QUANTA Lite TM H. pylori IgA In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM H. pylori IgA In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás A QUANTA Lite TM H. pylori IgA készlet egy enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálat (ELISA) az H. pylori (Helicobacter pylori) baktériumra érzékeny IgA antitestek kvalitatív kimutatására szolgálhumán szérumban. Ennek a tesztnek az a rendeltetése, hogy elősegítse az H. pylori fertőzések diagnózisát olyan 18 év feletti felnőtt betegeknél, akik gasztrointesztinális betegségek klinikai jeleit és tüneteit mutatják. A QUANTA Lite TM H. pylori IgA-t a QUANTA Lite TM H. pylori IgGvel együttesen kell elvégezni és kiértékelni az H. pylori IgG antitesteinek detektálása céljából. A teszt összegzése és magyarázata Az H. pylori fertőzés és a peptikus gyomorfekély közötti okozati kapcsolatot jól megalapozottnak lehet tekinteni, miután 1983-ban ezt először felvetették. 1 Az H. pylori fertőzés a duodenális fekélyben szenvedő betegek több, mint 95%-ban, a gasztrikus fekélyben szenvedő betegek 80%- ban megtalálható, és a összefüggésbe hozták a gasztrikus karcinómával és lymphomával is. 2-5 Az H. pylori fertőzés eradikációja csökkenti a gyomorfekély visszatérését. 2-5 Az H. pylori fertőzés kezelése javallott a duodenális vagy gasztrikus fekélyben szenvedő betegek esetében, illetve a közelmúltban javallott funkcionális dyspepsia esetén is. 5,6 Az H. pylori fertőzés diagnózisa mind invazív és nem invazív módszerekkel történik. Az invazív vizsgálatok közé sorolható az endoszkópiás vizsgálat a gasztrikus antralis nyálkahártya közvetlen megfigyelésére, illetve biopsziák levételére ureáz próba, szövettani festés (Warthin-Starry), illetve tenyésztés céljából. 5,7 A tenyésztést tekintik az arany standardnak, ugyanakkor ez a legkevésbé érzékeny teszt (70-80%-os szenzitivitás). A szövettani és az ureáz vizsgálatok szenzitivitása és specificitása 90% felett van. 5 Az invazív módszerek legnagyobb hátrányai a betegnek okozott kockázat és kellemetlenség, magas költség, ill. hamis negatív eredmény a H. pylori bacterium foltszerű eloszlása miatt a gyomorban. A nem invazív vizsgálatok közé tartoznak a 14 C or 13 C- címkézésű urea és szerológiai kilégzési tesztek. A kilégzési tesztek szenzitívek és specifikusak, de magas költséggel járnak. A szerológia alacsony költséggel járó, szenzitív és specifikus alternatívát biztosít az invazív és/vagy költséges eljárásokkal szemben, mint pl. az endoszkópia és a 14 C urea leheletvizsgálat. 2,3,5,8,9 A legtöbb esetben az IgG családjába tartozó antitestek kimutatása az H. pylori fertőzés pontos meghatározását tesz lehetővé, több, mint 90% szenzitivitással és specificitással. Ugyanakkor a betegek körülbelül 2-7%-a, akiket mind a H. pylori IgG és IgA antitestekre vizsgáltak, H. pylori IgG negatívnak bizonyult, de H. pylori IgA pozitívnak. 12,15,16,18 Ezért, ha csak IgG antitesteket mérik, valós H. pylori fertőzés eseteket nézhetnek el, amelyek azt eredményezhetik, hogy a fertőzés ben szenvedő betegek nem kapnak ellátást, vagy azt, hogy sokkal költségesebb és invazívabb vizsgálati eljárásoknak vetik alá őket. Azon kívül, hogy olyan betegeket fedezhetünk fel, akiket az IgG H. pylori assay-k elmulasztottak, más vizsgálatok is alátámasztják az IgA H. pylori antitestek mérésének klinikai hasznosságát: 1) az olyan leletek, amelyek magas szintű IgA H. pylori antitesteket mutatnak ki alacsony szérum pepszinogén I szinttel kombinálva gyomorrákveszélyt jelentenek 17, 2) a kezelés után az IgA antitest értékek gyorsabban csökkenhetnek, mint az IgG értékek 15, 3) az H. pylori ellenes IgA antitestek segíthetik az olyan szimptómás betegek diagnózisát, akiknek kétértelmű vagy alacsony H. pylori IgG értékeik vannak és 4) Az IgA/IgG H. pylori antitest értékek arányakapcsolatban állhat azzal, hogy mennyire lehet összefüggésbe hozni az H. pylori-t a krónikus gasztritisszel. 19 A módszer elve Tisztított H. pylori antigént kötöttek polisztirén mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához olyan körülmények között, ami képes az antigén natív állapotát megőrizni. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő H. pylori antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgA konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgA számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgA felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A tesztet spektrofotometriás módszerrel lehet értékelni úgy, a betegek mintáival kapott szín intenzitását lemérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított H. pylori antigénnel fedve (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, 1

2 amelyben nincsenek humán H. pylori IgA antigén ellenes antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. H. pylori IgA ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum H. pylori IgA ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. H. pylori IgA ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum H. pylori IgA ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínre festve, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP mosó koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP IgA Konjugátum, (kecske), anti-humán IgA, 1 üveg színtelen, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, az H. pylori IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az H. pylori IgA ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 2

3 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az CLSI (NCCLS) Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 H. pylori IgA ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL H. pylori IgA ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll) előhígítva 1 1.2mL H. pylori IgA ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll) előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Wash (mosó) Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HS HRP IgA Konjugátum, (kecske), anti-humán IgA 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, , és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény a HRP mosó koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosó koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosó koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer egy hétig stabil 2 8 C között tartva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA az H. pylori IgA ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, az H. pylori IgA ELISA erősen pozitív kontrollt, és az ELISA negatív kontrollt. 4. Az H. pylori IgA antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységekben történő 3

4 meghatározása céljából használjon mind a három kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t az előhígított H. pylori IgA ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, az H. pylori IgA ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított betegmintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon µL hígított HRP mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP IgA Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. Az H. pylori IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az H. pylori IgA ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel az H. pylori IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az H. pylori IgA ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított H. pylori IgA ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított H. pylori IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított H. pylori IgA ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. Az H. pylori IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint d. Az ELISA negatív kontroll és az H. pylori IgA ELISA erősen pozitív kontroll a 4

5 reagensek minőségének lényeges eltérését kontrollálja. Az H. pylori IgA ELISA erősen pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást a teszt küszöbértékének közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az CLSI (NCCLS) Document C24-A3 11 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután minden egyes minta reaktivitása meghatározható olyan módon, hogy a minta OD átlagát elosztjuk az H. pylori IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. A kapott eredményt szorozzuk az H. pylori IgA ELISA mérsékelten pozitív kontrollt tartalmazó üveg címkéjén feltüntetett egység mérőszámával. Minta OD Minta eredménye = x H. pylori IgA ELISA mérs. Pozitív Kontroll (egység) H. pylori IgA ELISA mérs. Pozitív Kontroll OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi adatok csak tájékoztatásra szolgálnak. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A mintákat negatívként, (negatív az H. pylori IgA antitestjére), kétértelműként, vagy pozitívként (az H. pylori IgA antitestjét detektálták) értékelik az alábbi táblázat szerint. Egység Negatív Kétes Pozitív > 25 A kétes mintákat ismételten le kell mérni, mielőtt az eredményeket véleményezzük. 1. The QUANTA Lite TM H. pylori IgA assay-t a QUANTA Lite TM H. pylori IgG assay-el együttesen kell elvégezni és kiértékelni az H. pylori IgG antitesteinek detektálása céljából. Egyes minták lehetnek H. pylori IgA antitest negatívak és H. pylori IgG antitest pozitívak, míg mások lehetnek H. pylori IgA antitest pozitívak és H. pylori IgG antitest negatívak. Még nincsenek megfelelő teljesítmény/értékelés adatok megállapítva az H. pylori IgA antitest pozitív és H. pylori IgG antitest negatív mintákra és további utánkövetésre lehet szükség. 2. A pozitív eredmény mindössze azt jelzi, hogy az immunrendszer ki volt téve korábban H. pylori-nak. Ezzel nem lehet megkülönböztetni az aktív, ill. inaktív H. pylori fertőzést. Az aktív fertőzést a biopsziás anyag kitenyésztésével, 14 C urea leheletvizsgálattal, vagy más ureáz-kimutatási módszerrel lehet felmérni. 3. A kétes H. pylori IgA eredményt adó minta alapján a beteg ellenanyag státusza nem ítélhető meg. Ha az eredmény ismételt vizsgálattal is a kétes tartományba esik, az eredményt kétesként interpretáljuk, és/vagy a vizsgálatot frissen vett mintából megismételjük. 4. A negatív eredmény azt jelzi, hogy nincs jelen H. pylori IgA antitest, vagy hogy az az assay kimutatási határa alatt van. Az elsődleges fertőzés idején túlságosan korán levett minták esetén az IgA antitest-szintje még lehet, hogy nem érte el a detektálható szintet. Ha elsődleges fertőzés gyanúja áll fenn, új mintavételre van szükség 4-6 héten belül és az eredeti mintával egy időben kell vizsgálni. 5. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA kit használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott H. pylori IgA eredmények ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgA érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. 5

6 A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nemspecifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Ennek a tesztnek az a rendeltetése, hogy elősegítse az H. pylori fertőzések diagnózisát. olyan egyének vizsgálatában, akik olyan tüneteket mutatnak, amelyek gasztrointesztinalis betegségekre utalnak, nem pedig tünetmentes betegek vizsgálatára. 3. Ezt a tesztet használhatja arra, hogy kiegészítse, de ne helyettesítse az H. pylori IgG antitest vizsgálatot. Az H. pylori IgA mintaeredményeket ne mutassák ki magukban, a hozzávaló H. pylori IgG eredmények nélkül. 4. Egy negatív H. pylori IgA eredmény nem zárja ki az H. pylori jelenlétét, mivel sok egyén múltbéli vagy jelen H. pylori fertőzéssel is negatív lehet H. pylori IgA-ra. 5. A negatív antitest eredmény nem zárja ki az H. pylori IgA jelenlétének lehetőségét, mivel lehetséges, hogy az antitest koncentrációja az assay kimutatási küszöbértéke alatt van. 6. Negatív eredményt kaphatunk, ha a mintákat túlságosan korán veszik le a fertőzés során, mielőtt a kimutatható mennyiségű antitest megjelenik. Ha H. pylori fertőzés gyanúja áll fenn, új mintavételre van szükség 4-6 héten belül és azt az eredeti mintával párhuzamosan kell vizsgálni. 7. A pozitív eredménnyel nem lehet megkülönböztetni az aktív fertőzést, ill. az H. pylori kolonizálást. 8. A pozitív eredmény mindössze az H. pylori-antitestek jelenlétét jelzi, és nem feltétlenül jelent gasztrointesztinalis betegséget. 9. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva. 10. Az assay nem alapították meg pácienseknek a kor 18 éve alatt. 11. Irodalmi referenciák javasold azt antitesteket Pseudomonas a fajok kereszteződhetnek reagál H. pylori. Az előadás Az assay szérumban tartózkodni anti-pseudomonas antitest nem értékelték ki. 12. Az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. Várható értékek Becslések szerint a világpopuláció 50%-a szenved H. pylori fertőzésben. Fejlődő országokban a populáció legalább 50%-a 10 éves koráig elkapja a fertőzést, míg a fejlett országokban igen ritka a gyermekkorban előforduló fertőzés. Az összprevalencia az életkor növekedésével egyenes arányban nő, kb %-kal évente (kb. 60% a 60 év életkorú csoportban). 3,7,13,14 Fertőzött egyénekről azt is kimutatták, hogy IgA antitesteket termelnek az H. Pylori ellen. Alacsony számú egyénekről (2-7%) azt is kimutatták, hogy pozitívak az H. Pylori IgA antitestekre és negatívak az H. pylori IgG antitestekre. 12,15,16,18 Felmérték a QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA képességét a H. pylori IgA antitestek kimutatására egy -val való összehasonlításban, klinikailag meghatározott betegmintákon. A kereskedelemben forgalmazott H. pylori IgA ELISA eredményeit a gyártó használati utasításai szerint határozták meg. Referencia tartomány 120 begyűjtött mintát tünetmentes, egészséges egyénektől (kor: között, átlag életkor 35) vizsgáltak a QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA-val. A 120 mintából 9%-ot (11/120) találtak H. pylori IgA pozitívnak. Amikor kizárták azokat a mintákat, amelyek H. pylori IgG pozitívak vagy kétértelműek voltak, 2.8% (3/105) volt pozitív H. pylori IgA antitestekre (és negatív a H. pylori IgG antitestekre). Ez az 97.1%-os kiszámított specificitásra mutat. (102/105) [ 95%CI= ]. Specifikus Működési Jellemzők A QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA assay teljesítményét összehasonlították egy alapvető kereskedelmi H. pylori IgA ELISA-val. 145 mintát nyújtottak be H. pylori antitest vizsgálatra, 8 EQAS (external quality assessment scheme), plusz 100 mintát tünetmentes, egészséges egyénektől, s ezeket mindkét vizsgálattal tesztelték. A 253 mintából 130 volt pozitív és 91 negatív mindkét mószerrel. 1. Táblázat: Ismert H. pylori IgA ELISA + +/- - QUANTA Lite TM %Egyezés pozitív: 91.5%(130/142) H. pylori IgA ELISA +/ %Egyezés Negatív: 90.1%(91/101) Vizsgálati minták Összesen 111 archivált szérummintát gyűjtöttek be UBT,CLO, szövettan és/vagy kitenyésztési módszerek kombinációjával dokumentált H. pylori fertőzésben szenvedő betegektől, melyeket a QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA készlettel vizsgáltak. 6

7 2. Táblázat: Referencia Módszer + QUANTA Lite H. pylori IgA /- 8-3 Szenzitivitás (nem zárja ki a kétért.) = 90.1% (100/111), [95% Cl=83.0%-94.9%] Kereszt-reaktivitás vizsgálata Végeztek egy adszorpciós vizsgálatot a bakteriális antigéneknek az INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA-val való keresztreakció készségének felmérésére. Különféle H. pylori antitestszintű szérumokat rövid ideig adszorbeáltunk H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus, vagy E. coli antitestekkel, és kezelt vagy kezletlen szérummintákat vizsgáltak az H. pylori IgA assay-el. Minden H. pylori szeropozitív minta szeropozitív maradt akkor is, amikor az H. pylori től eltérő antigénekkel abszorbált. Az átlagos százalékos inhibíció 82% volt az H. pylori antigén használatakor és 10% amikor más organizmusokból származó antigéneket használtak. Keresztreaktivitás az antinukleáris jelenéte miatt (3 szérumban), rheumatoid faktor (3 szérumban), eta-2 mikroglobulin (3 szérumban), vagy B. burgdorferi (11 szérumban) antitesteket is tesztelték és kimutatták, hogy nincsenek hatással az INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA specificitására. Interferencia Annak megállapítására, hogy magas bilirubin-, koleszterin-, vagy trigliceridszintek jelenléte a szérummintákban zavarja-e a QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA tesztet, két vizsgálatot végeztek el. Az elsőben 6 szérummintát (4 H. pylori pozitív és 2 negatív) vizsgáltak bilirubin (40x normál szint), vagy haemoglobin (66x normál szint) hozzáadásával és anélkül. A Egy második tanulmány létezett, mely magas koleszterol (3), triglicerid (1) vagy bilirubin (2) tartalmú szérumot vizsgál pozitív H.pylorira. Bár a magas bilirubin,hemoglobin vagy koleszterol szint nem befolyásolja a vizsgálat eredményét, a magas triglicerid szint (egy minta) mutatott némi befolyást. Reprodukálhatóság/Precizitás A vizsgálaton belüli teljesítmény 6 minta 12 alkalommal történő vizsgálatával került kiértékelésre. A minták között volt negatív, kétértelmű, határeset pozitív, alacsony pozitív, mérsékelten pozitív és magas pozitív minta. Az eredmények az alábbiak szerint foglalhatók össze Tábláza Táblázat: QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA intra-assay teljesítménye Szérum 1 Szérum 2 Szérum 3 Szérum 4 Szérum 5 Szérum 6 Atlag S.D C.V.% A vizsgálaton belüli teljesítmény 13 minta 3 nap alatt összesen 6 alkalommal történő vizsgálatával került kiértékelésre. A minták között volt negatív, alacsony pozitív, mérsékelten pozitív és magas pozitív minta. Naponta kétszer vizsgáltak, egyszer reggel, egyszer délután. Az eredmények az alábbiak szerint foglalhatók össze Tábláza Tábláza: QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA inter-assay teljesítménye Szérum 1 Szérum 2 Szérum 3 Szérum 4 Szérum 5 Szérum 6 Szérum 7 Atlag S.D C.V.% Szérum 8 Szérum 9 Szérum 10 Szérum 11 Szérum 12 Szérum 13 Atlag S.D C.V.%

8 Hivatkozások 1. Marshall BJ: Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii , Walsh JH and Peterson WL: The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15): , Blaser MJ: Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: , The Eurogast Study Group. An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857): NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease. JAMA , Malfertheiner P, et.al.: Current European concept in the management of Helicobacter pylori infectionthe Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9:1-2, Hirschl AM, et. al.: Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of anti-helicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168: Bourke B, Jones N, and Sherman P: Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15:1-13, Patel P, et. al.: Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet. 346: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) ). 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline, C24-A3, Vol 26 (25), Kosunen T, et. al.: Diagnostic value of decreasing IgG, IgA and IgM antibody titers after eradication of Helicobacter pylori. Lancet 339: , Megraud F, et. Al.: Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27: , Veldhuyzen SJO, et. al.: Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169:4347, Veenendaal RA: Long term serological surveillance after treatment of Helicobacter pylori infection. Gut 32: , Jaskowski TD, et. al.: Immunoglobulin A antibodies to Helicobacter pylori. J. Clin. Microbiol. 35(11): , Aromaa A, et. al.: Circulating Anti-Helicobacter pylori Immunoglobulin A antibodies and low serum pepsinogen 1 level are associated with increased risk of gastric cancer. Am. J. Epidem. 144(2): , Granberg C, et. al.: Diagnosis of Helicobacter pylori Infection by Using Pyloriset EIA-G and EIA-A for Detection of Serum Immunoglobulin G (IgG) and IgA Antibodies. J. Clin. Microbiol. 31(6): , Futagami S: Systemic and local immune responses against Helicobacter pylori urease in patient with chronic gastritis: distinct IgA and IgG productive sites. Gut 43: , A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service HUN November 2007 Revision 0 8