QUANTA Lite TM Gliadin IgG II In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM Gliadin IgG II In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Javasolt alkalmazás A QUANTA Lite TM Gliadin IgG II egy enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat (ELISA), amely a gliandin IgG antitestek félkvantitatív kimutatására szolgál humán szérumban. A gliadin antitestek jelenléte, a klinikai eredményekkel és más laboratóriumi tesztekkel együtt, felhasználható a coeliakia (lisztérzékenység) diagnosztizálására. A teszt összegzése és magyarázata A coeliákia, vagy glutén szenzitív enteropathia egy krónikus állapot, melynek legfőbb jellemzője az intestinalis mucosa gyulladása és az epithelium jellegzetes szövettani ellapulása, ami malabsorptios szindrómát eredményez. A betegség pontos etiológiája még nem ismert, de a gliadin, vagyis a búza gluténjének alkohol-oldható frakciója a nyilvánvalóan toxikus ágens. 1 Eredetileg egy sor többszörös vékonybél biopsziára volt szükség a coeliakia és a hozzá kapcsolódó kórképek diagnózisának felállításához. Újabban szerológiai vizsgálatokat ajánlanak szűrésre glutén szenzitív enteropathia gyanúja esetén, valamint később a diéta megtartásának ellenőrzésére. 2-5 Az Europan Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN) javasolja a szerológiai markerek használatát, mint például az anti-gliadin, a reticulin, valamint az endomysium ellenes antitestek használatát annak érdekében, hogy a diagnózis felállításához szükséges biopsziák számát redukálni lehessen. 6 A közelmúltban végzett kutatómunkák során felderítették, hogy a coeliákiás betegekből származó gliadin-reaktív antitestek igen korlátozott számú specifikus epitópot kötnek meg a gliadin molekulán. 7,8 Ugyanezen vizsgálatok során az is kiderült, hogy a gliadin deamidálása a coeliákiával társított enzimmel, a szöveti transzglutaminázzal az anti-gliadin antitestek fokozott kötődéstét eredményezte. A fenti megfigyelések alapján, deamidált és meghatározott peptidek alkalmazásával végzett vizsgálatokról kimutatták, hogy a coeliakiára vonatkozóan az utóbbiaknak nagyobb a diagnosztikai pontosságuk a standard anti-gliadin vizsgálatokhoz viszonyítva. 9 Glutén szenzitív enteropathia esetében mind az IgA, mind pedig az IgG osztályba tartozó gliadin antitestek kimutathatók a betegek szérumaiban. 2,3 Az IgG antitestek a betegség érzékenyebb, de kevésbé specifikus markereinek tűnnek, mint az IgA osztályú antitestek. A gliadin IgA antitestek kevésbé érzékenyek, de specifikusabbak. A veszélyeztetett populációkat érintő érzékeny szűrési stratégia magában foglalja az IgG és az IgA antitestekre vonatkozó tesztelést egyaránt, mivel a coeliakiás betegek jelentős arányban IgA-deficiensek. 10 A Gliadin IgA antitestek fontosak a betegség lefolyásának követése, valamint a gluténmentes diéta betartásának megfigyelése szempontjából. 5 A módszer elve A tisztított gliadin peptideket a polisztirol mikrotiter lemez celláihoz kötik olyan körülmények között, amelyek az antigént natív formában megőrzik. Az előzetesen hígított kontroll mintákat és a betegek hígított szérummintáit a különbözõ cellákba adagolják, lehetõvé téve bármely jelenlévõ gliadin IgG ellenanyag az immobilizált antigénhez kötõdését. A nem kötődött mintát lemossák és mindegyik cellához enzimjelölt anti-humán IgG konjugátumot adnak. Egy második inkubáció lehetővé teszi, hogy az enzimjelölt anti-humán IgG minden olyan, a beteg mintájából származó antitesthez hozzákötődjön, amely korábban a cellához kötődött. Az összes megkötetlen enzimjelölt anti-humán IgG lemosása után a fennmaradó enzimaktivitást kromogén szubsztrát hozzáadásával, és a kialakuló szín intenzitásának mérésével határozzák meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a minta cellákban kialakult szín intenzitását mérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirol mikrotiter ELISA lemez tisztított gliadin peptidekkel bevonva (12-1 x 8 cellák), tartókerettel, deszikkánst tartalmazó fóliatasakba csomagolva 2. ELISA negatív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és humán szérumot tartalmazó puffer, gliadinhoz 1

2 kötődő humán IgG antitestek nélkül, előhígítva, 1,2 ml 3. Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és gliadin IgG elleni humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2ml 4. Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és gliadin IgG elleni humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2ml 5. HRP mintahígító, 1 üveg rózsaszín, tartalmaz: TRIS-pufferolt sóoldatot, Tween 20-at, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat, 50 ml 6. HRP mosókoncentrátum, 1 üveg, 40-szeres koncentrátum - vöröses színű, tartalmaz: Trispufferolt sóoldatot és Tween 20-at, 25 ml. A hígítási javaslatok a Módszerek fejezetben találhatók. 7. HRP IgG konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kékes színű, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10 ml 8. TMB kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10 ml 9. HRP Stop (leállító) oldat, 0,344 M kénsav, 1 üveg színtelen, 10 ml Figyelmeztetések 1. FIGYELMEZTETÉS: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0,02% kloramfenikol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet Kalifornia államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték, és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy teszt módszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV,HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Az oldatok stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólom- vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB kromogén olyan irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP stop (leállító) oldat hígított kénsav oldatot tartalmaz. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Óvintézkedések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek más termékekkel történő helyettesítése téves eredményekhez vezethet. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA cellákból nem megfelelő pontosságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. A teszt adaptációja automatikus mintakezelő rendszerek, vagy más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja a manuális módszerhez képest. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az alkalmazott automatizált rendszer validálása, annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 2

3 5. A teszt teljesítményét több tényező befolyásolhatja. Ilyen a reagensek kezdeti hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványok az ELISA lemez celláiból történő eltávolításának alapossága, a kiértékeléshez használt fotométer, illetve az inkubációs idők hossza. A kapott eredmények megbízhatóságának és reprodukálhatóságának érdekében nagy gondot kell fordítani a következetességre. 6. A protokoll szigorú betartása javasolt. 7. A mikrotiter csöveket és a deszikkánst tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt pontosságának romlását okozza. 8. A HRP konjugátum ugyanazon csövének bizonyos idõ elteltével két- vagy többszöri használata elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása, az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. Az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt a HRP konjugátum kémiailag szennyeződhet. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítőszerek, alkohol vagy detergensek maradványai idővel a HRP konjugátum lebomlását okozzák. Kémiai tisztítószerek/fertőtlenítőszerek használata után a készülékeket és az eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét 2-8 C között tárolja. Nem fagyasztható. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csövek a deszikkánssal együtt, a fóliatasakot biztonságosan lezárva 2-8 C között tárolandók. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig stabil. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják a mérési eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza le és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A lefagyasztott mintákat a kiolvasztás után, és a vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. 18 A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 Gliadin IgG II ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 cella), tartókerettel 1 1,2 ml előhígított ELISA negatív kontroll (ELISA Negative Control) 1 1,2 ml előhígított Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontroll (Gliadin IgG II ELISA Low Positive) 1 1,2 ml előhígított Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontroll (Gliadin IgG II ELISA High Positive) 1 50 ml HRP mintahígító (HRP Sample Diluent) 1 25 ml HRP mosókoncentrátum (HRP Wash Concentrate), 40-szeres koncentráció 1 10 ml HRP IgG konjugátum (HRP IgG Conjugate), (kecske), anti-humán IgG 1 10 ml TMB kromogén (TMB Chromogen) 1 10 ml HRP stop oldat (HRP Stop Solution) 0,344 M kénsav 3

4 További szükséges anyagok, melyeket a kit nem tartalmaz Mikropipetták 5, 100, , és 500 l-es mérésekhez Egyszer használatos mikropipetta hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4 ml térfogattal Desztillált vagy ioncserélt víz 1 l-es edény az HRP mosókoncentrátum hígításához Olyan mikrotiter-lemez leolvasó, ami képes OD mérésre, 450 nm-en (illetve 620nm-en a két hullámhosszon történő méréshez) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosókoncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosókoncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez adja. Ha nem egyszerre kerül a teljes lemez felhasználásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó cellánként adjon 2,0 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez. A hígított puffer 2 8 C között tárolva 1 hétig stabil. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást, a következő módon: adjon 5 µl mintát 500 µl HRP mintahígítóhoz. A hígított mintákat az elkészítésüket követő 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, a Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontrollt és az ELISA negatív kontrollt. 4. A Gliadin IgG antitestek jelenlétének vagy hiányának tetszőleges egységekben való meghatározásához használjon mindhárom kontroll méréséhez két-két cellát, és minden betegminta méréséhez egy vagy két cellát. A betegmintákból párhuzamos minták (duplikátumok) meghatározását javasoljuk. A teszt kivitelezése 1. A TESZT MEGKEZDÉSE ELŐTT VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBAHŐMÉRSÉKLETET (20-26 C). Helyezze a szükséges számú cellát/csövet a keretbe. A fel nem használt csöveket haladéktalanul tegye vissza a deszikkánst tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a cellák minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon µl-t az előhígított Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, a Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított betegmintákból a cellákba. Fedje be és 30 percig szobahőmérsékleten inkubálja a lemezeket, egy vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta adagolása után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes cella tartalmát. Adjon μl hígított HRP mosó puffert minden egyes cellához, majd ezt is szívassa le. Ismételje meg ezt az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen, finoman ütögetve tökéletesen távolítsa el az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait. Nagyon fontos, hogy a cellák minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. Leszíváskor, a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet tartsa be. 4. Minden egyes mérőhelyhez adjon 100 μl HRP IgG konjugátumot. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között, és a helyes laboratóriumi eljárásoknak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a mérés elvégzéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig úgy, mint a 2. lépésben. 5. Mosás: Ismételje meg a 3. lépést. 6. Adjon 100 µl TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen, 30 percig szobahőmérsékleten. 4

5 7. Adjon 100 µl HRP stop oldatot minden egyes cellába. A HRP stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt az időzítést és sorrendet tartsa, amit a TMB kromogén esetében alkalmazott. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát a cellák tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes cella abszorbancia (OD) értékét 450 nm-en a reakció leállítását követő egy órán belül. Ha bikromatikus mérést kíván végezni, referencia hullámhossznak használja a 620 nm-t. Minőség-ellenőrzés 1. Futtassa együtt a Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív, a Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív és az ELISA negatív kontrollt is kell minden egyes beteg-minta sorozattal annak ellenőrzésére, hogy az összes reagens és végrehajtás is megfelelően működik. 2. Ne feledje, hogy mivel a Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív, a Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll is előhígított, ezért egyikük sem kontrollálja a minta hígításával kapcsolatos lépéseket. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelő módon. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és -20 C alatt történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell legyen, mint az előhígított Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, ami nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1,0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0,2-nél. c. A Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy nagyobbnak kell lennie, mint d. Az ELISA negatív kontroll és a Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek alapvetõ hibájának jelzésére szolgál. A Gliadin IgG II ELISA erősen pozitív kontroll nem garantálja a precizitást a teszt diagnosztikai küszöbértékének közelében. e. A felhasználó az adott minőség-ellenőrzési eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A2 -ban találhat. Az eredmények kiszámítása Először határozza meg az egyes párhuzamos minták OD értékeinek átlagát Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja a Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. Majd az így kapott eredményt szorozza meg a Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontroll címkéjén feltüntetett egységek számával. Minta OD Minta értéke = x Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontroll (egységek) Gliadin IgG II ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD (egységek) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának hígítási sorozatát kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a minta antitest titerértékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. 5

6 Az eredmények értelmezése Az ELISA teszt a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, valamint képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alább mutatott értékek csak javaslatok. Minden egyes laboratóriumnak meg kell határoznia a saját referencia tartományait, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a saját eljárásaiknak megfelelően. A minta besorolása, az alábbi táblázat szerint lehet: negatív, gyengén pozitív, mérsékelten vagy erősen pozitív. Egységek Negatív <20 Gyengén pozitív Mérsékelten vagy Erősen pozitív >30 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában gliadin IgG antitestek vannak, és felveti bizonyos glutén szenzitív enteropathiák, mint a coeliakia és a dermatitis herpetiformis fennállásának lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs gliadin IgG antitestje, vagy annak koncentrációja nem éri el a teszt diagnosztikai küszöbértékét. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredményeket az INOVA QUANTA Lite TM Gliadin IgG II használatával kaptuk. Más gyártók tesztjével kapott anti-gliadin IgG értékek ettől eltérőek lehetnek, ezek fel nem cserélhetőek. A közölt IgG érték mennyisége nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. Egy kezeletlen beteg esetében tapasztalt negatív gliadin IgA eredmény nem zárja ki teljesen a gluténszenzitív enteropathiát, különösképpen magas gliadin IgG antitest koncentráció esetén. Ezt gyakran szelektív IgA deficiencia okozza, ami viszonylag gyakran tapasztalható lisztérzékenység esetén. 2. Kezelt betegekben akikről ismert, hogy IgA antitesttel rendelkeztek, a gliadin IgA antitest eredmény jobban jelzi a diéta megtartását, mint a gliadin IgG antitest koncentrációja Téves pozitív eredmény (nagy antitest koncentráció, jellegzetes hisztológiai eltérések nélkül) előfordulhat. Egyéb gastrointestinalis betegségek képesek a gliadin antitest szintet csökkenteni, ezek főleg a következők: Crohn-betegség, ételfehérje intolerancia (tehéntej) és fertőzés utáni malabsorptio. 4. A dermatitis herpetiformis és a glutén-szenzitív enteropathia asszociációja olyan erős, hogy valószínűnek tartják, hogy a két betegség etiológiája közös, ezért a gliadin antitest meghatározása az ilyen betegekben is hasznos a tünetmentes coeliakia felfedezése, és a gastrointestinális érintettség súlyosságának becslése céljából. 12,13 5. Ezen teszt eredményeit a klinikai adatok, és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 6. A teszt működési jellemzői a szérumtól eltérő mátrixokra nincsenek kidolgozva. Várható értékek A QUANTA Lite TM Gliadin IgG II gliadin IgG antitest kimutatási képességét, egy olyan ELISA teszttel történt összehasonlítás során nyerték, mely tesztben a szintetikus peptid helyett teljes, natív gliadint kötöttek a szilárdfázishoz. Referencia tartomány Ötszáz, random módon kiválasztott véradó mintáját tesztelték gliadin IgG antitestek szempontjából. Ezek közül háromszáz donor 14-től 78 évesig terjedő korcsoportban volt, és egyenlő arányban voltak köztük nők és férfiak. A 20-egységes cutoff felett 3 minta (0,6%) volt. A 3 pozitív minta közül a legmagasabb 38 egységnyi volt. Az 500 minta középértéke 4,5 egység volt, 2,6 egységes standard deviációval. A középérték 5-szörös standard devianciával volt a 20-egységes cutoff alatt. 6

7 Összehasonlító vizsgálatok Három, coeliakiával foglalkozó referencia laboratóriumból származó száztizenhárom mintát teszteltek QUANTA Lite TM Gliadin IgG II teszttel és egy standard gliadin IgG kitel. Ezek, valamint az 500 normál minta eredményei az alábbi táblázatban szerepelnek: Gliadin IgG + - Összes Gliadin IgG II - 142* Összes Pozitív százalékos egyezés: 29/171 (17,0%) Negatív százalékos egyezés: 434/442 (98,2%) Összesített egyezés: 463/613 (75,5%) *Ebből a 142 mintából 114 a standard gliadin IgG kitel téves pozitív eredményt adott, mivel ezek a minták a normál csoportból származtak. Klinikai érzékenység és specificitás A klinikailag coeliakia pozitív betegek, gluténmentes diétában részesülő coeliakiás betegek, olyan gluténmentes diétában részesülő coeliakiás betegek, akik továbbra is endomisyum pozitívak, illetve coeliakiás beteg elsőfokú rokonainak mintái QUANTA Lite TM Gliadin IgG II kit és standard gliadin ELISA kit felhasználásával voltak tesztelve. A klinikailag definiált minták, valamint a normál tartományba tartozó minták eredményeinek összegzése az alábbiakban látható. Pozitív minták száma (%) Betegcsoport (a betegek száma) Gliadin IgG (jelenlegi) Gliadin IgG II peptid Coeliakiás (32) 25 (78%) 21 (66%) Coeliakiás, gluténmentes diétán (30) 12 (40%) 5 (17%) Coeliakiás (5) 4 (80%) 3 (60%) gluténmentes diétán, EMA pozitív Elsőfokú rokonok (20)* 11 (55%) 0 Coeliakiás, IgA deficiens (5) 5 (100%) 5 (100%) Egészségesek (521) 114 (22%) 3 (0,6%) * Mind a 20 elsőfokú rokon endomisyum negatív volt. Kereszt-reaktivitás A más autoantitestekkel lehetséges kereszt-reaktivitás miatt várható problémák felmérése céljából, különböző nagy titerű autoantitest pozitív mintákat vizsgáltak a QUANTA Lite TM Gliadin IgG II kitel. Összességében 45 mintát teszteltek. A minták között található Aktin (5), PCNA (1), AMA (1), Fibrillerin (1), Kromatin (1), Histon (4), LKM (4), SS-B (4), Scl-70 (4), RNP (4), RF IgM (4), Centromer (4), β2 IgG (2), β2 IgM (1), β2 IgA (1) és GBM (4). Az 45 minta középértéke 5,0 egység volt. A legmagasabb értékű minta, az egyik Aktin minta volt, 51 egységgel. Ez a minta a referencia gliadin IgG kiten is pozitív volt. A középérték négy standard deviációval volt a 20-egységes diagnosztikai küszöbérték alatt. Pontosság és reprodukálhatóság A QUANTA Lite TM Gliadin IgG II intra-assay teljesítményét 9 minta, egyenként 5-szöri, ismételt tesztelésével értékelték ki. Az eredmények az alábbi, 1. táblázatban láthatók. 7

8 1. táblázat A QUANTA Lite TM Gliadin IgG II intra-assay teljesítménye középérték 22,4 28,3 52,5 55,5 35,7 59,7 3,7 4,0 3,8 SD 0,9 1,4 2,0 1,7 1,0 2,0 0,3 0,4 0,3 CV % 3,9 5,1 3,9 3,1 2,9 3,4 8,1 10,0 8,4 Az inter-assay változás vizsgálata során 3 napig duplikátumban teszteltek egy 5 mintából álló panelt, valamint a kit erősen pozitív kontrollját (HPC), naponta kétszer (reggel és délután egyszer-egyszer). Az eredmények az alábbi, 2. táblázatban láthatók. 2. táblázat A QUANTA Lite TM Gliadin IgG II inter-assay teljesítménye HPC A B C D E középérték 110,6 57,0 89,0 113,8 5,2 5,7 SD 4,1 1,9 3,0 3,4 0,3 0,6 CV % 3,7 3,3 3,4 3,0 5,2 9,8 Hivatkozások 1. Trier JS: Celiac Sprue. N Engl J Med 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. J Intern Med 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Arch Dis Child 65: , Osman AA, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 121: , Aleanzi M, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidaion gliadin peptides. Clin Chem 47: , Schwertz E, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clin Chem 50: , Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand J Gastroenterol 27: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 12. Stober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestinal tract. J. Allergy Clin. Immunol. July , Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterlogy and Hepatology 3: , A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service HUN January 2009 Revision 0 Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: