A vizsgált közlemények egymástól jelentosen eltérnek, mind a beteganyag kiválasztásában, mind az elért eredményekben. A tirozináz RT-PCR módszer megítélését ára és idoigényesssége is jelentosen befolyásolja. b. Alfa-melanocita stimuláló hormon (alfa-msh) A hipofízis alfa-msh hormonja felelos a melanociták megnövekedett melanin szintéziséért, ennek következtében a bor sötétebbé válásáért. Szérum alfa MSH meghatározással igen kevés tudományos munka foglalkozik. Emelkedett értékeket mértek terheseknél, PUVA terápia kapcsán és egy tanulmányban a melanomás betegek 34%-ánál, stádiumtól függetlenül. Az IRMA-val meghatározott szérum szintek tükrözték a terápiás választ. A szerzok véleménye szerint a megnövekedett szérum koncentráció pozitív feedback következtében létrejött centrális hormontermelés fokozódás következménye lehet, a bor irradiációjához hasonló módon, nem pedig a daganatos szövet megnövekedett szekréciójának eredménye (62). c. 6-hidroxi-5-methoxiindol-2-karbolsav (6H5M12C) Indol derivatum, a barnásfekete eumelanin metabolitja. Horikoshi szerint a 6H5MI2C koncentráció korrelálhat a borszínnel. Mind Karnel mind Horikoshi melanomás betegeken csak végstádiumban észlelték az érték emelkedését, akkor azonban kiugróan magas koncentrációkat mértek, vizeletben és szérumban egyaránt (81,96). d. 5-S-ciszteinildopa (5-S-CD) Az 5-S-ciszteinildopa a melanocitákban és melanoma sejtekben zajló melanin szintézis köztiterméke. A tirozinból kiinduló melaninképzodés kapcsán DOPA, dopaquinone majd 5-S-ciszteinildopa keletkezik, mely a vörösesbarna feomelanin képzodést eredményezi (1. ábra). A folyamatban jelentos szerepet játszik a tirozináz enzim, az elso két lépés katalizásával, melynek során a tirozint dopavá hidroxilálja, ezt a követoen dopaquinonná oxidálja. A reakcióhoz cisztein jelenléte is szükséges (18,19,136). A pigmentképzodés során három különbözo kémiai szerkezetu köztitermék jön létre: fenol (Dopa, azaz 3-4 dihidroxifenilalanin), fenol-tiol konjugátum (5-S-ciszteinildopa) és

17 indol (5,6 dihidroxiindol). Mivel e fenti köztitermékek a melanin szintézishez kapcsolódnak, a melanocitákra és melanocitás léziókra erosen specifikusaknak kellene Tirozin DOPA tirozináz DOPAquinon cisztein 5-S-CISZTEINILDOPA 5,6 dihidroxiindol eumelanin feomelanin lenniük. 1. ábra A pigmentképzodés folyamata. A tirozinból kiinduló pigmentképzodés során cisztein jelenlétében a tirozináz katalizálta reakcióban eumelanin és feomelanin képzodik. Az 5-S-CD keletkezésének másik lehetséges módja, hogy glutation hozzáadásával a dopa-kinonból glutation-dopa képzodik, mely 5-S-CD-vé alakulhat a gamma glutamil transzpeptidáz segítségével (117). Westerhof munkája alapján az 5-S-CD egy peroxidáz katalizálta reakcióban is képzodhet, nem csak melanocitákban. Ez a tény magyarázhatná esetleg az 5-S-CD mérhetoségét albinókban (181). Az 5-S-ciszteinildopa jelenlétét 1973-ban Rorsman mutatta ki fluorimetriával szövetekbol és vizeletbol (142). Az 5-SCD szérumból és vizeletbol egyaránt mérheto (2,3,4,67,93). A szérum 5-S-ciszteinildopa kimutatására szolgáló, és az utóbbi idoben általánosságban használt magas nyomású folyadékkromatográfiát Hansson publikálta 1978-ban, majd Kagedal alkalmazta vizelet értekek meghatározására 1983-ban (67,88,93). Immunhisztokémiai meghatározásra is lehetoség nyílott 1993-tól a Liu által kifejlesztett monoclonalis antitesttel (107). Az 5-S-CD eredmények értékelése során bizonyos speciális, csak erre a markerre jellemzo tulajdonságokat is figyelembe kell vennünk (164). Például, a szérum 5-S-CD koncentráció nem korrelál a korral, nemmel, fajjal, haj- és borszínnel, annak ellenére, hogy a marker keletkezése szorosan kapcsolódik a pigmentképzodéshez (127,162). Megfigyelheto azonban az 5-S-CD szérum szintjének bizonyos szezonális ingadozása (127). Wakamatsu közleményében az egyedi értékek nem emelkednek a normálérték fölé, noha a kora nyári 5-S-CD átlagértékek a téliekének a kétszeresei (177). Bizonyos fiziológiás, illetve patológiás körülmények között azonban, amikor a melanocita aktivitás növekszik, az 5-S-CD szint is emelkedhet. Pszoriázisos betegek PUVA kezelése, UV-A és UV-B irradiáció, gyulladásos folyamatok esetén az 5-S-CD

18 koncentrációja egyértelmuen növekedhet. A vizsgálatok alacsony betegszáma, a statisztikai elemzések hiánya (volt-e az egyes értékek között szignifikáns különbség) miatt azonban még ezen tanulmányok eredményei sem meggyozoek a szérumszint ingadozásának tekintetében (165,166). Ellentmondásos az amelanotikus daganatok és az 5-S-CD kimutathatóságának megítélése. A legtöbb szerzo szerint szerint a pigment képzodés a melanocitákban zajlik, míg mások egyéb lehetoséget sem tartanak kizártnak. A tanulmányok többsége alapján amelanotikus daganatok esetében az érték nem emelkedik, ezt állatkísérletek is alátámasztják (80,84). Ezzel szemben Wimmer nem talált különbséget a szérum koncentrációkban a IV-es stádiumú amelanotikus és melanotikus metasztázissal bíró betegeinél (184). Eloször a vizelet 5-S-CD koncentráció és a melanoma kapcsolata képezte a kutatások, klinikai vizsgálatok tárgyát (2,3,4,90,96,162). B16 melanómás egereken végzett állatkísérletekben a vizelet 5-S-CD értéke jól korrelált a tumortömeggel (89). Az elso, nagyobb beteganyagot felölelo közlemény Agruptól származik, aki 5 éves tapasztalata alapján (571 beteg) a magas vizelet 5-S-CD értékeket betegeinél prognosztikus jelentoségunek tartotta a metasztatizáció és túlélés vonatkozásában (4). Meyerhoffer nagyméretu, kongenitális nevusos gyermekeknél a nevus növekedésének, esetleges malignizálódásának monitorozására ajánlja a vizelet 5-S-CD szint mérést (114). Sasaki vizsgálatai (50 beteg) szerint az emelkedett vizelet 5-S-CD szint melanomás betegeknél távoli metasztázisra utal és prognosztikus információt hordoz (146). Karnell 430 beteget elemzo, 2000-ben megjelent közleményében a vizelet 5-S-CD szenzitivitását IV-es stádiumban 83%-nak találta. Szoliter távoli metasztázis esetében a betegek 50%-ában emelkedtek az értékek, míg többszörös szervi áttétet minden esetben megnövekedett szérum koncentráció kísért (95). A szérum és vizelet 5-S-CD értékek összehasonlítása kapcsán állatkísérletekben Wakamatsu úgy találta, hogy a szérum 5-S-CD jobban korrelált a tumortömeggel, mint a vizelet értékek (176). Ezt megállapitást human kísérletekben is sikerült megerosítenie (178). A szérum 5-S-CD vizsgálatok elemzése késobb került az érdeklodés eloterébe, és jelenleg sem áll nagyszámú közlemény rendelkezésre. A tanulmányok általában kevés beteget vizsgálnak. Állatkísérletekben, melanoma modell rendszerben a plasma 5-S-CD szint korrelált a primer tumor nagyságával. Az emelkedett 5-S-CD koncentráció

19 kapcsolatban volt a pigmentációval, azaz amelanotikus melanománál nem észlelték a marker szintek emelkedését (84). Peterson diszplasztikus nevus szindrómás és különbözo stádiumú melanomás betegek koncentrációinak összehasonlításával vizsgálta az 5-S-ciszteinildopa szinteket. A diszplasztikus nevus szindrómás betegek értékei a normáltartományban mozogtak, míg a melanomás betegeké a stádiummal és prognózissal korrelált (133). Tünetmentes melanomás betegek esetében a szérum és vizelet értékek a kontrollokéhoz hasonlóak. Metasztázis kialakulásakor azonban a szérum koncentráció emelkedése néhány esetben (7/9) már az áttét megjelenése elott észlelheto volt (82). Hasegawa kisszámú beteganyagában is alkalmazhatónak tartja a szérum 5-S-CD meghatározást korai metasztázis észlelésre más markerekkel kombináltan (69). Hirai csak a IV-es stádiumú betegeinél észlelt emelkedett 5-S-CD szintet (80). Wimmer melanomás betegeinél az 5-S-CD-t kemoimmunterápia monitorozásra használta. Alkalmasnak találta a szérum 5-S-CD értékek változását a kemoimmunterápiára reagáló és nem reagáló betegcsoport elkülönítésére, terápia monitorozásra. Ezenkívül megfelelo prognosztikus faktornak tartotta a túlélés idejének megítélésére is. (184). Érdekes részeredmény, hogy a primér tumor jelenlétében mért emelkedett szérum koncentráció a mutéti kezelés után visszatért a normálisra, de nem bizonyult elég érzékenynek a következményes metasztatizáció megítélésére. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a közlemények szerint a szérum 5-S-CD szint stádiumtól függoen emelkedik, kifejezetten azonban csak IV-es stádiumban (80,81). A magasabb 5-S-CD szint progressziót jelezhet, néha az eszközös vagy fizikális vizsgálatoknál korábban (69,80,82,133), valamint alkalmas terápia monitorozásra is (70,184). Összehasonlító vizsgálatok során Hirai szoros korrelációt észlelt a szérum 5-S-CD és sicam-1 között. Mindkét marker jól korrelált a progresszióval, azonban az 5-S-CD szint csak IV-es stádiumban emelkedett (80). Hasegawa párhuzamosan végzett 30 betegen 5-S-CD, sicam-1 és sil-2 vizsgálatokat. A progresszió megítélésre az 5-S- CD-t tartotta a legalkalmasabbnak (69). Horikoshi négy melanin metabolitot értékelve az 5-S-CD-t találta a legmegfelelobb markernek progresszív melanomában. A szérum 5- S-CD emelkedés megelozte a metasztázis hagyományos módszerekkel történo kimutatását (81). Karnell szérum S-100B protein, vizelet 5-S-ciszteinildopát és 5-

20 hidroxi-6-metoxiindol-2-karbolsav párhuzamos eredményeit elemezve arra következtetésre jutott, hogy mind az S-100B protein, mind az 5-S-CD jól korrelál az átlagos túléléssel (95). Érdekes kérdésként merül fel, vajon lehetséges-e a melanoma kezelése a melanogenezisen keresztül, azaz tirozin analógokból eloállított citotoxikus anyagokkal? Ígéretes próbálkozásnak bizonyultak a 4-S-ciszteaminilfenollal, valamint aktivált formájának a 4-S- ciszteaminilkatekollal melanoma sejtvonalakon végzett in vitro és in vivo vizsgálatok. Az utóbbi vegyület citotoxikus hatása a melanocitákra a tirozináz aktivitástól függ. Sajnos azonban ezek az anyagok általában primeren toxikusak és farmakokinetikájuk kedvezotlen (86,141). 3.3. Citokinek Interleukin-2, interleukin-6, interleukin-8, interleukin-10 Alapveto immunológiai és nem immunológiai folyamatok specifikus regulátorai, melyek melanoma sejtekben is termelodnek (30,149). Hatásmechanizmusuk szempontjából pro-inflammatorikus (IL-2) és anti-inflammatorikus (IL-10) különböztetünk meg. Kimutatásuk ELISA teszttel történik. a. Interleukin 2 Boyano különbözo stádiumú melanomás betegeket vizsgálva arra a következtetésre jutott, hogy az IL-2R szint valamennyi stádiumban szignifikánsan különbözik a normál kontrolloktól, továbbá korrelál a progresszióval. Összesen 172 I-III stádiumú melanomás beteg monitorozása kapcsán távoli disszemináció kifejlodése során a betegek 57%-ában emelkedett meg az IL-2R érték. A magas IL-10 koncentráció rosszabb prognózisra utalt (30). b. Interleukin 6, interleukin 8 Scheibenbogen disszeminált melanomás betegeknél 21/56 esetben mért magasabb szérum IL-8 szintet ELISA teszttel. Szignifikáns korrelációt észlelt a tumortömeggel, a metasztázis helye azonban indifferensnek bizonyult (149). Mouawad vizsgálataiban az IL-6 szint stádium IV-ben szintén magasabb volt (120).

21 c. Interleukin 10 Nemunaitis 41 disszeminált melanomás és 50 egészséges önkéntes szérum IL-10 összehasonlító vizsgálata alapján úgy találta, hogy a marker alkalmas a két csoport elkülönítésére és az emelkedett IL-10 szint rossz prognózist jelzett (126). Dummer IVes stádiumú melanomás betegeknél 72%-ban (29/42) talált pozitív IL-10 tesztet (52). Vuoristo 50 elorehaladott melanomás betegénél megállapította, hogy több szervi metasztázis (elsosorban hepar és csont) magasabb szérum IL-10 és IL-6 koncentrációkkal jár. Ennek alapján a tumortömeg mérésére illetve a metasztázis helyének jelzésére szolgáló markerek lehetnének (173). A melanoma sejtekbol származó citokinek és adhéziós molekulák szerológiai meghatározásával lehetoség nyílik a tumor és a szervezet immunviszonyának vizsgálatára, prognosztikus következtetések levonására (30,120). A fellelheto közlemények általában alacsony betegszáma, a vizsgált különbözo stádiumú beteganyag, az interleukinok gyulladásos és autoimmun folyamatokban a való részvétele, a gyakran alkalmazott immunterápia, az eltéro következtetések miatt általánosságban azt mondhatjuk, hogy melanomában tumormarkerként egyelore nem alkalmazhatók. 3.4. Metalloproteinázok A különbözo tumorok invazív képessége többek között függ a metalloproteináz enzimektol, melyek cink dependens endopeptidázok, és a tumorsejtek környezo szövetbe történo migrációját segítik elo, így szerepet játszanak az invázióban és tumor metasztatizációban. A meghatározás ELISA tesztekkel történik. Az MMP-2 (mely gelatinázként ismert) expresszálódik humán melanomában. Wollina 337 mintát elemzett, összehasonlítva az adatokat a stádiummal, a metasztázis meglétével valamint S-100B és sicam-1 koncentrációkkal. A mért szérum értékek között szignifikáns korrelációt tapasztalt. Ennek ellenére az egyes stádiumok és a metasztatizáló/nem progrediáló betegek szérum szintjei között a különbség nem volt szignifikáns (185). Vuoristo 50 távoli disszeminációban szenvedo, kemoimmunterápiában részesülo

22 beteget vizsgált. A kiindulási értéket nem találta prognosztikus szempontból alkalmazhatónak. A mért szérum koncentrációk nem voltak jellemzoek a metasztázis helyére és a túlélésre (174). Az eredmények azt mutatják, hogy ezek a vizsgálatok melanomában tumormarkerként való alkalmazásra nem megfeleloek. 3.5. Adhéziós molekulák a. Intracellularis adhéziós molekula (ICAM-1) Az adhéziós molekulák sejtmembrán proteinek, melyek alapvetoen fontosak a sejt-sejt és a sejt-környezethez való kapcsolatában. Immunológiai, gyulladásos, sebgyógyulási és metasztázis képzo folyamatokban vesznek részt. ELISA tesztekkel határozhatók meg, specificitásuk alacsony, mivel sokféle folyamatban játszanak szerepet. Citokinekkel (interferon, interleukin) kezelt betegek sicam-1, svcam-1 monitorozása nem célszeru, mivel ezek képesek másodlagosan az adhéziós molekulák szintjét növelni (72). A közlemények eredményei ellentmondásosak. Míg Altomonte stádiumtól függoen a melanomás betegek 95%-ában észlelt emelkedett ICAM-1 koncentrációt, Viac nem talált különbséget a primer tumoros és disszeminált betegek szérum értékei között, Vuoisto szerint pedig a magas sicam-1 szint hepatikus áttétre utal (5,172,173). Schadendorf vizsgálata során 34 betegnél a marker korrelált a tumortömeggel és a melanoma progressziójával (147). b. Vascularis sejt adhéziós molekula (VCAM-1) Francke 97 IV-es stádiumú beteget elemzo tanulmányában a svcam-1 független prognosztikus faktornak bizonyult az emelkedett LDH-val együtt és korrelált a túléléssel. A magasabb svcam-1 és LDH koncentráció alapján a betegek különbözo rizikócsoportba sorolhatók (60).

23 3.6. Szérum réz és cink, ceruloplasmin Ros-Bullon 35 különbözo stádiumú melanomás beteg és egészséges kontroll személy szérum réz koncentrációinál alapveto különbségeket nem észlelt. Ezzel szemben a szérum cink szint szignifikánsan emelkedett a melanomás betegeknél. A módszer szenzitivitását átlagosan 86,5%-nak találta (144). A szérum ceruloplazmin szintet a fenti szerzo 64 melanomás betegnél valamint egészségesekben értékelte. Az eredmények alapján a két csoport egymástól a szérum ceruloplazmin szint alapján elkülönítheto (145). 3.7. Laktátdehidrogenáz (LDH) A laktátdehidrogenáz a tejsavas erjedés befejezo lépését (melynek során a tejsavból nikotinsavamin-adenin-dinukleotid jelenlétében piröszolosav és redukált NAD képzodik) katalizálja mindkét irányban. A különbözo szövetekben öt izoenzim fordul elo, melyek négy alegységbol épülnek fel (tetramerek). A tetramerek kétfajta monomer kombinációból alakulnak ki. Az egyes szervekben a monomerek különbözo arányban szintetizálódnak, ennek következtében alakul ki az egyes szervekre jellemzo izoenzim spektrum. Az összes laktátdehidrogenáz aktivitás 40-60%-át a máj eredetu ötös izoenzim fejti ki, ugyancsak 40-60% származik a szívizom eredetu egyes és kettes izoenzimbol. Az LDH-nak prognosztikus értéke van számos tumorban, így kis sejtes és nem kis sejtes tüdorákban, limfómákban, prosztat arákban, leukémiában. Az emelkedett szérum LDH és a melanoma kapcsolata már az 1950-es években felmerült Hill közleményében (79). Ezután számos szerzo elemezte az LDH, mint melanoma marker értékét. 1974-ben nagy beteganyag értékelése kapcsán Einhorn úgy találta, hogy szinte minden, ultrahanggal igazolt metasztázisban a szérum LDH koncentráció megemelkedett. Ezzel szemben, a magasabb LDH koncentrációjú összes betegnél csak az esetek 46%-ában sikerült igazolni hepatikus érintettséget. Ez felvette, hogy az LDH esetleg más szövetekbol került a keringésbe. A másik lehetoség, hogy az UH vizsgálat esetenként fals negatív eredményt ad (54). 1983-ban Finck 121 klinikai II-es stádiumú melanomában szenvedo beteget követett sorozatos LDH vizsgálatokkal. Az LDH a progressziót és a hepatikus

24 érintettséget 72/95% szenzitivitással és 97/82% specificitással jelezte. Az esetek 12,5%- ában az emelkedett LDH érték utalt eloször a metasztázisra (58). Magas LDH koncentrációt észleltek melanomás betegekben multiplex nyirokcsomó, valamint hiláris és mediastinális érintettség esetében is (94). Egy olasz tanulmány I-es stádiumú melanomában 20% LDH szenzitivitást említ. A magas LDH-val rendelkezo betegek túlélése szignifikánsan rövidebb volt (38). Ezt a tényt uveális melanomában, hepatikus metasztázis esetében is megerosítették (17). Elorehaladott regionális vagy távoli metasztázisnál a normálértéket meghaladó LDH független prognosztikus faktornak bizonyult (157). Egy norvég tanulmány, mely az LDH-t mint prognosztikus markert vizsgálta, megállapította, hogy agyi metasztázis esetében, melyet 450 U/l-nél nagyobb LDH érték, leukocitózis és gyorsult süllyedés kísér, az átlagos túlélés várhatóan 3 hónapnál rövidebb. Az emelkedett LDH szint korrelált a hepatikus érintettséggel, valamint a tumortömeggel (76). Manola vizsgálatai alapján metasztatikus melanomában az áttét helyének és a magas LDH értékeknek van prognosztikus szerepe a túlélés szempontjából (109). Az utóbbi években már összehasonlító vizsgálatok eredményeit is közölték. Buer szerint IV-es stádiumban többváltozós analízissel a szérum S-100B-nek nincs további prognosztikus értéke az LDH-hoz képest (35). Francke 97 áttétes melanomás betegen az svcam-1, sicam-1 és LDH szérum koncentrációk értékelése kapcsán úgy találta, hogy az LDH és a svcam-1 dominálóan visceralis és tüdometasztázisban független prognosztikus faktor, és az emelkedett kezelés elotti szérum szint kedvezotlen prognózist jelez (60). Krahn 373 különbözo stádiumú melanomás beteg S-100B, MIA, albumin és LDH értékeit összehasonlítva szérum S-100B proteint találta a legmegfelelobb markernek 86%-os szenzitivitása miatt, szemben a MIA 80% illetve az LDH 48%-os szenzitivitásával. Specificitás szempontjából azonban az LDH (98%) kissé megelozte a 91%-os S-100B-t és a 62%-os MIA-t (103). Deichmann 71 disszeminált melanomás betegénél ugyancsak a szérum S-100B, MIA és LDH méréseket végzett. Hasonló eredményeket kapott. Az LDH bizonyult a legspecifikusabbnak (92%), azonban S-100B-val 91%, MIA-val 88% szenzitivitást észlelt. Mindhárom mar ker emelkedése a betegség progressziójára utal, de a legjelentosebbnek az LDH-t tartja (46). A IV-es stádiumú betegeken az LDH képes megkülönböztetni a progrediáló betegeket a nem progrediálóktól, míg a terápia elotti S- Megjegyzés: ez mi?

25 100B szint a leginformatívabb a betegség kimenetelét illetoen (46). Egy másik tanulmánya szerint az S-100B és a MIA multivariációs analízissel nem bizonyult jobbnak az LDH-nál metasztatikus melanómában (47). Hauschield 64 disszeminált melanomás beteg szérum mintáinak analízise kapcsán az S-100B-t hasonlította össze a hagyományos, vérbol meghatározott parameterekkel. Multivariációs analízissel csak az S-100B bizonyult szignifikáns független prognosztikus faktornak (75). Összefoglalóan elmondhatjuk, hogy a számos elemzés elsosorban disszeminált melanomában észlelt emelkedett LDH értékeket. A magasabb szérum LDH szint tükrözheti a tumortömeget, a betegség aktivitását, és prognosztikus faktorként szolgálhat. Nem elhanyagolható szempont azonban, hogy szöveti sérülések kapcsán, például miokardiális infarktusban, hemolízisben az LDH koncentráció szintén növekedhet. A fenti irodalmi áttekintés alapján valamennyi, jelenleg vizsgált tumormarkernek minosítheto anyag elorehaladottabb stádiumban magasabb koncentrációban mérheto. Legígéretesebbnek, mind prognosztikus szempontból, mind a terápiás válasz tekintetében az S-100B protein, a MIA, a tirozináz RT-PCR illetve IV-es stádiumban az LDH bizonyult.

26 4. Tumorszöveti immmunhisztokémiai markerek (S-100B protein, AMF receptor) Az S-100 proteint Gaynor 1980-ban mutatta ki human melanoma sejtvonalakból (M12, M14, M15, M19, M29) komplement fixációs teszttel. A melanociták neuroektodermális eredetuek, ez adta az ötletet glia sejtekben már felfedezett S-100 protein vizsgálatára (61). Korábban számos agytumorban (astrocitoma, glioblastoma, oligodendroglioma, akusztikus neurinoma) észleltek komplement fixációval különbözo mennyiségu S-100 proteint. A meningeoma, medulloblastoma azonban általában negatív eredményt adott. 1982-ben Nakajima immunhisztokémiai módszerrel eloször melanomában és pigmentált nevusokban határozta meg az S-100 proteint. A lentigo maligna melanoma és a melanocita eredetunek tartott kék nevusok alig vagy egyáltalán nem tartalmaztak S-100 proteint. Ezzel szemben a nodularis melanoma és a junkcionális, kompaund és intradermális nevusok, amelyek nevocitás eredetuek, változatos immunreaktivitást mutattak. Vizsgálatai során az S-100 protein intenzitása a melanin pigment jelenlétével fordítottan volt arányos (123). Más szerzok, így Cochran eredményei ezt nem erosítették meg, o az S-100 protein mennyiségét függetlennek találta a primér tumor melaninizációjától (43). Nakajima ezt követoen különbözo tumorokon végzett immunhisztokémiai vizsgálatokat. Kimutatta, hogy az S-100 protein nem specifikus az idegszövetre és tumoraira, hanem számos más tumor így carcinoidok, chordoma, chondrosarcoma, nyálmirigy pleiomorf adenoma, emlorák ugyancsak pozitív eredményt adhat (124). Cochran 1985-ben megjelent közleményében az S-100 proteint tartalmazó tumorok széles skáláját ismerteti (42). Böni vizsgálatai alapján az S100B megtalálható az epidermis melanocitáiban, Langerhans sejtjeiben, a dermisben a hajfolliculusokban, Schwann sejtekben, melanocitás léziókban mint nevusok, melanoma, és áttétei. Az S100A6 szintén jelen van számos, a legtöbb említett képletben (31). Napjainkban az immunhis ztokémiai módszert széles körben használják nemcsak a melanoma diagnózisában, hanem differenciáldiagnosztikai célra is (22,41,66). A monoklonális anti S -100 alfa pozitivitás a melanocitás nevusok aktivitásának jelzoje, míg a monoklonális beta reaktivitás a szuperficiálisan terjedo és a lentigo maligna melanoma vertikális progressziójára utal (41). Az S-100 protein meghatározása nem csak diagnosztikus szempontból fontos, hanem alkalmazható a tumor vastagságának mérésére, a periférián a szélek daganatmentességének

27 megítélésére (55). A melanoma azonban heterogén tumor, mind a melaninizáció, mind a különbözo proteinek, beleértve az S-100B-t is, expressziója szempontjából (7,22,41,53,66). Amerikai szerzok akrális lokalizációjú, ismételten S-100 negatív melanomákat is publikáltak (7,66). A melanoma malignum differenciáldiagnózisa számos protein mint például az S-100B, a HMB 45, a napjainkban bevezetett MART1/MelanA expresszióján alapul (22,41,66,130). Az S-100B különösen megfelelo, mivel a melanin képzodéstol független (42,43). Összehasonlító vizsgálatokban, melyek az S-100B, a HMB 45, T311 (anti-tirozináz) és a Melan-A/MART-1 immunhisztokémiai értékét vizsgálták, az S-100B maradt a melanocita differenciáció legérzékenyebb markere (22,40,129,130). Melanoma malignum diagnózisára és differenciáldiagnosztikájára rutinszeruen poliklonális S-100 antitestek használatosak, melyek szenzitívek, de nem specifikusak a melanocitás léziókra. Számos közlemény az immunhisztokémiai festodés megítélésében szemikvantitatív (eros, közepes, gyenge) módszert használ, míg mások az immunpozitív sejtek számát négyzetmilliméterenként rögzítik (66,100,104). Az immunhisztokémiai vizsgálatok kapcsán nincs eltérés a primer és a metasztatikus szövet festodése között (66). Kernohan 215 bormelanomában vizsgálta meg az S-100 protein festodés és túlélés esetleges összefüggését. Érdekes módon, az eros immunhisztokémiai reakció jobb túléléssel járt együtt (100). A primér melanoma S-100B protein expressziójának és a szérum S-100B szintjének viszonyát eddig még nem vizsgálták (XV). A melanoma metasztatikus potenciálja összefüggésben van a primér tumor nagyságával (Breslow szerinti vastagság milliméterben, vertikális vagy radiális növekedési fázis). Biológiailag a tumor heterogén, a prognozis megítélésében az egyik legfontosabb meghatározó tényezo mindmáig a primér tumor vastagsága. A melanoma invazívvá, metasztatikussá válásában potenciális szerepet játszó molekuláris markerek kutatását kifejezett érdeklodés övezi. A progresszió markerének tekintheto a p16/ink4 alfa elvesztése és a kíséro Ki-67 növekedés, az adhéziós molekulák közül az integrin????a proteázok körében a MMP-2, a motilitással kapcsolatos faktorok, a c-met receptor (167). Mindezek ellenére, a melanoma inváziójának molekuláris részletei még mindig

28 hiányosak, és a kutatómunkák egy megfeleloen érzékeny prognosztikus markerek felfedézésére irányulnak. A tumorsejt motilitása a tumor progressziójának meghatározó lépése, melyet parakrín és autokrín motilitási kémiai jelek szabályoznak (105,156). A legjobban ismert autokrín motilitási faktor napjainkban az AMF/NLK/PHI, egy 55 kd glikoprotein, amelyet rágcsáló melanomából izoláltak 1986-ban, egy kemokin receptor család tagjaként (106,122,150,179). Az AMF egy, a tumorsejt által sekretált citokin, mely befolyásolja az ot képzo sejt migrációját. Az AMF szabályozza a sejtmotilitást in vitro, valamint az inváziót és metasztázis képzodést in vivo. Az AMF stimulálja az integrin közvetítette B16a sejt adhéziót, terjedést és inváziót. Az AMF aminosav analízise magas szerin, glicin és glutaminsav tartalmat tárt fel. A tanulmányok szerint az egér és a humán AMF megfelelnek a korábban már kódolt géntermékeknek: a neuroleukinnak (NLK) és foszfohexózizomeráznak (PHI). A PHI katalizálja a glukóz 6-foszfát izomerizációját fruktóz 6-foszfáttá és mindkét cukorra specifikus. Az AMF a sejtmotilitást receptorán keresztül szabályozza. Az AMF receptor egy 78 kd sejtfelszíni glycoprotein, melyet B16-F1 melanoma sejteken határoztak meg.. AMFR elleni monoklonális antitest stimulálja a sejtmotilitást in vitro és a metasztatikus képességet in vivo, azaz hatásai az AMF-ral megegyeznek. Az AMF/AMFR rendszert számos kísérleti modellben és néhány human tumorban (epehólyag-, gatrointestinális-, nyelocsodaganat) is vizsgálták (111,125,131). A megnövekedett AMFR expresszió korrelált a recidivák számával és a túléléssel a közleményekben. Az értekezés humán primér melanomában kutatja az AMF/AMFR metasztázisképzo potenciális szerepét (CLXVIII).

29 II. Célkituzések I. Szérum S-100B protein és 5-S-Ciszteinildopa koncentrációk értékelése nagyszámú beteganyagon melanóma malignumban, valamennyi stádiumban 1. a: tünetmentes és tünetes betegeken valamint kontrollcsoportban b: AJCC stádiumokban c: disszeminált betegek marker koncentrációinak ér tékelése d: szervi metasztázis sal rendelkezo melanómás betegek marker értékei e: progrediáló és nem progrediáló melanómás betegek vizsgálata 2. A markerek specificitásának, szenzitivitásának vizsgálata. 3. Az S-100B protein és az 5-S-CD prognosztikai faktor szerepének vizsgálata 4. Az S-100B protein és az 5-S-CD közti korreláció vizsgálata 5. A túlélés vizsgálata cut off feletti és alatti marker koncentrációk függvényében 6. A markerek függetlenségének vizsgálata 7. Melanómás betegek követése, terápia monitorzás II. A laktátdehidrogenáz szérum szintjének elemzése S-100B proteinhez és 5-S- Ciszteinildopához viszonyítva melanóma malignumban 1. Az S-100B protein és 5-S-Ciszteinildopa és LDH általános jellemzoinek meghatározása (átlag, medián, szignifikáns különbségek) a: stádium III-ban és stádium IV-ben b: szoliter és multiplex áttétes betegeknél c: pulmonális metasztázisban d: hepatikus metasztázisban 2. Specificitás, szenzitivitás vizsgálata. 3.A LDH, S-100B protein és az 5-S-CD független prognosztikus faktor szerepének vizsgálata. 4. A LDH, S-100B protein és az 5-S-CD közti korreláció vizsgálata. 5. A túlélés vizsgálata cut off feletti és alatti marker koncentrációk esetén 6. A LDH, S-100B protein és az 5-S-CD függetlenségének vizsgálata

30 III. Szöveti S-100B expresszió és szérum S-100B protein koncentráció összehasonlító vizsgálata melanoma malignumban 1. Szérum S-100B koncentráció mérése az egyes stádiumokban 2. Szöveti S-100B protein expresszió meghatározása 3. Szöveti S-100B protein intenzitás vizsgálata IV. Az autokrín motilitási faktor receptor expresszió analízise primér melanomában 1. Az AMFR expresszió a tumorvastagság függvényében 2. Az AMFR expresszió a szövettani típus tükrében

31 III. Anyag és módszer 1. S-100B protein meghatározás Az S-100B protein méréseket az Országos Onkológiai Intézet központi laboratóriumában muködo tumormarker laboratórium végezte monoklonális lumineszcens immunesszével. A LIA-mat Sangtec-100 esszé megkülönbözteti az alfa1 és beta alegységet, az utóbbi mérésére alkalmas. Szolid fázisként monoklonalis antitesttel (SMST 12, SMSK 25 és SMSK 28) fedett polisztiren csövek szolgálnak. Az elso inkubáció alatt a beteg szérumában lévo S-100B reagál az antitesttel. A kötetlen anyagot egy mosási lépés kapcsán eltávolítják. A második inkubáció során a hozzáadott jelzett antitest reagál az immobilizált S-100B proteinnel. A cso falához megkötött jelzett antitest-s-100b protein komplexet fényreakcióval értékelik. A fényintenzitás arányos a mintában lévo S-100B protein mennyiségével. A normálérték az irodalmi adatoknak megfeleloen 0,01-0,12 µg/l között változott. 2. 5-S-Ciszteinildopa mérés A szérum 5-S-Ciszteinildopa meghatározás az Országos Onkológiai Intézet Biokémiai Osztályán készült. A mérésekhez Merck Hitachi gyártmányú nagynyomású folyadékkromatográfot (L-6200A típusú Intelligens Pumpát, D-2500 Chromatointegratort, AS 2000A Autosamplert és LaChrom 3500A típusú amperometrikus detektort) használtak. A szérum 5-S-Ciszteinildopa tartalmát megfelelo mintaelokészítési lépéseket (szilárd fázisú extrakció, stb.) követoen Supelcosil LC-18 (25 cm x 4.6 mm,???? fordított fázisú oszlopon választották el 35 C-on. Az áramló fázis (ph=2,2) 10 g/l foszforsavat, 0,1 mmol/l Na 2 EDTA-t valamint ionpárképzo reagensként 7 g/l metánszulfonsavat tartalmazott. Az alkalmazott áramlási sebesség 0,7 ml/perc volt. A kiértékeléshez 5-S-CD standarddal felvett kalibrációs görbét (belso standardként alfa metildopát alkalmazva) használtak. A normálérték az irodalmi adatokkal összhangban 1-10 nmol/l között mozgott.

32 Mindkét markervizsgálat minden alkalommal azonos körülmények között készült. A mintákat mínusz 20 o C-on tárolták. Az értékelést a mintavétel után két hónapon belül, a klinikai adatok ismerete nélkül végezték. 3. LDH vizsgálat Az LDH vizsgálatokat az Országos Onkológiai Intézet Központi Laboratóriuma végezte, optimalizált UV kinetikus módszerrel. Lényege: Piruvat + NADH + H* Laktát + NAD Raegensek:1. piruvat 0,6 mmol/l, tris 50 mmol/l, 2. NADH 0,18 mmol/l 7,5-ös ph-nál. A vizsgálat menete: Összekeverünk 5 térfogatrész reagens 1-et egy térfogatrész reagens 2-vel, valamint a hemolízismentes szérummal. Az adszorbanciát 30 másodperc majd 1, 2, és 3 perc után olvassuk le. Normálérték felnotteknél 37 C-on 240-460 U/L. 4. S-100B protein expresszió szöveti vizsgálata A primér tumor és nyirokcsomó áttét mintákat a szövettani vizsgálatra való elokészítéshez formalinban fixálták és paraffinba ágyazták. Az S-100B meghatározás DAKO monoklonalis S-100B ellenes antitesttel történt. Az antitest-s-100b potein kötodést egy órás inkubálás után jelzett streptovidin-biotin komplexxel detektálták (DAKO, LSAB2 HRP rendszer). Az enzim komplexet EAC (vörös) chromogénnel hívták elo. A metszeteket két patológus vizsgálta, egymástól függetlenül, a klinikai adatok ismerete nélkül. A reakciók értékelésénél a következo kritériumokat alkalmaztuk: D: Diffúz pozitív reakció az egész lézióban H: heterogén, azaz jól kifejezett pozitív/negatív festodés a tumor különbözo részein F: fokális reakció, csak néhány tumorsejt festodik (2. ábra). A festodés intenzitását szemikvantitatív módszerrel értékelve magas (+++), közepes (++) és alacsony (+) intenzitás típust határoztunk meg.

33 2.ábra. S -100 protein expresszió. A B C