Mátrix effektus a 25(OH)D-vitamint és a parathormont mérő módszerekben valamint a 2013-as QuliCont eredményekből levonható tanulságok Toldy Erzsébet, Kányási Mária, Walentin Szilvia QuliCont Fórum 2015. január 30. Budapest, Lurdy Konferencia-és Rendezvényközpont Könyves Kálmán Krt. 12-14.
Fehérjekötésen alapuló módszerek speciális hibalehetőségei I. Analittel összefüggő a standardként használt molekula nem azonos a páciensével- oka az analit in nate heterogenitása II. A biológiai minta mátrixával összefüggő Interferencia Keresztreakció Mátrix effektus
Interferencia: A mért eredményben torzítást okozó olyan szubsztancia jelenléte, amely zavaró interferenciát okoz. Jelenléte izolálható. Keveréses vizsgálat. Eltérő módszerek között is ellentmondásos leletet okozhat. Complementek, fibrinogén, EDTA, bilirubin, haemolisis,
Keresztreakció: a biológiai testnedvekben előforduló keresztreagáló metabolit, gyógyszer, vagy antitest (Rf, HAMA, HAHA, endogén antitestek) A potenciálisan keresztreagáló ágensek nincsenek jelen a standardokban és kontroll mintákban, de jelen lehetnek a beteg szérumában.
MÁTRIX EFFEKTUS: Főként a fehérjekötésen alapuló (immunoassay, protein binding assay) analitikai módszereknél tapasztalható az eredményekben olyan torzítás, amely az analit mátrix összetétel különbözőségből adódik. pl. szérum-plazma; aktív szénnel kezelt szérum-natív szérum, vagy vizelet-szérum, ascites-szérum, liquor-szérum között. A gyakorlatban a mátrix effektus jelenséget a kalibrátor görbéhez használt szérum-mátrix és a biológiai minta-mátrix között fennálló különbség okozza.
Ambient assay - R. Ekins Az eredmény függ f a biológiai minta-mátrixt trixtól Az analit és az antitest közötti kötést befolyásolja a reakciótérben lévő környezet: = analit (pl. hormon) ph-ja, ion erőssége, protein jelenléte, szintje. fehérjefrakciók mennyisége és aránya a hidrofób molekulák - döntő fontosságú a Ag-Ab Ab komplexek kialakulásához hoz Globulin Albumin
Lehetőségek a mátrix effektus csökkentésére a biológiai minta mennyiségének csökkentése, a reagens mennyiség javára, amelyben növeljük a protein és ionkoncentrációt valamint a puffer kapacitást. Ugyanakkor a biológiai mintamennyiség csökkentésével rontjuk a módszer szenzitivitását is. - Klinikai használatra a standardok készítésénél egészséges fehérje és ionkoncentrációkra beállított humán szérum matrixot használjuk. Ettől eltérő a súlyos betegek szérum mátrixa. - Kérdés, hogy a reakciótérben a reagensek milyen fokban képesek ezt az eltérést kompenzálni?
MUNKACSOPORTUNK MÁTRIX EFFEKTUS IRÁNYÚ VIZSGÁLATA: Több irodalmi adattal rendelkezünk már arra nézve, hogy a D vitamin ellátottság javításával egyes betegségek iránti fogékonyság, valamint a már fennálló betegségek relapszusának elkerülése is jobban biztosítható. Ezért, a klinikai gyakorlatban egyre gyakrabban felmerül az igény a 25OHD szintek pontos mérésére olyan biológiai mintákban is, ahol a normálistól eltérő fehérjefrakciókkal (pl. alacsony albumin, alacsony v. magas D vitamin bindig protein (DBP), stb ) is számolnunk kell. Ezért végeztünk in vitro és in vivo vizsgálatokat a hazánkban a klinikai kémiai gyakorlatban leggyakrabban alkalmazott két 25OHD vitamint mérő módszerrel.
Albuminfüggés vizsgálata: in vitro ANYAG ÉS MÓDSZER: Összesen 6 db alacsony albuminszintű szérum poolhoz 5 lépésben adtunk 20%-os human albumint tartalmazó oldatot annyi mennyiségben, hogy lépcsőzetesen növeltük a minta albuminszintjét addig, hogy annak értéke a normális albuminszintet elérje, illetve meghaladja. Mindegyik mintából (N=36) meghatároztuk mindkét módszerrel a 25OHD szinteket
25(OH)D vitamint mérő két teljesen automatizált módszer I. Antitest kötésen alapuló: IMMUNO-ASSAY CLIA (DiaSorin) DBP 25(OH)D 25(OH)D a szérumban Albumin II. Fehérje kötésen alapuló : ECL-PBA (Roche)
A két módszerrel mért 25OHD szintek az albuminmanipulációt követően Mérhető 25OHD szintek 25OHD szintek változása%
25OHD vitamin szintek az alacsony és a közel normális albuminszintű minták esetében 70 PBA KW-H(1;36) = 7,85; p = 0,005 36 34 IMMUNO-ASSAY KW-H(1;36) = 1,1725; p = 0,279 N.S. 25(OH)D nmol/l 60 50 40 30 ** 25(OH)D nmol/l 32 30 28 26 24 22 20 20 18 10 <30 >30 g/l Albumin szintek Median 25%-75% Min-Max 16 <30 >30 g/l Albumin szintek Media 25%-7 Min-M
KORRELÁCIÓK AZ ALBUMINSZINTEK ÉS A MÉRT 25OHD VITAMIN SZINTEK KÖZÖTT Protein Binding-Assay Immuno-Assay *** N.S. *** *** %-os változás a 25OHD szintekben
In vitro albuminmanipuláció eredményekből levonható következtetések
IN VIVO: klinikai tapasztalat elemzése A Belgyógyászati betegek diagnózis szerinti megoszlása Nephrosis+Malnutritio N=64. Chronical renal faileure Cirrhosis Kontrollként állítottunk 48 nemben és életkorban illesztett, aktív életvitelű személyt Elemzett paraméterek: albumin, DBP, PTHi, 25OHD vitamin szintek.
A kontroll és a beteg csoportban mért albumin és DBP szintek közötti különbség 50 48 46 Albumin g/l: KW-H(1;112) = 80,6; p = 0.0000 D-vitamin binding protein mg/l: KW-H(1;111) = 27,5 ; p = 0,000 360 340 Albumin g/l 44 42 40 38 36 34 32 *** D-vitamin binding protein mg/l 320 300 280 260 *** 30 28 240 26 Beteg Aktív-Kontroll Mean Mean±SE Mean±1,96*SE 220 Beteg Aktív-Kontroll Mean Mean±SE Mean±1,96*SE
25OHD szintek a két módszerrel mérve: a módszerek között szignifikáns különbséget csak az alacsony albuminszintű betegekben találtunk
Korrelációk az albumin és a 25OHD szintek között Beteg Kontroll Log25(OH)D nmol/l PBA 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 *** r = 0,40; p = 0,001 Log25(OH)D nmol/l PBA 2,2 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 N.S. Nincs korreláció 0,8 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Albumin g/l 0,95 Conf.Int. 1,2 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 Albumin g/l 0,95 Conf.Int. Log25(OH)D nmol/l Immunoassay 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 *** r = 0,40; p = 0,001 Log25(OH)D nmol/l Immunoassay 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 N.S. Nincs korreláció 0,9 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Albumin g/l 0,95 Conf.Int. 1,2 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 Albumin g/l 0,95 Conf.Int.
A DBP és albumin között csak a betegek esetében áll fenn szignifikáns pozitív korreláció Beteg Kontroll
A két 25OHD módszer albumin függése A betegminták csoportosításában PBA P=0,057 IA N.S. In vitro kísérletnek ellentmond az IA esetében Albumin
Korreláció a 25OHD és a DBP között Beteg Kontroll Log25(OH)D nmol/l PBA 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 * r = 0,30; p = 0,020; Log25(OH)D nmol/l PBA 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 N.S. Nincs korreláció Log25(OH)D nmol/l Immuno assay 0,8 50 100 150 200 250 300 350 400 450 2,0 1,9 1,8 1,7 *** DBP mg/l r = 0,44; p = 0,0004 0,95 Conf.Int. 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 50 100 150 200 250 300 350 400 450 DBP mg/l 0,95 Conf.Int. Log25(OH)D nmol/l Immunoassay 1,2 100 150 200 250 300 350 400 450 DBP mg/l Nincs Korreláció 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 N.S. 0,95 Conf.Int. 1,2 100 150 200 250 300 350 400 450 DBP mg/l 0,95 Conf.Int.
A két módszerrel mért 25OHD szintek az alacsony és a normál DBP szintű mintákban A 25OHD IA módszer DBP függése erősebb, mint a PBA esetében PBA IA
Klinikai adatokból levonható következtetések, összevetve az In vitro albuminmanipuláció eredményekkel
A 2013-as QuliCont eredményekből levonható tanulságok QuliCont: Gyógyszerek, hormonok- 196-os és Cametabolismus 301-es 4 ill. 6 körvizsgálat/év 25(OH)D vitamin és PTHi adatok.
25(OH)D-vitamin
Beküldött kontroll eredmények száma 2010-2013
A 25(OH)D vitamint mérő módszerek megoszlása
Melyik tartományt ellenőrizték a QuliCont kontroll szérumok 2013-ban Nem ellenőriztük: Elégtelen Hiány 1.) Toxikus tartományt ( >250 nmol/l) 2.)Súlyos hiányt (<20-25nmol/l) Súlyos hiány
Miként is mérünk összességében 25OHD Szinteket a módszertől függetlenül: K1 szérum!!
Miként is mérünk összességében? módszertől függetlenül: K2 szérum?!!
Eltérés a célértékektől százalékban
Laboratóriumonként leadott 25OHD eredmények 4 azonos kontroll szérum esetében Szaggatott vonal: Célértékek átlaga
Laboratóriumonként leadott eredmények eltérése a módszer specifikus célértéktől Cél
Célértéktől való eltérések az 5 módszer esetében
PTH intact H 2 N COOH
Parathormon (PTH) mérés Mit mérnek a PTH-intact módszerek? PTH molekulaformák a keringésben 3. Generáció BIO-intact (1-84) 2011-2. Generáció 4. generáció!!! 2014-től
A 40 laboratórium által alkalmazott 7 PTHi módszer megoszlása
Beküldött PTH kontroll eredmények száma 2010-2013
Melyik PTHi tartományt ellenőrizték a QuliCont kontroll szérumok 2013-ban Alacsonyabb N=6 Magasabb N=6
Miként is mérjük a PTHi szinteket az alacsony és a magas mérési tartományban: Alulmérünk picit? Referencia tartományok: átváltási faktor: 1 pg/ml=0,106 pmol/l ECLIA (Roche): 1,6-6,9 pmol/l CLMA (DiaSorin): 1,2-6,48 pmol/l Vesepotló terápiában: 5,3-31,8 pmol/l
PTHi kontrollok %-os eltérése a célértéktől a két mérési tartományban Cél
Kontroll eredmények eltérése a célértékektől 6 módszerrel mérve
Laboratóriumonként leadott PTH eredmények 3 kontroll szérum esetében-i.
Laboratóriumonként leadott PTH eredmények 3 kontroll szérum esetében-ii.
Laboratóriumonként leadott PTH eredmények eltérése a módszer specifikus célértéktől
Köszönöm a megtisztelő figyelmet! ÉS
Köszönet munkatársaimnak éstdk hallgatóimnak! Köszönet a klinikus kollégáknak
Regression Summary for Dependent Variable: t-25(oh)d-ia nmol/l (Csak betege-belosztaly- Modszer-osszemereshez) R=,45624200 R2=,20815676 Adjusted R2=,18219469 F(2,61)=8,0177 p<,00081 Std.Error of estimate: 15,908 b* Std.Err. - of b* b Std.Err. - of b t(61) p-value Intercept -5,46458 10,97342-0,497983 0,620286 Albumin g/l 0,123779 0,129317 0,37988 0,39687 0,957178 0,342256 D-vitamin binding protein mg/l 0,384466 0,129317 0,09596 0,03228 2,973058 0,004217
Regression Summary for Dependent Variable: t-25(oh)d-pba nmol/l (Csak betege-belosztaly-modszerosszemereshez) R=,29824732 R2=,08895146 Adjusted R2=,05908102 F(2,61)=2,9779 p<,05835 Std.Error of estimate: 15,741 b* Std.Err. - of b* b Std.Err. - of b t(61) p-value Intercept -1,63906 10,85820-0,150951 0,880512 Albumin g/l 0,157101 0,138709 0,44478 0,39271 1,132595 0,261817 D-vitamin binding protein mg/l 0,189871 0,138709 0,04372 0,03194 1,368839 0,176069