Autoantitestek kimutathatóságának határai, jelenlétük zavaró hatása az immunanalitikai módszerekre. Dr. Toldy Erzsébet Ph.D.

Átírás

1 Autoantitestek kimutathatóságának határai, jelenlétük zavaró hatása az immunanalitikai módszerekre Dr. Toldy Erzsébet Ph.D. Szombathely, Vas Megye és Szombathely Markusovszky Kórháza, Szombathely, PTE Diagnosztikai és Menedzsment Intézet, Pécs MOLSZE Vándorgyűlés Bük, 2005.

2 Autoimmunitás Fiziológiás immunműködés szerves részeként - mint biológiai jelenség az élő működés lényegi része Kóros immunműködés gyanánt - a szervezet homeosztazisát súlyosan veszélyeztető jelenség (európai népesség 1-3%-át érinti)

3 Fiziológiás autoimmunitás: immunologiai homunculus Magasabb rendű szervezet annak érdekében, hogy ne indulhasson el saját antigénjével szemben autoimmunreakció fenntart egy csekély mértékű autoimmunitást. - CD5+ B sejtek - kicsiny affinitású proliferatív IgM típusú autoantitest termelődés

4 Egészség vége? Betegség kezdete? fiziológiás autoimmunitás pathologiás autoimmunitás Az egyensúly fenntartását biztosító tényezők: immuntolerancia: védelem a saját antigénstruktúrával szemben anti-idiotípus hálózat

5 Anti-idiótípus reguláció Antitest Antigéndeterminánsok Anti idiótípus- antitest Fiziológiás védelem Patológiás következmény Anti-anti-idiótípus- antitest AUTOIMMUN BETEGSÉG

6 Antigének: saját? és nem saját? Antisomatogén = ellenanyagtermelést kiváltó (Detre László, 1960, NY) Autoantigén saját : a szervezetet saját felépítő struktúrái, melyek felismerésére a T és B sejtek specifikus receptorokkal rendelkeznek, s immunválaszt (autoantitestet) fejlesztenek ki velük szemben. Heterophyl antigén Nem saját : az emlős szervezet számos építőeleme homológiát mutat az evolució távoli fajait és egyedeit felépítő molekuláris elemekkel. - autoimmun kórképek kialakulásának egyik oka lehet az autoantigén struktúra megváltozása külső antigén hatására. Keresztrokonságok miatt valójában heteroimmunitás autoimmunitás

7 Az autoimmunitás ellenanyagai Ig típus Termelődés Szérumszint Természetes IgM CD5+ B 1 sejt ng/ml alacsony affinitás Patológi giás IgG, IgA, IgM B 2 sejt mg/ml magas affinitás

8 Autoantitest meghatározások korlátai Az eredmények meglehetősen módszerfüggők, ok: alkalmazott antigén, anti human-ig-antitest alkalmazott méréstechnika legkülönfélébb: - analitikai és klinikai szenzitivitás, - analitikai és klinikai specificitás, - referencia érték, - ál pozitív értékek eltérő %-ban

9 Specifikus antitesteket meghatározó módszerek Immunfluoreszcencia Counter immunelektroforézis Radiális immundiffúzió Agglutináció Immunoblot Immuno-assay (ELISA, ECLIA, CLIA, RIA, RRA)

10 Szisztémás autoimmun markerek: ANA -IF leukémia Immun trombocytophenia Mononukleos is Autoimmun haemolitikus anaemia Primér biliáris cirrhosis Myas tenia Gravis Rheumatoid artritis (RA) autoimmun thyreoiditis Alkohol indukálta cirrhosis Virus hepatitis ek Psoriasis vulgaris anaemia pernicios a SLE-és betegek egészséges rokonai körében graviditas >60 éves egészséges felnőtt populációban <60 éves egészséges felnőtt populációban

11 Szervspecifikus autoimmun markerek: pajzsmirigy antitestek

12 TPO-antitestek TPO izoformák: eltérően expressálódnak TPO1 (105 KD) domináns forma TPO2 (100 KD) GB-ban kisebb Antigenitás: két epitóp C2-fragmens (85 aminosav)- főbb epitóp C21-fragmens (99 aminosav)- Hashimotoban: 52-60% TPO epitopok találhatók a Tg molekulában is. TPO antitestek: Gátolják az enzimet, aktiválják a komplementrendszert, direkt cytotoxikusak.

13 TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. Al (UK): 2003-as tanulmány 13 assay klinikai értékelés: 178 klinikailag ismert eset % Szenzitivitás Specificitás Leletazonosság minimum maximum

14 TPO-antitestek meghatározása: Analitikai összevetése: mérések közötti eltérések Mérések száma: 13 x max. 33,4 39,6 CV% min. 1,3 1,5 Intra-assay Inter-assay

15 TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. al: 2003-as tanulmány 13 ELISA Pontosság vizsgálata TPOAb U/ml Célérték : 1000 U/ml Célérték: 500 U/ml referens preparátum (U/ml) Célérték: 250 U/ml 13 módszerből 8-nak inkorrekt a kalibrációja

16 TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. al: 2003-as tanulmány 13 ELISA 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1 10 Matrix effektus vizsgálata Lipaemia zavar 13 módszerben Haemolisis zavar 12 módszerben Hyperproteinaemia Zavar 3 módszerben Hyperbilirubinaemia Zavar 13 módszerben Vizsgált minta ál-pozitivitási gyakorisága

17 Antitest interakciók az immunanalitikában

18 Immunglobulinok okozta keresztreakciók feltételei 1.) Az analitre nézve antigénkötő-molekularésszel rendelkező specifikus- antitestek jelenléte a szérumban. 2.) A zavaró specifikus antitest koncentráció viszonya a módszer méréstartományát elérő, vagy azt meghaladó legyen. 3.) Aspecifikus immunglobulinok kóros mennyiségi arányai.

19 Interferenciáért felelős antitest típusok I. Heterophyl antitestek II. Human anti-animal-antitestek III. Reuma faktor IV. Specifikus antitestek az analit ellen

20 I. Interferenciáért felelős antitestek: Heterophyl antitestek - immunogenitásuk rosszul definiálható - a beteg anamnézisében az állati fehérjével történő expozició nem igazolható - multispecifikus: Rf és két v. több faj immunglobulinjával aktivitást mutat - prevalencia: 0,5-12%

21 II. Interferenciáért felelős antitestek Specifikus anti-human-animalantibodies (HAAAs) - Izotípusuk lehet: IgG, IgM, IgA, IgE - immunogenitásuk jól definiálható - a beteg anamnézisében az állati fehérjével történő expozició igazolható és az állatfaj azonos a tesztben alkalmazott állati immunglobulinnal - endogén antitest további besorolását a faj határozza meg: pl. HAMA, HARA - szérumkoncentrációi: µg/l-g/l is lehet! - évekig perzisztálhatnak a keringésben - előfordulásuk: 1-80% is lehet.

22 Az egér-antigének ellen keletkező humán antitestek előfordulási gyakorisága a keringésben I. Gyakoriság (%) Tévesen magas CK-MB, ctr 0 Egészséges véradó N=1008 RA N=54 Sjögren s. N=45 SLE N=54 P.M. Autoimmun N=70 P.M. cc. N=15

23 Az egér-antigének ellen keletkező humán antitestek előfordulási gyakorisága II: Iatrogén okok. Gyakoriság (%) Ovarium cc. CA-125-mouse Ab N=32 Egyéb cc. Radiologiai Ab N=61 IL-6 Ab-el kezelt Renal cell met. Myeloma mult. N=12

24 Az IgG struktúrája és a human antianimal antitestek Állati antitest Human anti-izotípiás antitest Human antiidiotípiás antitest Human anti-anti idiotípiás antitest Kricka: Clin. Chem

25 Antitest interakciók az immuno metrikus módszerekben jelölt Ab (animal) Antigen Capture Ab (animal) jelölt Ab (animal) Antianimal Ab Capture Ab (animal) Szilárd fázis jelölt Ab (animal) Antianimal Ab Antianimal Ab Capture Ab (animal) Helyes Tévesen pozitív Tévesen negatív Kricka Clin. Chem

26 Interferenciáért felelős antitestek III. Rheumatoid faktor (Rf) Eredetük: a humán IgG Fc fragmense ellen képződnek Izotípusuk: főként IgM Előfordulásuk: a normál populációban (idősebb kor): 5-10%, autoimmun betegekben gyakrabban. Rheumatoid arthritis kezdeti stádium (első év): 40-60% Később (2.-3. Évben) : 80% Úgy viselkednek, mint a heterophyl antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötődnek.

27 Interferenciáért felelős antitestek IV. Specifikus antitestek az analit ellen - Troponin T és I - CK-totál, CK-MB mass, - T4, T3 - CEA, CA-15-3, CA-125, AFP - hcg, FSH, LH - Tg - Prolactin

28 Módszerek az interakciót okozó antitestek kiszűrésére II. Heterophyl ill. Rf és AAAT jelenlétekor 1.) Gyárilag az assay pufferhez blokkoló ágenst - borjú v. murin immunglobulin, - nem specifikus egér antitest (MAK33) - Biotinizált egyszárú antitest használata Warren D.J. et al. CEA Clin.Chem ) A minta előkezelése az immuno-assay előtt: - kezelés PEG, alkohol, ammónium szulfát oldattal - Protein A kromatográfia, ultrafiltráció, - Gél diffúziós kromatográfia - Detergens szulfhydril ágens - Minták hőkezelése - Minták hígítása szériában (non linear response) - Alternatív módszer, - Recovery teszt, vagy az antitestet közvetlenül mérő módszer. Pl. TgAb

29 Tg + Tg-visszanyerés (recovery) mérése Alacsony Tg visszanyerés nem jár j r mindig együtt TgAb pozitivitással ssal, 100% nem zárja ki az Ab pozitivitást st! Jelenlegi konszenzus: nincs értelme visszanyerési %-t meghatározni! Szenzitív TgAb módszerrel a TgAb-t kell mérni!

30 Kell-e szűrni antitest interferenciákra a laboratóriumban? IGEN, ha. a populáció jelentős %-át érinti: pl macroprolactinaemia, Az eredmény a döntéshozatalban meghatározó: pl. Tg Az anamnesis megköveteli Laboratóriumé a felelősség!

31 Kell-e szűrni RF interferenciákra a laboratóriumnak? Marks V. et al. Clin. Chem Rf-pozitív donor mintáját 74 analitre 66 laborban vizsgáltak 3445 eredményből 8,7 %-a volt tévesen pozitív. 21 % -a közülük durván félrevezető téves pozitív lelet volt. A blokkoló reagenssel történő kezelés után 4,2%-ra csökkentek a téves leletek. Random hibával számolni kell és a klinikusokkal tudatni kell az interferenciák jelentőségét.

32 Kell-e szűrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban? Emerson J.F. et al. California, Clin Chem Vizsgált szérum: 160 Mért paraméterek: TSH, PSA, hcg, Cortisol 0,8-7 %-ban változott meg a lelet klinikai interpretációja ~3% Következtetésük: - A minták előszűrése nem szükséges - A blokkoló reagens alkalmazásával csak 21% volt a hiba korrigálható, míg hígítással csak ~3%. - Ismertté kell tenni az anamnesist

33 Kell-e szűrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban? (Ismail A. A, et al. Clin. Chem ) Vizsgált szérum: esetben félrevezető FSH, LH, TSH vizsgálati eredmény született antitest interferencia miatt. 0,53 % Mivel ezek a vizsgálatok milliókra rúgnak a UK ban, így a kellemetlen következmények ezreket érintenek. Ezért a korai kiszűrése lenne indokolt ezeknek az interakcióknak.

34 Törekvés a tökéletességre Luciant L. Leope: Striving for Perfection Clin. Chem Harvard School of Public Health, Boston USA lakóssága: 247 millió Vizsgált betegek száma: >30 millió/év >12 % A diagnosztikában és kezelésben elkövetett komplikációk száma Megelőzhető műtét ~1 millió/év ~3,30% Labor? Megelőzhető halálok ~71ezer/év ~0,24%

35 Egészséges szkepticizmus hiánya! Laboratóriumi tesztek megbízhatósága 1000 tesztből 5 inkorrekt 0,5 % Dícséretre méltó: a munka sajátjából adódik Ugyanakkor kicsi hibák pusztítóak lehetnek! A gyakorlat: a klinikai szakemberek jobban hisznek a teszteknek, mint a saját itélőképességüknek!

36 Az antitest interakciók kiküszöbölése: LEHETETLEN, DE...együtt kell élni vele a következőképpen: Több módszert kell elérhetővé tenni Team munkában: - tudatosítani kell a klinikusokban az immunanalitikai módszerek korlátait, - klinikai összefüggéseket ismertté kell tenni a labor felé.

37 Ideális laboratóriumi szakember büszke a módszere magas szintű minőségére, de állandóan gondolkodik és tovább lát, tudatában annak, hogy óhatatlanul követ el hibát időről időre, egészséges szkepticizmussal fogadja az eredményeket készen áll a klinikai képbe nem illő hiba tisztázására.