In vivo interferencia: rjék, antitestek

Átírás

1 In vivo interferencia: fehérj rjék, antitestek Toldy Erzsébet Vas Megye és s Szombathely MJV Markusovszky KórhK rháza Központi Laboratórium, rium, PTE ETK DMI Gyakorlati Diagnosztikai Tanszék, Szombathelyi KépzK pzési KözpontK Endokrin betegségek gek laboratóriumi riumi diagnosztikája kötelezk telezı,, szinten tartó továbbk bbképzés, Rendezı: : PTE, OTK, LMI Pécs, P október Szervezık: Prof. Dr. Kovács L. G., Prof. Dr. Ludány Andrea

2 IN VIVO INTERFERENCIÁK DEFINÍCIÓJA Ag + Ag* + Ab K 1 K -1 [AgAb] + [AgAb]* A biológiai minta olyan rendkívüli adottsága, amely rejtett hibaként jelentkezhet az immun-analitika során

3 IN VIVO INTERFERENCIÁK OKA A szokásostól eltérı fehérjefrakció arányok: rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek: - súlyos betegség, - gyógyszerhatás következményeként - terhesség, Endogén v. exogén szubsztanciák jelenléte: 1.) rendhagyó proteinek (pl. paraprotein) 2.) a módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 3.) az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte. A mérni kívánt hormon rendkívül magas koncentrációja

4 IN VIVO INTERFERENCIÁK OKA A szokásostól eltérı fehérjefrakció arányok: rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek: - súlyos betegség, - gyógyszerhatás következményeként - terhesség Endogén v. exogén szubsztanciák jelenléte: 1.) rendhagyó proteinek (pl. paraprotein) 2.) a módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 3.) az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte. A mérni kívánt hormon rendkívül magas koncentrációja

5 Transzport protein interakciók: k: in vivo 1.) Peptideket szállítók: CRH-BP (placenta, 38 KD, CRH-t inaktiválja), IGFBP- 1-6, Albumin (Calcitonin, PTH, ACTH) 2.) Szteroid hormonokat szállítók: CBG, SHBG, D-vitamin -BG 3.) Pajzsmirigy hormonokat szállítók: TBG, Albumin, Transthyretin (prealbumin)

6 Analit specifikus interakciók: IGF-1 Korlátok: Specificitás Transzport protein interakciók biológiailag aktív frakció mérése? Lelet-értelmezés

7 IGF-1: in vivo interakciók Biokémia: - 70 aminosavból álló egyszálú polipeptid: 7,5 KDa Homológia: - proinzulin: 50 % - IGF-2 : 70 % - Insulin: 1 % - TSH, LH: 0,05-0,24 % Kötıfehérjék: - 6 izotípus, összes keringı mennyiség >95%-a kötött,

8 IGF-1 és s a kötıfehérjék: : BP1-6 BP 1-2 IGF-1 α-subunit α-subunit IGF-1 BP 4-6 IGF BP3 IGF-1 BP3 IGF-1 β-subunit β-subunit IGF-1 Az összes keringı IGF-1 1 mennyiségének: nek: < 5% szabad - a szérum proteolitikus enzim aktivitása változik, - ph viszonyok - farmakonok A szabad IGF-1 szint 3-5-szörösére változhat!

9 A totál IGF-1 mérés elıtt a kötıfehérjékbıl az IGF-1-et fel kell szabadítani MÓDSZEREK: 1.) Kromatográfiás módszer: - aranystandard: Sephadex G-75 savas gélfiltráció 2.) Savas-etanolos extrakció: - ha követi a BP-ék precipitációja, akkor jól használható 3.) IGF-1-et felszabadító disszociációs eljárás: egyéb szétkapcsoló reagensek gyártó specifikusak. - túlsúlyban IGF-2-t adnak a mintához, aminek következtében az IGF-1 felszabadul a fehérjekötésbıl, mert az IGF-2-nek nagyobb az affinitása.

10 Telítı (szendvics) IGF-1 1 módszer: m savas hidrolízis után n totál -, elıkezel kezelés s nélkn lkül l szabad szintek Szilárd fázishoz kötött antitest IGF-1 IGF-1 IGF-1 IGF-1 BP3 IGF-1 BP3 Csekély veszteség Szenzitívebb módszer, pontosabban mér az alacsony tartományban

11 Holland tapasztalat: IGF-1 külsı kontroll IGF-1 nmol/l Célérték Immulite 2000 Advantage LMA RIA+Eigen RIA Biosource + RIA + Overig IRMA Overig IRMA DSL - Hazánkban egy labor sem használ külsı kontrollt, mert nem elérhetı!

12 Szteroid transzport-proteinek: tesztoszteron a keringésben 110% Az összes keringıtesztoszteron%-ában 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Szabad T 2-3% CBG-T 3,5% Albumin-T 50% SHBG-T 44% Biológiailag hasznosítható

13 Átlag plazma szintek+se Koncentráció arányok: albumin vs. SHBG Tesztoszteron kötési affinitás csökken 827 µmol/l Albumin Eltérés: 1025-szörös 33 nmol/l SHBG A kötıkapacitások hasonlóak

14 A biológiailag aktív tesztoszteron Származtatott bioaktív Tesztoszteron (T) szintek Származtatott bioaktív Tesztoszteron (T) szintek Szabad T szintek* Szabad T szintek* Biológiailag hasznosítható T* Biológiailag hasznosítható T* Rövidítése frakciók Rövidítése ftc ftc BA-T BA-T Definíció (mértékegység) TT - (SHBG_T+Alb_T) TT - (SHBG_T+Alb_T) ft + Alb_T ft + Alb_T Szabad T index Szabad T index fti fti [TT(nmol/l)/SHBG(nmol/l)]*100 [TT(nmol/l)/SHBG(nmol/l)]*100 *matematikai formula:

15 Receptor a sejtmembránon Fontos reguláló szerep: Steroid-SHBG interakciók k 1 Szteroidot kötı hely SHBG + + Receptor kötı hely k 2 SHBG-receptor komplex + k 3 k 4 k 5 k 6 + k 7 X camp Szteroid-SHBG komplex a keringésben Szteroid-SHBG-receptor komplex

16 Pajzsmirigy hormonok transzportja VÉR A pm. hormonok >99%-a fehérjéhez kötve kering Spencer,AACC, Expert Access, 2009 Perifériás szövetek Biológiai hatás

17 Eltérı analitikai megközelítések a szabad hormonfrakciók megítélésére A rutin ft 4 módszerek kötıfehérje függık, ezért csak becsült értékek Spencer,AACC, Expert Access, 2009

18 Klinikai szituációk, amikor változnak a pajzsmirigy kötıfehérjék TBG TBG Alb. PreAlb Spencer,AACC, Expert Access, 7/8/2009

19 Totál T4 és ft4 változások Nonthyroidal illness-ben: Equilibrium Dializis Rutin ft4 szintek között Az alacsony albuminszintő NTI betegek szérumához albumint adva: Equilibrium Dializis Rutin ft4 szintek között Spencer C.,AACC, Expert Access, 7/8/2009 A rutin ft4 módszereket úgy fejlesztették ki, hogy legyızzék a gyakoribb fehérjefrakció rendellenességeket, cserében viszont az albuminkötıdésnek és a szenzitivitásnak ártanak.

20 Élettani állapotok: pszichés vagy fizikális stress ACTH, Cortisol, katecholaminok, TSH, PRL, hgh,, AVP, Oxytocin., Aldosteron,, PRA, ANP Stress hatás idıtartama, súlyossága Kisebb Nagyobb pl. betegség mőtét Infekció TNF-α IL-1,6 májban : 5 MD aktivitás, T3, Akut fázisreakcif zisreakciók Vermes és mtsai, 2001 Csökken: A T4, TSH hormonkötı-proteinek

21 Neuroendokrin válasz súlyos betegségben Hypophysis -adrenális tengely aktiváció Hypophysis -genitális és pajzsmirigy Eltolja a szokásos sos referencia tartományokat További komplikáci ciók: -változás a táplálkozásban -gyógyszerhatások tengely inhibició

22 Gyógyszerhat gyszerhatásoksok In vivo Béta blokkolók: PRA ACE-, AR- blokkolók: PRA Ca-csatorna blokkolók: ALD PRL Spironolacton: ALD Antikoncipiensek: BP, PRL Amiodaron ft4 ft3 Adrenerg szerek: TSH Neuroleptikumok, antidepresszánsok: PRL In vitro Steroid assayk-ben számtalan metabolit és gyógyszer zavarhat Heparin, phenytoin, carbamazepin, salicylat,-ft4,ft3 Biotin Fluoroforok Exogén T4 mérése szubsztituált betegekben Insulinnal, v. GH-val kezelt beteg

23 NORMÁL TERHESSÉG: változások a referencia tartományban Rendkívüli fiziológiás állapotból adódóan Speciális biomolekulák megjelenése: Placentális steroid és protein hormonok szöveti tömeggel jól korreláló fehérjék, pl PAPP-A, Inhibin-A, Haemodilúció miatt csökken: összes protein, albumin, ferritin, transferin szaturáció, vas, karbamid, kreatinin, Mg, Na, K. Növekszik: Akutfázis-proteinek: fibrinogén, We koleszterin, triglicerid, FFA Hormonok (progesteron, ösztradiol, PRL, ACTH, kortizol, aldoszteron, PTH, stb.) Transport proteinek: TBG, CBG, SHBG, DBG, Cöruloplazmin, Az analitikai módszer korlátai miatt A matrix effektus kihat a mért eredményre: Albumin Globulin frakció Ionerısség IMMUNO-ASSAY

24 Abszolút t totál és s szabad hormon hormonszintek meghatároz rozása terhességben? Standard mátrix = gravida szérum mátrix In vitro hormonszintet csökkentı tényezık: Albumin TBG ionerısség FFA Immuno-assay-vel nem megoldott In vitro hormonszinteket növel

25 TBG nmol/l TBG szint változása az ösztrogén-hatás függvényében (N=240) Koncentráció növekedés: 3-szoros! * * * * * * * * Alb.: N N Kontroll Antikoncipienst szedı ~30% gestációs hét Toldy E., Lıcsei Z., Rigó E., Kneffel P, Szabolcs I., Kovács G.L.: Comparative analytical evaluation of thyroid hormone levels in pregnancy and in women taking oral contraceptives: a study from an iodine deficient area. Gynecol. Endocrinol, 2004; 8: 1-8.

26 Szabad T4 meghatároz rozás s háromfh romféle módszerrel m (n=240) ft4 pmol/l Kontroll Anticoncipienst szedı Gravida 16. hetes Gravida 32. hetes * 16 * * * 14 * * 12 * * 10 8 * Egylépéses tracer analóg Egylépéses antitest jelölt lt Kétlépéses antigén n jelölt lt X Toldy E., Lıcsei Z., Rigó E., Kneffel P, Szabolcs I., Kovács G.L.: Comparative analytical evaluation of thyroid hormone levels in pregnancy and in women taking oral contraceptives: a study from an iodine deficient area. Gynecol. Endocrinol, 2004; 8: 1-8.

27 Referencia tartomány alatti szabad T4 értékek euthyreoid nıkben (n=240) Gyakoriság (%) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 X egylépéses tracer analóg egylépéses antitestjelölt Anticoncipienst szedı Gravid16. hetes Gravid32. hetes Kétlépéses antigénjelölt Toldy E., Lıcsei Z., Rigó E., Kneffel P, Szabolcs I., Kovács G.L.: Comparative analytical evaluation of thyroid hormone levels in pregnancy and in women taking oral contraceptives: a study from an iodine deficient area. Gynecol. Endocrinol, 2004; 8: 1-8.

28 IN VIVO INTERFERENCIÁK OKA A szokásostól eltérı fehérjefrakció arányok: rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek: - terhesség, - súlyos betegség, - gyógyszerhatás következményeként Endogén v. exogén szubsztanciák jelenléte: 1.) rendhagyó proteinek (pl. paraprotein) 2.) a módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 3.) az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte. A mérni kívánt hormon rendkívül magas koncentrációja

29 Immunglobulinok (vagy paraproteinek) okozta keresztreakciók feltételei 1.) Az analitre nézve antigénkötı-molekularésszel rendelkezı specifikus- antitestek jelenléte a szérumban. 2.) A zavaró specifikus antitest koncentráció viszonya a módszer méréstartományát elérı, vagy azt meghaladó legyen. 3.) Aspecifikus immunglobulinok, illetve paraproteinek kóros mennyiségi arányai.

30 Interferenciáért felelıs endogén antitestek I. Specifikus antitestek az analit ellen II. Heterophyl antitestek III. Reuma faktor IV. Human anti-animal-antitestek V. Human-antihuman-antitestek (HAHA)?

31 O I. Specifikus autoantitestek Izotípusuk: fıként IgG, de leírtak már IgM, IgA-izoformát is Gyakoriságuk- eltérı: Prolactin : normál populáció: 2%, hyperprolactinaemia: 21-46% Tg: DTC-ben 26% T4, T3: normál 0,3-1,8%, betegekben: 5-25% TSH: 0.02% H 2 H 2 I g G S S S S S S S S S S I I I g g g G G G I g G H 2 O O I g G H 2 O O H 2 I g G H2 O S

32 II. Heterophyl antitestek prevalencia: 0,5-12% III. Reuma faktor Elıfordulásuk: a normál populációban (idısebb kor): 5-10%, autoimmun betegekben gyakrabban. Rheumatoid arthritis kezdeti stádium elsı év: 40-60%, késıbb: 80% Úgy viselkednek, mint a heterophyl antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötıdnek. IV. Human anti-animal-antitestek (HAMA) Szérum koncentrációi: µg/l-g/l is lehet, évekig perzisztálhatnak a keringésben Elıfordulásuk: 1-80% is lehet.

33 A human anti-animal antitestek ellen keletkezı további antitestek Állati antitest Human anti-izotípiás antibody Human antiidiotípiás antitest Human anti-anti idiotípiás antitest Kricka: Clin. Chem

34 Az állati antitestek ellen keletkezı IgG interakciók Tévesen magas Tévesen alacsony ) ) Y Y Y * Y YY *Y Szilárd fázishoz kötött specifikus Ab Anti idiotípiás Ab *Jelet adó Ab Anti-anti idiotípiás Ab vagy Anti izotípiás Ab

35 IN VIVO INTERFERENCIÁK OKA A szokásostól eltérı fehérjefrakció arányok: rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek: - terhesség, - súlyos betegség, - gyógyszerhatás következményeként Endogén v. exogén szubsztanciák jelenléte: 1.) rendhagyó proteinek (pl. paraprotein) 2.) a módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 3.) az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte. A mérni kívánt hormon rendkívül magas koncentrációja

36 Rendkívül magas hormonszint: "High Dose Hook" jelenség Captures antitest 1. Jelölt antitest Jel nagysága Antigén Szilárd fázis Tévesen leolvasott alacsony koncentráció Valós magas koncentráció

37 Analitikai gondok: a biológiai minta Hook effektusok Low dose High dose

38 MIT TEHET A LABORATÓRIUM? Plauzibilítási kontroll Visszatekintı biokémiai kontroll (delta check) Blokkoló ágenseket használó assay-k beszerzése Analitikai megközelítések

39 Módszerek az interakciót okozó antitestek kiszőrésére 1.) Gyárilag az assay pufferhez blokkoló ágenst - borjú v. murin immunglobulin, - nem specifikus egér antitest (MAK33) - Biotinizált egyszárú antitest használata Warren D.J. et al. CEA Clin.Chem ) A minta elıkezelése az immuno-assay elıtt: - kezelés PEG, alkohol, ammónium szulfát oldattal - Protein A kromatográfia, ultrafiltráció, - Gél diffúziós kromatográfia - Detergens szulfhydril ágens - Minták hıkezelése - Minták hígítása szériában (non linear response) - Alternatív módszer, - Visszanyerés teszt, vagy az antitestet közvetlenül mérı módszer. pl. TgAb

40 Kell-e szőrni RF interferenciákra a laboratóriumnak? Marks V. et al. Clin. Chem Rf-pozitív donor mintáját 74 analitre 66 laborban vizsgáltak 3445 eredménybıl 8,7 %-a volt tévesen pozitív. 21 % -a közülük durván félrevezetı tévesen pozitív lelet volt. A blokkoló reagenssel történı kezelés után 4,2%-ra csökkentek a téves leletek. Random hibával számolni kell és a klinikusokkal tudatni kell az interferenciák jelentıségét.

41 Kell-e szőrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban? (Ismail A. A, et al. Clin. Chem ) Vizsgált szérum: esetben félrevezetı FSH, LH, TSH vizsgálati eredmény született antitest interferencia miatt. 0,53 % Mivel ezek a vizsgálatok milliókra rúgnak a UK ban, így a kellemetlen következmények ezreket érintenek. Ezért a korai kiszőrésük lenne indokolt.

42 Kell-e szőrni antitest interferenciákra a laboratóriumban? IGEN, ha. a populáció jelentıs %-át érinti és az eredmény a döntéshozatalban meghatározó. pl. bbprl, Tg Az anamnesis megköveteli Laboratóriumé a felelısség!

43 Az in vivo fehérje-interferenciák kiküszöbölése: LEHETETLEN, DE...együtt kell élni vele a következıképpen: Több módszert kell elérhetıvé tenni Team munkában: - tudatosítani kell a klinikusokban az immunanalitikai módszerek korlátait, - klinikai összefüggéseket ismertté kell tenni a labor felé.

44 Az interakciók mértéke módszerfüggı Jelölési technika: alternatív v. izotóp? -fluoreszcens, kemilumineszcens módszerek jobban ki vannak téve a matrix effektusból adódó interakcióknak Kivitelezés: automata, vagy manuális? - az extrakciós módszerek nem kompatibilisek az automatizáci cióval - kinetikus jel-detekt detektálás Hamis eredmény

45 Köszönet a megtisztelı figyelemért!