ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M1551

Átírás

1 Sanquin Reagents Plesmanlaan 5 0 CX Amsterdam The Netherlands Telefon: Fax: reagents@sanquin.nl Honlap: M55/ November 007 ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M55 A szérumban a humán IgG alosztályok kvantitatív meghatározására szolgáló ELISA készlet (hu) Ab BLACK BUF CAL CONJ CONTROL hu ellenes antitestek Fekete Puffer Kalibrátor Konjugátum Kontroll DIL GREEN HRP HUM HO MOU hu Hígítópuffer Zöld HRP Humán Hidrogénperoxid Egér RED SEALS STOCK STOP SUB SUBS hu Piros Öntapadós filmek Törzsoldat Leállítópuffer Alosztályok Szubsztrát WASH WELL YELLOW hu Mosópuffer Cellák Sárga Tartomány ELISA REF PeliClass ELISA kit M800 x8 WELL aigg, aigg RED BLACK M80 x8 WELL aigg, aigg YELLOW GREEN M80 0. ml CAL M80 0. ml CONTROL M80 0. ml HRP MOU Ab HUM IgG CONJ M ml BUF WASH STOCK :0 M80 0 ml BUF DIL STOCK :0 M808 5 ml BUF SUBS STOCK :0 M80.0 ml ABTS STOCK :50 M ml HO STOCK :00 M807 0 ml BUF STOP SEALS

2 hu I. BEVEZETÉS A humán IgG immunglobulin négy alosztályból áll: IgG, IgG, IgG és IgG. Az IgG alosztályok biokémiai jellemzői részletesen leírásra kerültek (5). Az IgG alosztályok közötti különbségek számos, biológiailag fontos funkció esetében megnyilvánulnak, mint például az antigénfelismerés, a komplementaktiváció és a sejtfelszíni receptorokhoz való kötődés. Számos tanulmány eredményei arra utalnak, hogy az IgG alosztályok kóros szérumszintjei különböző betegségekkel kapcsolatosak. Különösen a szelektív IgGalosztályhiány és a vírusos vagy bakteriális fertőzések iránti fokozott fogékonyság közötti kapcsolatot dokumentálták részletesen (, 5). Visszatérő felső és alsó légúti fertőzésekben szenvedő betegek esetében alacsony szérum IgG vagy IgGkoncentrációkról számoltak be. Mások összefüggést találtak a nagyon alacsony szérum IgGkoncentrációk és a visszatérő szinopulmonális fertőzések között (). Az IgG alosztály kóros szérumkoncentrációit figyelték meg autoimmun betegségekben, neurológiai kórképekben és HIV fertőzés esetén is (). II. TECHNOLÓGIAI ALAPELVEK A PeliClass humán alosztály ELISA készlet szendvics típusú, enzimatikus immunoassay. A készlet az egyes humán IgG alosztályokra specifikus, nagyon aktív monoklonális antitestekkel bevont mikrocellacsíkokat tartalmaz. A tesztminták, valamint a kalibrátor és kontroll szérumok inkubációja a megfelelő cellákban történik. A meghatározandó IgG alosztály a szilárd fázishoz kötődik, a nem kötött IgGt pedig mosással távolítják el a rendszerből. Ezután a cellákhoz peroxidázzal konjugált antihumán IgG antiszérumot adnak, a nem kötött konjugátumot pedig mosással távolítják el. Szubsztrátoldattal (ABTS) és HOvel történő inkubációt követően a reakciót savas pufferrel állítják le. A zöld színű reakcióterméket az abszorbanciája alapján mérik, az IgG alosztály tesztmintában lő koncentrációját pedig egy referenciagörbe értékeihez viszonyítva számítják ki. Az IgG alosztályhoz tartozó kontroll szérumot azért mérik, hogy ellenőrizzék a kalibrációs görbék validitását és az IgGalosztály meghatározásainak pontosságát. A kalibrátor(ok)ban lő IgGalosztály koncentrációit a WHO 7/97 referenciakészítményből származó kalibrátor felhasználásával határozták meg. Az IgG esetében az 5,0 g/les, az IgG esetében a, g/les, az IgG esetében a 0, g/les, míg az IgG esetében a 0,5 g/les, javasolt célértékeket alkalmazták (7). III. TÁROLÁS ÉS STABILITÁS A PeliClass humán alosztály ELISA készlet függőleges helyzetben, 8 Con tárolandó. A címkén látható lejárati dátumig használható fel. A felbontás utáni stabilitás 8 Con történő tárolás esetén minden komponensre vonatkozóan hét. A szállítási körülmények eltérhetnek a tárolási körülményektől. IV. A KÉSZLET TARTALMA Lásd a terméktájékoztató elején található táblázatot. A PeliClass humán alosztály ELISA készlet minden alosztályra vonatkozóan 8 teszthez elegendő reagenst tartalmaz, beleértve a kalibrátorokat, a kontrollokat és a vak mintákat. A monoklonális antitesteket szövetkultúramédiumból, oszlopkromatográfia (ioncserés és affinitáskromatográfia) segítségel tisztították. A kalibrátor és a kontroll folyékony humán szérum. V. TOVÁBBI SZÜKSÉGES ANYAGOK A mosó, hígító és szubsztrátpufferek hígításához desztillált víz. A térfogatok pontos kiméréséhez pipettázó eszközök. Inkubátor (7 ± C). Standard ELISA mosó vagy 500 mles műanyag adagolópalack a csíkok automata vagy kézi mosásához. Standard ELISA leolvasó az abszorbancia méréséhez vagy 05 nmen. Logaritmikuslineáris milliméterpapír. VI. A TESZTMINTA KEZELÉSE Csak szérumminták tesztelhetők. A mintáknak a lehető legfrissebbeknek vagy fagyasztva tároltnak kell lenniük. A mintákat a használat előtt manuálisan hígítani kell (lásd a VII., AZ ASSAYPROTOKOLL című részt). VII. AZ ASSAYPROTOKOLL Hagyja, hogy a reagensek felvegyék a szobahőmérsékletet (8 5 C), és alaposan keverje fel őket. Kerülje a buborék és habképződést. Javasoljuk, hogy minden mintát, kontrollt és kalibrátorhígítást két példányban teszteljen.. MIKROTITER LEMEZ A PeliClass humán IgG alosztály ELISA készlet flexibilitása lehetővé teszi, hogy a lemezek egyes részeit különböző alkalmakkor használhassák. A műanyag tasak kibontása előtt számolja ki, hogy hány csík szükséges a kívánt számú minta teszteléséhez, és adjon hozzá még cellát a kalibrátorok, kontrollok és vak minták két példányban történő vizsgálatához. Vegye ki azokat a csíkokat a lemez keretéből, amelyeket nem fog használni, és csomagolja vissza őket a szárítószert tartalmazó műanyag tasakba, majd tárolja azt 8 Con.. A PUFFEREK ELŐKÉSZÍTÉSE Mosópuffer: Készítse elő a mosópuffert úgy, hogy a mosópufferkoncentrátumot tartalmazó palackban található teljes mennyiséget 950 ml desztillált vízhez adja. A felhígított mosópuffer 8 Con tárolandó, és hétig marad stabil. Megjegyzés: A koncentrált puffer sókristályokat tartalmazhat. A vizsgálathoz megfelelő koncentrációjú puffer elkészítése előtt GYORSAN melegítse föl a koncentrált puffert 7 Cosra, hogy a kristályok feloldódjanak. Hígítópuffer: Számítsa ki a szükséges hígítópuffer mennyiségét (körülbelül ml hígítatlan puffer mikrocellacsíkonként), és készítsen a teszteléshez megfelelő koncentrációjú oldatot a puffer tízszeres mennyiségű desztillált vízben történő felhígításával.. A KALIBRÁTOR ÉS KONTROLL SZÉRUMOK ELŐKÉSZÍTÉSE A koncentrációkat illetően lásd a mellékelt terméktájékoztató. és. táblázatát. Kalibrátor: (Lásd a mellékelt terméktájékoztató. táblázatát) Címkézzen fel egy 0 mles csövet az :500 felirattal, illetve nyolc mles csövet a Kaltől Kal8ig terjedő feliratokkal.

3 Pipettázzon,99 ml hígítópuffert a 0 mles, csőbe és adjon hozzá 0 µlnyi kalibrátorszérumot (kezdeti, :500 arányú hígítás). Pipettázzon,9 ml hígítópuffert a Kal címkéjű csőbe, és,0,0 mlt a Kal Kal8 feliratú csövekbe. Pipettázzon 00 µl :500 hígítású kalibrátort a Kal jelű csőbe, és ebből a csőből készítsen hét, kétszeres hígítási sort úgy, hogy az előző hígításból,0 mlt a következő Kal csőbe pipettáz. Válassza ki az egyes IgG alosztályokhoz tartozó kalibrátorhígítási sort: IgG : : IgG, IgG és IgG :0 000 : Kontroll: Címkézzen fel egy csövet az :500 felirattal, illetve két mles csövet az :0 000 (az IgG,, esetében) és az :0 000 (az IgG esetében) feliratokkal. Az :500 címkéjű csőbe pipettázzon,99 ml hígítópuffert és 0 µl kontroll szérumot. Az :0 000 címkéjű csőbe pipettázzon 885 µl hígítópuffert és 5 µl, :500 arányú hígított oldatot. Az :0 000 címkéjű csőbe pipettázzon 875 µl hígítópuffert és 5 µl, :0 000 arányú hígított oldatot. Készítsen el egy mles csövet ml hígítópufferrel vak mintának.. A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE Hígítsa fel a tesztmintákat a hígítópufferrel a kontroll szérum esetében alkalmazott protokoll szerint. A megadott tartományokon (lásd a mellékelt terméktájékoztató. táblázatát) kívül eső eredmények esetében a tesztet meg kell ismételni egy másik hígítású mintával. 5. ELSŐ MOSÁSI LÉPÉS A szükséges mikrocellákat mossa le négyszer a lemezkeretben a mosópufferrel. Kézi mosás esetén teljesen töltse fel a cellákat mosópufferrel (> 00 µl), majd öntse ki, és ismételje meg ezt az eljárást háromszor. Végül a celláknak teljesen üresnek kell lenniük. A következő reagenst azonnal a cellákba kell adagolni; ne hagyja, hogy szárazon álljanak hosszabb ideig.. ELSŐ INKUBÁLÁSI LÉPÉS Adjon 00 µl hígított kalibrátort, kontrollt, mintát és vak mintát a megfelelő cellákba. Fedje be a mikrotiter lemezt öntapadós filmmel, majd finoman rázza össze a széle ütögetésel néhány másodpercig, hogy a cellák tartalma összekeveredjen. óráig inkubálja 7 Con. Közvetlenül a mosás előtt készítse el a következő inkubációs reagenst a 8. pontban leírtak szerint. 7. MÁSODIK MOSÁSI LÉPÉS Szívja le a felülúszót a cellákból, és mossa meg a lemezt az 5. pontban leírtak szerint. 8. INKUBÁLÁS HRPKONJUGÁLT, HUMÁN IgGELLENES ANTITESTTEL Hígítsa fel a konjugátumot :500 arányban úgy, hogy 0 µl konjugátumot,97 ml hígítópufferhez pipettáz. Hígítsa tovább a konjugátumot: :000 arányban úgy, hogy az :500 hígítású oldatból, mlt,0 ml hígítópufferhez pipettáz. :000 arányban úgy, hogy az :500 hígítású oldatból,0 mlt,0 ml hígítópufferhez pipettáz. :000 arányban úgy, hogy az :500 hígítású oldatból,5 mlt,5 ml hígítópufferhez pipettáz. Adjon: az :500 hígítású oldatból 00 µlt az antiigg mikrocellacsíkokhoz; az :000 hígítású oldatból 00 µlt az antiigg mikrocellacsíkokhoz; az :000 hígítású oldatból 00 µlt az antiigg mikrocellacsíkokhoz; az :000 hígítású oldatból 00 µlt az antiigg mikrocellacsíkokhoz. Fedje be a lemezt öntapadós filmmel, majd finoman rázza össze a széle ütögetésel néhány másodpercig, hogy a cellák tartalma összekeveredjen. óráig inkubálja 7 Con. Közvetlenül a mosás előtt készítse el a következő inkubációs reagenst a 0. pontban leírtak szerint. 9. HARMADIK MOSÁSI LÉPÉS Szívja le a felülúszót a cellákból, és mossa meg a lemezt az 5. pontban leírtak szerint. 0. INKUBÁLÁS ABTSSZUBSZTRÁTTAL Számítsa ki a szubsztrátoldat kívánt mennyiségét (mikrocellacsíkonként körülbelül 0,9 ml szükséges). Adjon 00 µl hidrogénperoxid törzsoldattal és 00 µl ABTS törzsoldattal ekvivalens mennyiséget 0 mlnyi, a teszteléshez megfelelő koncentrációjú szubsztrátpufferhez ( ml szubsztrát törzsoldat + 8 ml desztillált víz). Adagoljon 00 µl szubsztrátoldatot az összes cellába. Finoman rázza össze a mikrotiter lemezt a széle ütögetésel néhány másodpercig, hogy a cellák tartalma összekeveredjen. Inkubálja 0 percig szobahőmérsékleten (8 5 C).. AZ ENZIMATIKUS REAKCIÓ LEÁLLÍTÁSA Adjon 50 µl leállítóoldatot az összes cellába.. A LEMEZ LEOLVASÁSA órán belül olvassa le a lemezt ELISA leolvasóval (lehetőség szerint) vagy 05 nmen. VIII. EREDMÉNYEK ÉS AZ ADATOK ÉRTELMEZÉSE Jegyezze fel az egyes cellákhoz tartozó, (lehetőség szerint) vagy 05 nmen mért abszorbanciaértékeket, a kettős mérések értékeinek pedig vegye az átlagát. Minden minta esetében a kettős mérések értékei nem különbözhetnek 5%nál nagyobb mértékben az átlagértéktől. Ha ez a feltétel nem teljesül, meg kell ismételni a tesztelést. Ábrázolja a kalibrátorok átlagos abszorbanciaértékeit (y tengely) a hozzájuk tartozó alosztálykoncentrációk (ng/mlben, x tengely) függvényében logaritmikuslineáris milliméterpapíron, és rajzolja be a legjobban illeszkedő görbét. A kontroll szérum IgGalosztálykoncentrációinak a mellékelt terméktájékoztató. táblázatában megadott tartomány(ok)on belül kell esniük. Az egyes minták átlagos abszorbanciaértékeit vigye át a referenciagörbére. Azokat a mintákat, amelyekhez tartozó átlagos abszorbanciaértékek kívül esnek a referenciagörbe hígításain, megfelelően fel kell hígítani. A tesztmintában talált IgGalosztálykoncentráció értékeléséhez hasonlítsa össze a kapott koncentrációkat az IgG alosztályok normálértékeivel (lásd a X. REFERENCIATARTOMÁNYOK című részt). IX. MÉRÉSI TARTOMÁNYOK A készletspecifikus mérési tartományokkal kapcsolatban tájékozódjon a mellékelt terméktájékoztató. táblázatából.

4 X. REFERENCIATARTOMÁNYOK Az IgG alosztályok referenciatartományai (g/l) egészséges, kaukázusi rasszba tartozó egyének szérummintáiban (8). A többi populáció esetében külön referenciatartományokat kell figyelembe venni. Életkor IgG IgG IgG IgG 0 ½ 9 > ½ 9 8 8, 0,,8,7,8 7,0,0 7,7,5 8,,9 8,5, 9,0,5 9,,7 0,0,0 0,8,0,5,7,8,9, 0,87, 0,8, 0,, 0,, 0,8, 0,5, 0,5,8 0,,0 0,7, 0,85, 0,98,8,0,,50, 0, 0,55 0, 0,70 0,5 0,80 0,5 0,97 0,5,07 0,5, 0,,0 0,, 0,, 0,, 0,5,9 0,8, 0,0,0 0,0 0,5 <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0,79 <0,0,0 <0,0,7 <0,0,58 <0,0,89 0,0,0 0,0,0 0,08,0 XI. a SPECIFIKUS TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK Reprodukálhatóság IgGalosztálykoncentráció IgG IgG IgG IgG assayen belüli variabilitás (%) assayek közötti variabilitás (%) 7 7 b A PeliClass humán IgGalosztálykészlet összehasonlítása a Mancini tesztkészlettel. A szérumok IgG, IgG, IgG és IgGkoncentrációit ELISA assayjel határozták meg, és összehasonlították a Mancini teszt esetében kapott megfelelő értékekkel. A következő korrelációkat állapították meg: IgG alosztály lineáris regressziós egyenes korreláció IgG Y = 0,90X 0,9 0,97 IgG Y =,0X 0,7 0,9 IgG Y = 0,9X + 0,00 0,99 IgG Y = 0,9X 0,0 0,98 Megjegyzés: A teszt specifikus teljesítményjellemzői esetében bemutatott értékek tipikus eredményeket reprezentálnak, és nem tekinthetők a készlet esetében jellemző értékeknek. XII. KORLÁTOZÁSOK. A felhasználónak megfelelő képzésben kell részesülnie, és ismernie kell az ELISA assayeket és teszteljárásokat.. Nagymértékben hemolizált vagy lipémiás mintákat nem szabad használni. A reumafaktort vagy egyéb keringő immunkomplexeket tartalmazó, illetve magas bilirubinkoncentrációjú minták esetében váratlan eredmények születhetnek. Ezeket a mintákat más módszerrel kell analizálni.. A például paraproteinek miatt tartományon kívül eső értékű minták mérését meg kell ismételni különböző hígításokkal.. Az IgG alosztályok egyikének alacsony koncentrációjára vonatkozó lelet sohasem elegendő a pontos diagnózis felállításához, hanem az immunrendszer működésének zavarára utaló jelként kell értékelni, ami további kivizsgálást igényel. 5. Mindig kell kontroll szérumot is használni, a kalibrációs görbék validitásának ellenőrzéséhez. Ha a kontroll eredménye a tartományon kívül esik, a tesztminták eredményei nem megbízhatóak. A tesztet meg kell ismételni.. A különböző sarzsokból származó reagensek nem cserélhetők fel egymással. 7. A reagensmaradékokat (pl. a holttérfogatban lő mennyiséget) nem szabad összekeverni a frissen kinyitott fiolák tartalmával. 8. A kupakok és a fiolák nem cserélhetők össze. A kupakokat csak a megfelelő fiolára szabad visszahelyezni. 9. Annak ellenére, hogy a humán kalibrátor és kontroll szérumokat az EU GMP irányelvei szerint megvizsgálták és nem reaktívnak találták specifikus, betegségterjesztő ágensek markereire vonatkozóan, minden humán eredetű komponenst potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. 0. Tartósítószer: Thiomersal 0,00%.. A keresztkontamináció elkerülése érdekében az ELISA eljárás minden inkubálási/fixálási lépése során új öntapadós filmet kell használni a lemezeken. Ne használjon alumíniumfóliát.. A keresztkontamináció elkerülése érdekében az anyagok minden átvitele során eldobható pipettahegyeket kell használni.. A készlet használatakor minden alkalommal friss hígításokat kell készíteni a kalibrátorokból, a konjugátumból és a pufferekből.. Ne használjon a készlethez mellékelttől eltérő reagenseket és mikrotitercsíkokat. 5. A nátriumazid inaktiválja a HRPt, ezért ne használjon nátriumazidtartalmú oldatokat, és ne adjon nátriumazidot a biztosított pufferekhez.. A hulladékok ártalmatlanításának a laboratóriumi előírásoknak megfelelően kell történnie.

5 XIII. IRODALOMJEGYZÉK. Shakib, F. (Editor), Monograph in Allergy, Karger A.G., 9 (98).. Shakib, F. (Editor), The human IgG subclass, Pergamon Press (990).. Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8: (989).. Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 8:57 (990). 5. Hamilton, R.C., Clin. Chem., :707 (987).. Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., :9 (98). 7. Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 50 9 (985) 8. Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 5:57 (99). 5