QUANTA Lite TM ssdna In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM ssdna In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM ssdna egy szemi-kvantitatív enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) az egyláncú DNS (ssdna) ellenes autoantitestek kimutatására humán szérumban. Az INOVA QUANTA Lite TM ssdna ELISA kit az INOVA QUANTA Lite TM dsdna kittel együtt alkalmazva képes az ssdna autoantitestek szemi-kvantitatív meghatározására humán szérumban, és ez felhasználható kiegészítő vizsgálatként a szisztémás lupus erythematosus (SLE) és más rheumatikus betegségek diagnosztikája során. A teszt önmagában nem definitív, de egyik tagja egy több kritériumot tartalmazó diagnosztikai folyamat paramétereinek. A teszt összegzése és magyarázata Antinuclearis antitestek (ANA) találhatók a kötőszöveti betegségek széles körében, és kimutatásuk egy érzékeny szűrőmódszer. 1 A dsdna ellenes antitestek csaknem kizárólag SLE betegekben fordulnak elő, így azokat a betegség marker-ellenanyagainak tekintjük. Az anti-dsdna antitestek jelenléte határozottan SLE-re utal, ezeknek az antitesteknek a hiánya azonban nem minden esetben zárja ki SLE lehetőségét 2. Az ssdna autoantitestek számos rheumatikus betegségben és különboző más típusú kórképekben is kimutathatók 3,4. Az anti-ssdna legnagyobb incidenciája és titer értékei az SLE betegekben találhatók. 4 Egyes szerzők beszámoltak arról, hogy ssdna autoantitest pozitív SLE-betegekben a titer változása használható a betegség aktivitásában bekövetkező változások és a gyógyszeres kezelésre adott válasz monitorozására. 5,6 Bár az ssdna antitestek nem specifikusak SLE-re, előfordulhat, hogy ez az egyetlen pozitív szerológiai lelet egyes SLE betegekben, akikben nem alakul ki szignifikáns ANA titer. 7 Sokan ezek között a nagy ssdna antitest titerű betegek közül fotoszenzitív bőrtünetekkel rendelkeznek. A discoid lupusos betegek körülbelül 25 %-ában kimutatható az anti-ssdna, és ezeknek a betegeknek nagyobb a kockázata a szisztémás jelenségek kialakulására. 3 Csak súlyos, glomerulonephritissel járó discoid lupusos betegekben mutatták ki anti-ssdna jelenlétét. 3 Ezek atanulmányok arra utalnak, hogy az ssdna antitest meghatározása fontos diagnosztikai teszt lehet a discoid lupusos betegek kivizsgálása során, vagy olyan betegek esetében, akik gyaníthatóan ANA negatív SLE-ben szenvednek. 3 A hőkezeléssel denaturált ssdnaval reagáló antitestek képesek reagálni a purin és pirimidin bázisokkal és a DNS molekula cukor-foszfát vázával is. 1,4 Technikai szempontból tulajdonképpen nem lehetséges egyetlen tesztben a valódi ssdna antitesteket meghatározni (ahol a purin és pirimidin bázisok a kizárólagos antigének). Az ELISA technika amit ez az assay alkalmaz, objektív, és az eredmények szemi-kvantitatív formában is megadhatók. Az ELISA eljárás egyaránt kényelmesen kivitelezhető nagy és kis számú minta vizsgálata esetén profil formában is a rheumatikus betegségek kivizsgálása folyamán más tesztekkel együtt, mint a dsdna, hiszton és az extrahálható nucleáris antigének (ENA) ellenes antitestek meghatározása. A módszer elve Nagy mértékben tisztított, hővel denaturált borjú thymus ssdna-t rögzítenek egy mikrotiter lemez mérőedénykéinek belső falához olyan körülmények között, ami nagy mértékben megőrzi az antigén natív állapotát. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő ssdna antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a minta-edényekben kialakult szín intenzitását a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított ssdna antigénnel (12-1 x 8 mérőhely) bevonva, tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben 1

2 nincsenek humán ssdna antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. ssdna ELISA Low Positive (Mérsékelten Pozitív Kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum ssdna antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. ssdna ELISA High Positive (Erősen Pozitív Kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum ssdna antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínű, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP Mosó Koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kékre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, az ssdna ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az ssdna ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék-kezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az 2

3 alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 ssdna ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL ssdna ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll előhígítva 1 1.2mL ssdna ELISA Erősen Pozitív Kontroll előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Mosó Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, , és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény az HRP Mosó Koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó, ami képes az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) 3

4 Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP Mosó Koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP Mosó Koncentrátumos üveg tartalmát 975mL desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer 1 hétig stabil 2 8 C között tárolva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA az ssdna ELISA mérsékelten pozitív, az ssdna ELISA erősen pozitív és az ELISA Negatív Kontrollt. 4. Az ssdna autoantitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységben történő meghatározása céljából használjon minden egyes kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t mind az előhígított ssdna ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, az ssdna ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA Negatív Kontrollból és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon µL hígított HRP Mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. Az ssdna ELISA mérsékelten pozitív, az ssdna ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel az ssdna ELISA mérsékelten pozitív, az ssdna ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta 4

5 hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított ssdna ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított ssdna ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított ssdna ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. Az ssdna ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA Negatív Kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint d. Az ELISA Negatív Kontroll és az ssdna ELISA erősen pozitív kontroll a reagens minőségének jelentősebb eltérését kontrollálja. Az ssdna ELISA erősen pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást az assay küszöb (cutoff) koncentrációja közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A2 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja az ssdna ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. Az eredményt megszorozza az ssdna ELISA mérsékelten pozitív kontroll címkéjén található egységek mérőszámával. Minta OD Minta éretéke = x ssdna ELISA mérs.poz.kontroll (egység) ssdna ELISA mérs.poz.kontroll OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi értékek csak tájékoztató jellegűek. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. Az itt következő információk példaként szolgálnak, és segítik az eredmények interpretációját. Mivel mind az egyláncú DNS (ssdna) és bizonyos kettős láncú DNS (dsdna) autoantitestek reagálhatnak a kitben használatos ssdna antigénnel, a betegek mintáit párhuzamosan kell vizsgálni dsdna reaktivitásra is. Ezeket az eredményeket WHO egységekben számításba kell venni az ssdna reaktivitás meghatározásánál. Az INOVA QUANTA Lite TM dsdna ELISA assay eredményével kombinálva az INOVA QUANTA Lite TM ssdna ELISA assay eredményét, levonható a következtetés a minta ssdna antitest tartalmára vonatkozóan egy hányados számításának segítségével (ssdna/dsdna). Ha ez az arány < 0.5, ez arra utal, hogy a mintában nincsenek ssdna antitestek. Ha az arány > 0.5, ez az ssdna antitestek jelenlétére utal. MEGJEGYZÉS:Csak akkor szabad a beteg mintáját pozitívnak tekinteni, ha az ssdna antitest assay eredménye pozitív és az ssdna egység/dsdna egység aránya > példa: 1. Assay: dsdna antitest koncentráció: 120 WHO U/mL 2. Assay: ssdna antitest koncentráció: 160 U/mL ssdna antitest arány (ssdna/dsdna): 160/120 = 1.33 (+) Interpretáció: A beteg mintája pozitív ssdna antitestekre nézve 5

6 2. példa : 1. Assay: dsdna antitest koncentráció: 270 WHO U/mL 2. Assay: ssdna antitest koncentráció: 130 U/mL ssdna antitest arány (ssdna/dsdna): 130/270 = 0.48 (-) Interpretáció: A beteg mintája negatív ssdna antitestekre nézve 3. példa: 1. Assay: dsdna antitest koncentráció: 80 WHO U/mL 2. Assay: ssdna antitest koncentráció: 80 U/mL ssdna antitest arány (ssdna/dsdna): 80/80 = 1.0 (+) Interpretáció: A beteg mintája pozitív ssdna antitestekre nézve Ha az ssdna assay eredményét pozitívnak értékeltük, akkor az ssdna egységeket az alábbi klinikai kategóriák értékeivel vethetjük össze: Kisebb, mint 68.6 U/mL Negatív ssdna antitestekre nézve U/mL Mérsékelten pozitív ssdna antitestekre 229 U/mL fölött Erősen pozitív ssdna antitestekre Egyes ssdna és ds DNA antitestekre is erősen pozitív (2.0 OD érték fölött) minták ssdna aktivitását nehéz lehet meghatározni. Ha a minta erősen pozitív, a számított arány félrevezető lehet, mivel az ELISA rendszer telítve van a beteg autoantitestjeivel. Javasoljuk az ssdna és dsdna antitestre is erősen pozitív minták ismételt vizsgálatát úgy, hogy a mintát tovább hígítjuk az alaphígításból 1 :4 és 1 :20 arányban (vagyis 1:404 és 1:2020 arányban hígítva) HRP mintahígítóval, hogy biztosan meg lehessen határozni, hogy a minta antissdna aktivitása nagyobb, vagy az anti-dsdna reaktivitása. A fenti számítást ekkor a mintának ugyanabból a hígításából végzett mérések eredményével kell elvégezni. A módszer korlátai 1. Mivel az IgG antitesteket klinikailag jelentősebbnek tartják, 13,14,15 ez az assay egy IgG specifikus konjugátumot használ. A tesztben nem vizsgált IgM ssdna antitestek versenyezhetnek a rendelkezésre álló kötőhelyekért az IgG antitestekkel. Ha felmerül az IgM antitest interferencia gyanúja, a vizsgálatot nagyobb hígítással meg kell ismételni. Az eredmény éles növekedése az adott mintában versengő IgM antitestek jelenlétére utal. Az új érték az anti-ssdna IgG antitestek mennyiségének pontosabb meghatározását adja a beteg mintájában. 2. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nem-specifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 3. Mivel mind az egyláncú DNS (ssdna) és bizonyos kettős láncú DNS (dsdna) autoantitestek reagálhatnak a kitben használatos ssdna antigénnel, a betegek mintáit párhuzamosan kell vizsgálni dsdna reaktivitásra is, és ezeket az eredményeket számításba kell venni az ssdna reaktivitás meghatározásánál. 4. Változatos tényezők befolyásolhatják a teszt eredményét. Ilyenek a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, az eredmények lemérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése közben előforduló időtartam-eltolódások. Nagy gondot kell fordítani a munka folyamán a feltételek következetes betartására, hogy valós és reprodukálható eredményeket kapjunk. 5. A QUANTA Lite TM ssdna Antitest ELISA nem egy független assay az ssdna antitestek meghatározására. Minden esetben együtt kell használni az INOVA Diagnostics, Inc.'s QUANTA Lite TM dsdna Antitest ELISA kitjével, hogy meghatározható legyen az ssdna antitestek koncentrációja. Ne használjon más gyártótól vásárolt dsdna Antitest kitet, mivel az INOVA ssdna Antitest ELISA és a dsdna Antitest ELISA kitek kalibrációja össze van hangolva. 6. A teszt eredményeit minden esetben a klinikai adatokkal és más szerológiai vizsgálatok eredményével együtt kell értékelni. 7. A teszt működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek A QUANTA Lite TM ssdna ELISA teszt alkalmasságát az ssdna antitestek detektálására egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető ELISA kittel összehasonlítva értékelték. A referens ELISA eredményét a gyártó előírásainak megfelelően értékelték. Referencia tartomány Száztizenhét random normál szérum mintát választottak ki és tesztelték a QUANTA Lite TM ssdna ELISA kit használatával. Ezek közül a minták közül hétben találtak 69 egységnyi vagy nagyobb reaktivitást (vagyis ezzel az ELISA módszerrel pozitív eredményt). Ebből a hét mintából öt egy kereskedelmi referencia 6

7 módszerrel is anti-ssdna antitest pozitív volt és emiatt a normál populáció további értékelésből ezeket kihagyták. A vizsgált minta populáció átlagos aktivitása 27, a standard deviáció 21 volt. A populáció eredményeinek tartománya 12-től 186-ig terjedt. Ez a kísérlet azt mutatja, hogy egy átlagos normál minta reaktivitása a küszöbértéknél 2.0 standard deviáció értékkel kisebb. Relatív szenzitivitás és specificitás Harminckét random ANA pozitív mintát vizsgáltak a QUANTA Lite TM ssdna teszttel és egy másik, kereskedelemben kapható kittel (Referencia). Tizennyolc minta volt pozitív és 12 minta volt negatív mindkét módszerrel. Két minta pozitív lett a referencia módszerrel, miközben az Inova teszttel negatív volt. Ez a két minta egy másik kereskedelemben kapható kittel mérve negatív lett. Az eredményeket az alábbiakban foglaljuk össze : INOVA Relatív Szenzitivitás 90% Referencia Relatív Specificitás 100% Relatív Hatékonyság 94% Az ssdna szilárd fázis specifikusságának további vizsgálatához különböző nayg titerű, monospecifikus autoantitest kontrollokat teszteltek a QUANTA Lite TM ssdna kit használatával. Ezek között voltak a következő INOVA QUANTA Lite TM ELISA kitek nagy titerű kontrolljai: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, Thyreoidea Microsoma és Thyreoglobulin, Hiszton és Mitochondrium M2. Valamennyi felsorolt kontroll negatív eredményt adott az ssdna tesztben. ssdna Reactivitás különböző kötőszöveti betegségekben Vizsgált betegek száma Pozitív % SLE Sjogren szindróma Scleroderma Polymyositis 6 17 Gyógyszer-indukált Lupus Rheumatoid Arthritis 11 45* * az 5 pozitív mintából 2 csak határérték-pozitív volt (69 és 99 egység). Az SLE betegek közül 25 volt ssdna pozitív. Az ssdna pozitív betegek közül hat kétes eredményt adott egy érzékeny kettős láncú DNS (dsdna) ELISA módszerrel (INOVA). A 21 Sjogren szindrómás beteg közül 13 volt ssdna pozitív. Mind a 21 beteg pozitív volt SS-A, SS-B vagy együttes SS-A és SS-B ELISA vizsgálattal (INOVA). A Sjogrenes minták közül 3 ssdna pozitív volt, miközben teljesen negatív eredményt adott egy érzékeny dsdna ELISA módszerrel (INOVA). A 15 Scl-70 pozitív scleroderma betegből 12 volt ssdna pozitív és a 6 polymyositises beteg közül csak 1 volt pozitív. A polymyositises betegek mindegyike pozitív volt Jo-1 autoantitestre ELISA módszerrel (INOVA). Az egyetlen polymyositises beteg, aki ssdna pozitív lett (112U) tökéletesen negatív eredményt adott az anti-dsdna ELISA tesztben (INOVA). Precizitás és reprodukálhatóság Az assay precizitását és reprodukálhatóságát egy negatív, egy mérsékelten pozitív és egy erősen pozitív mintából végzett hat párhuzamos méréssel határozták meg, négy különálló mérési sorozatban. Az erősen pozitív minta átlagos értéke 814 egység volt, a mérsékelten pozitív mintában 300 egység, a negatív mintában 72 egység átlagos reaktivitást mértek. Az egyes mintákra jellemző standard deviációk és variációs koefficiensek vannak összefoglalva az alábbi táblázatban : Negatív Erősen pozitív Mérsékelten pozitív SD CV SD CV SD CV Összesített % % % Sorozaton belül % % % Sorozatok között % % % 7

8 Hivatkozások 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ana): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA is systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Provost TT, Herrera-Esparza R and Diaz LA: Nucleoprotein autoantibodies in lupus erythematosus. J. Invest. Dermatol. 85: , Koffler D, et al: Occurence of single-stranded DNA in serum of patients with systemic lupus erythematosus and other diseases. J. Clin. Invest. 52: , Land A: Evaluation of the simultaneous estimation of antidsdna and antissdna antibodies for clinical purposes. Clin. Exp. Immunol. 31: , Gripenberg M, et al: Assessment of class-specific antibodies against denatured DNA in patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Immunol. 5: 314, Maddison PJ, Provost TT and Reichlin M: Serological findings in patients with "ANA" negative systemic lupus erythematosus. Medicine(Baltimore) 60: 87-94, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition (HHS Pub. # (CDC) ). A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service HUN May 2007 Revision HUN0 8