QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM CCP IgG egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) az anti-ccp (Ciklikus Citrullinált Peptid) IgG antitestek szemi-kvantitatív kimutatására humán szérumban. A CCP IgG antitestek jelenléte felhasználható a klinikai adatokkal és más laboratóriumi vizsgálatok eredményével együtta rheumatiod arthritis diagnosztikájában. A teszt összegzése és magyarázata A Rheumatoid Arthritis (RA) az egyik leggyakoribb szisztémás autoimmun betegség. A betegség etiológiája ismeretlen. Földünk népességének kb 0.5%-át érinti, és kétszer annyi nő betegszik meg, mint férfi 1. Az RA diagnózisaelsősorban a betegség klinikai megnyilvánulásán alapszik. Egészen a legutóbbi időkig az egyetlen szerológiai teszt, amelyet RA esetén rutinszerúen végeztek, a rheumatoid faktor (RF) jelenlétének kimutatása volt a szérumban. Az RF az antitestek olyan csoportja, amely IgG osztályba tartozó immunglobulinok Fc régiója ellen termelődött. Az RF IgM, IgG, és IgA immunglobulin osztályba egyaránt tartozhat. Az IgM RF jelenléte perdöntő az RA diagnózisa szempontjából, a betegek megközelítőleg 50%- 90%-ában kimutatható 1,2. Találtak azonban IgM RF pozitivitást fertőzésekben, más autoimmun betegségekben, és ritkán egészséges személyekben is 1,2. Az IgG RF kevésbé érzékeny, de specifikusabb RA szempontjából, mint az IgM RF 2. A betegség eredményes gondozása szempotjából fontos a betegséget minél korábbi stádiumban diagnosztizálni, és az RA betegek kezelését a lehető legkorábban elkezdeni 3. Évek óta ismeretes, hogy antiperinuclearis autoantitestek, más néven anti-keratin antitestek találhatók RA betegekben 4,5. Újabban megfigyelték, hogy ezek az autoantitestek egy olyan epitopot ismernek fel, amelyik az arginin deiminált formáját, a citrullint tartalmazza 6. Egy citrullint trtalmazó, szintetikus cirkuláris peptid, amit CCP (ciklikus citrullinált peptid) névvel jelölnek, jobbnak bizonyult a RA betegeknek más betegektől való megkülönböztetése szempontjából, mint akár a perinuclearis autoantitestek vizsgálata, akár a rheumatoid faktor kimutatása A megjelent közleményekben az RA betegek közelítőleg 70%-a pozitív anti-ccp IgGre, míg a random egészséges véradók és más betegségben szenvedő kontrolloknak csak körülbelül 2%-a pozitív. Egy újabb tanulmányban citrullinált proteineket találtak RA betegek ízületeiben, de nem találtak ilyen fehérjét más ízületi betegségben szenvedők ízületeiben 12. Ezek az eredmények elméleti alapot kínálnak az anti-ccp IgG jelenlétének magyarázatához, és utalnak ezeknek az autoantitesteknek az esetleges pathogenitására is. A módszer elve A QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA tesztben használt antigén egy szintetikus ciklikus citrullinált peptid, amiről kimutatták, hogy nagy érzékenységgel és specifitással használható a rheumatoid arthritises betegek szérumában lévő antitestek detektálására. Ezt az antigént rögzítették polisztirén mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő CCP IgG antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett antihumán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a minta-edényekben kialakult szín intenzitását a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított szintetikus CCP antigénnel (12-1 x 8 mérőhely) bevonva, tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek humán anti-ccp IgGantitestek, előhígítva, 1.2mL 1

2 3. CCP IgG ELISA Low Positive (Mérsékelten pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-ccp IgG antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. CCP IgG ELISA High Positive (Erősen pozitív kontroll)/kalibrátor A, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-ccp IgG antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. CCP IgG ELISA Kalibrátor B, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-ccp IgG antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 6. CCP IgG ELISA Kalibrátor C, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-ccp IgG antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 7. CCP IgG ELISA Kalibrátor D, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-ccp IgG antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 8. CCP IgG ELISA Kalibrátor E, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-ccp IgG antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 9. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínű, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 10. HRP Mosó Koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 11. HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kékre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 12. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 13. HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a CCP IgG ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll, a CCP IgG ELISA Erősen Pozitív Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék-kezelő 2

3 eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése, A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 CCP IgG ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL CCP IgG ELISA Mérsékelten pozitív kontroll előhígítva 1 1.2mL CCP IgG ELISA Erősen pozitív kontroll/kalibrátor A előhígítva 1 1.2mL CCP IgG ELISA Kalibrátor B előhígítva 1 1.2mL CCP IgG ELISA Kalibrátor C előhígítva 1 1.2mL CCP IgG ELISA Kalibrátor D előhígítva 1 1.2mL CCP IgG ELISA Kalibrátor E előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Mosó Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 3

4 1 10mL HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, , és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény az HRP Mosó Koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó, ami képes az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer, Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP Mosó Koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP Mosó Koncentrátumos üveg tartalmát 975mL desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer 1 hétig stabil 2 8 C között tárolva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a CCP IgG ELISA Mérsékelten Pozitív, a CCP IgG ELISA Erősen Pozitív és az ELISA Negatív Kontrollt. 4. Az anti-ccp IgG antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységben történő meghatározása céljából használjon minden egyes kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. 5. Amennyiben igény van rá, az eredmények egy 5 pontos standard görbe segítségével kvantitatív módon is értékelhetők. Az 5 pontos standard görbe pontjainak meghatározásához A-tól E-ig, használja az ELŐHÍGÍTOTT CCP IgG Kalibrátorokat A-tól E-ig közvetlenül a reagens-üvegből. Az öt pontos standard görbe értékei a következők: Pont A Előhígított CCP IgG ELISA Kalibrátor A B Előhígított CCP IgG ELISA Kalibrátor B C Előhígított CCP IgG ELISA Kalibrátor C 62.5 D Előhígított CCP IgG ELISA Kalibrátor D E Előhígított CCP IgG ELISA Kalibrátor E Egységek A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t mind az előhígított CCP IgG ELISA Mérsékelten Pozitív, a CCP IgG ELISA Erősen Pozitív kontrollokból, a B E kalibrátorokból, amennyiben szükségesek, az ELISA Negatív Kontrollból és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon µL hígított HRP Mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet.

5 4. Adjon 100μL HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. A CCP IgG ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll, a CCP IgG ELISA Erősen Pozitív Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a CCP IgG ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll, a CCP IgG ELISA Erősen Pozitív Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított CCP IgG ELISA Erősen Pozitív Kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított CCP IgG ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított CCP IgG ELISA Erősen Pozitív Kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A CCP IgG ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA Negatív Kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint d. Az ELISA Negatív Kontroll és a CCP IgG ELISA Erősen Pozitív Kontroll a reagens minőségének jelentősebb eltérését kontrollálja. A CCP IgG ELISA Erősen Pozitív Kontroll használata nem garantálja a precizitást az assay küszöb (cutoff) koncentrációja közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. A szemi-kvantitatív eredmények kiszámítása arányosság-módszer Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja a CCP IgG ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll OD átlagával. Az eredményt megszorozza a CCP IgG ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll címkéjén található egységek mérőszámával. Minta OD Minta éretéke = x CCP IgG ELISA Mérs. Pozitív Kontroll (egység) CCP IgG ELISA Mérs.Poz.Kontroll OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére 5

6 nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Opcionális számítási módszer: szemi-kvantitatív eredmények standard görbe használatával Az eredmények számítása az opcionális standard görbe segítségével. 1. Határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. 2. Ábrázolja a minták átlagos abszorbancia (OD) értékeit a standard görbén a megfelelő Egység értékekkel szemben. Használjon linearis/linearis Cubic Spline (harmadfokú polynomialis) vagy a pontok összekötésével keletkező görbének megfelelő illesztési módszert a görbe megrajzolásához. Határozza meg az ismeretlen minták CCP IgG koncentrációját Egység -ben (Unit) az "Y" tengelyen, úgy, hogy leolvassa a hozzá tartozó abszorbancia értéket az "X" tengelyen. Számítsa ki az ismeretlen Egység értékeket. 3. Megjegyzés: Az arányosság módszerével számított értékek nem lesznek azonosak a standard görbe alapján számított eredményekkel. A nagyobb értékek esetében az eltérés kifejezettebb lesz, mint a kis koncentrációknál. A CCP IgG Erősen Pozitív Kontroll értéke az arányossági módszerrel nem lesz 250 Egység. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi értékek csak tájékoztató jellegűek. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A mintákat az alábbi táblázat segítségével besorolhatjuk a negatív, gyengén pozitív, mérsékelten pozitív vagy erősen pozitív csoportba. Egység Negatív < 20 Gyengén pozitív Mérsékelten Pozitív Erősen pozitív A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában CCP IgG antitestek vannak, és felveti RA lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs CCP IgG antitestje, vagy annak koncentrációja a teszt negatív küszöbe alatt van. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi meállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott CCP IgG értékek ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgG érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nem-specifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Nem minden RA beteg lesz pozitív CCP IgG antitestre. 3. A teszt eredményeit minden esetben a klinikai adatokkal és más szerológiai vizsgálatok eredményével együtt kell értékelni. 4. A teszt működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. 5. Az anti--ccp IgG diagnosztikai értéke Juvenilis Rheumatoid Arthritises betegekben még nincs meghatározva. Várható értékek A QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA alkalmasságát a CCP IgG antitestek detektálására kétféleképpen tesztelték. Két különálló külső klinikai értékelés és egy nagy belső tanulmány során összehasonlították egy IgG RF ELISA módszerrel, és mérték az anti-ccp IgG-t klinikai betegcsoportokban, RA vagy más szisztémás autoimmun betegség diagnózisával. 6

7 Referencia tartomány Válogatás nélküli véradóktól (118 nő és 98 férfi, átlag életkor 39 év) összesen 216 mintát vizsgáltak. Két minta (1%) volt pozitív anti-ccp IgG-re. Az egyik erősen pozitív volt anti-ccp IgG-re, és az IgG RF tesztben is, ami az RA specifikus markere, erősen pozitív lett. A másik minta gyengén pozitív, mindössze 21 Egységgel. Klinikai szenzitivitás és specificitás Az alábbi táblázatban valamennyi klinikai tanumányunk eredményeit összegeztük. Az RA betegek esetében a diagnózist az ARA kritériumok 14 alapján és a konzultáló rheumatológus legjobb tudása szerint állították fel. A klinikai eredmények összefoglalása: Betegcsoportok CCP IgG ELISA CCP IgG ELISA n n 20 Egység (%) n 40 Egység (%) Random véradók 216 2* (1%) 1 (0.5%) Rheumatoid Arthritis (76%) 158 (63%) Rheumatoid Arthritis RF (90%) 142 (78%) Rheumatoid Arthritis RF (40%) 16 (23%) Rheumatikus betegség (9%) 16 (5%) SLE * (10%) 3 (3%) Scleroderma 86 10* (12%) 7 (8%) Sjögren Szindróma 38 0 (0%) 0 (0%) Egyéb rheumatikus betegségek 109 9* (8%) 6 (6%) Cryoglobulinemia 29 2 (7%) 1 (3%) Fertőzéses megbetegedés 87 2 (2%) 1 (1%) Egyéb betegek 29 1 (3%) 0 (0%) *Egyes minták, amelyek CCP IgG antitest-pozitívak voltak, IgG RF vizsgálattal is pozitív eredményt adtak, ami az RA-nak egy másik ellenanyag markere. Ezek közé tartozott egy véradó, 2 SLE beteg, 4 Sclerodermabeteg, és három beteg másféle rheumatikus betegségekkel. Kereszt-Reaktivitás A QUANTA Lite CCP IgG ELISA más autoantitestekkel való potenciális kereszt-reaktivitásának meghatározása 22 minta felhasználásával történt, amelyek közül mindegyikben valamilyen más autoimmun antitest nagy koncentrációban volt jelen. Ebben a csoportban megtalálható 2-2 olyan minta, amelyik reaktív volt SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, TPO, Ribo-P, M2, chromatin és DNA antigénekkel. Mindegyik minta negatív volt anti-ccp IgG-re. A fenti tanulmányban nem lehetett kimutatni szignifikáns kereszt-reaktivitást a QUANTA Lite CCP IgG ELISA és a sokféle autoantitest között. Precizitás és reprodukálhatóság A sorozatok közötti (between-assay) variabilitást negatív, mérsékelten pozitív és erősen pozitív mintákból mintánként két-két párhuzamos méréssel határozták meg, 6 elkülönülő analitikai sorban, 6 különböző napon. A sorozaton belüli (within-assay) variabilitás meghatározásához 5 mintát mértek le, mindegyiket 9-szer ugyanazon a lemezen. A táblázatban reprezentatív eredmények láthatók: Sorozatok közötti variabilitás 1. Neg. 2. Neg. 1. gy.poz. 2. gy.poz. 1.mérs. 2. mérs. 1. erős poz. 2. erős poz. Átlag 2.5 U 2.1 U 21 U 31 U 42 U 47 U 103 U 168 U SD CV% 11% 7% 6% 6% 6% 7% 5% 7% Sorozaton belüli variabilitás 1. Neg. 1. mérs. 1. erős poz. 2. erős poz. 3. erős poz. Átlag 2 U 52 U 107 U 109 U 175 U SD CV% 11% 9% 5% 4% 3% Amikor egy gyengén pozitív mintát teszteltek 45-ször ugyanazon a lemezen, a CV 6% volt. 7

8 Hivatkozások 1. Wener MH: Rheumatoid Factors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, Rose NR et al, eds, American Society for Microbiology Press, (2002). 2. Borretzen M, et al: Rheumatoid Factors. Autoantibodies, Peter JB and Y Shoenfeld, eds, Elsevier Science B.V., (1996). 3. Kim JK and MH Weisman: When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know? Arthritis Rheum 43: (2000). 4. Vincent C, et al: Immunoblotting detection of autoantibodies to human epidermis filaggrin: a new diagnostic test for rheumatoid arthritis. J Rheumatol 25: (1998). 5. Serre G, et al: Filaggrin (keratin) autoantibodies. Autoantibodies, Peter JB and Y Shoenfeld, eds, Elsevier Science B.V., (1996). 6. Van Venrooj WJ: Citrullination: a small change for a protein with great consequences for rheumatoid arthritis. Arthritis Res 2: (2000). 7. Schellekens GA, et al: The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum 43: (2000). 8. van Jaarsveld CHM, et al: The prognostic value of the antiperinuclear factor, anti-citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor in early arthritis. Clin Exp Rheum 17: (1999). 9. Bizzaro N, et al: Diagnostic accuracy of the anti-citrulline antibody assay for rheumatoid arthritis. Clin Chem 47: (2001). 10. Kroot E-JJA, et al: The prognostic value of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in patients with recent-onset rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 43: (2000). 11. Combe B, et al: Prognostic factors for radiographic damage in early rheumatoid arthritis: a multiparameter prospective study. Arthritis Rheum 44: (2001). 12. Baeten D, et al: Specific presence of intracellular citrullinated proteins in rheumatoid arthritis synovium. Arthritis Rheum 44: (2001). 13. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition (HHS Pub. #(CDC ). 14. Arnett FC, et al: The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 31: (1988). A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service HUN May 2007 Revision HUN0 8