QUANTA Lite RNP In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

Átírás

1 QUANTA Lite RNP In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite RNP egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) az RNP antitestek szemikvantitatív kimutatására humán szérumban. Az RNP antitesteknek a jelenléte felhasználható a klinikai adatokkal és más laboratóriumi vizsgálatok eredményével együtt kiegészítő adatként a szisztémás lupus erythematosus (SLE) és a rokon kötőszöveti betegségek diagnózisának felállítása során. A teszt összegzése és magyarázata Antinuclearis antitestek (ANA) a kötőszöveti betegségek széles körében megtalálhatók, és mint ilyenek, szenzitív szűrőmódszerként szolgának. 1 Míg az ANA teszt kiváló szűrő módszer SLE esetében (a negatív eredmény gyakorlatilag kizárja az aktív SLE diagnózisát) 2, specifikusnak semmiféle értelemben nem nevezhető. Az RNP antigén ellen irányuló antitestek megtalálhatók az SLE betegek közel 45%-ában, és hasonlóképpen más kötőszöveti betegségekben is. 1,3 Az RNP autoantitestek jelenléte általában relatíve benignus kórlefolyással jár együtt, a vese és központi idegrendszeri (CNS) érintettség ritkább előfordulásával. 4 Az RNP antigén tartalmaz olyan epitopokat, vagy antitest kötőhelyeket, amelyek egyedi módon jellemzőek az RNP-re, de vannak olyan epitopjai is, amelyek immunológiailag azonosak a szabad Sm antigénnel. 1 Mivel a szilárd fázishoz kötött RNP antigén ebben a tesztben Sm antigén epitopokat is tartalmaz, a beteg Sm antitest válaszát is mérlegelni kell, amikor az RNP eredményét véleményezzük. Az RNP ellenes antitestek kimutatására a vizsgáló módszerek széles skáláját alkalmazták, többek között az Ouchterlony kettős immundiffúziós eljárást és a passzív agglutinációt. Kifejlesztettek klinikailag jól használható ELISA módszert is az anti-rnp antitestek detektálására. Az ezekben a tesztekben alkalmazott ELISA technika objektív, szemi-kvantitatív, és kényelmesen használható nagy számú minta vizsgálatára. A módszer elve Tisztított RNP/Sm antigén komplexet kötöttek polisztirén mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához olyan körülmények között, ami képes az antigén natív állapotát megőrizni. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő RNP vagy Sm antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénekhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A tesztet spektrofotometriás módszerrel lehet értékelni úgy, a betegek mintáival kapott szín intenzitását lemérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Az RNP antitest eredmények megadásakor mindenkor szükséges figyelembe venni az Sm antitestek részvételét a reakcióban, mivel ezek befolyásolják az assay rendszer teljes reaktivitását. Az így kapott eredmények a minta anti-rnp/sm komplex reaktivitását jellemzik, és nem feltétlenül csak az anti-rnp reaktivitást. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, affinitási módszerrel tisztított RNP/Sm antigén komplexszel fedve (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek humán RNP antigén ellenes antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. RNP ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum RNP ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. RNP ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum RNP ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínre festve, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP mosó koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 1

2 7. HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kék színűre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, az RNP ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az RNP ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék-kezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 2

3 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az CLSI (NCCLS) Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése, A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 RNP ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL RNP ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll) előhígítva 1 1.2mL RNP ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll) előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Wash (mosó) Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HS HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, , és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény a HRP mosó koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer, Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosó koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosó koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer egy hétig stabil 2 8 C között tartva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA az RNP ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, az RNP ELISA erősen pozitív kontrollt, és az ELISA negatív kontrollt. 3

4 4. Az RNP antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységekben történő meghatározása céljából használjon mind a három kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t a z előhígított RNP ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, az RNP ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon µL hígított HRP mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100µL HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. Az RNP ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az RNP ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel az RNP ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az RNP ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított RNP ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított RNP ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított RNP ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. 4

5 c. Az RNP ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint d. Az ELISA negatív kontroll és az RNP ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek minőségének lényeges eltérését kontrollálja. Az RNP ELISA erősen pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást a teszt küszöbértékének közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az CLSI (NCCLS) Document C24-A2 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután minden egyes minta reaktivitása meghatározható olyan módon, hogy a minta OD átlagát elosztjuk az RNP ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. A kapott eredményt szorozzuk az RNP ELISA mérsékelten pozitív kontrollt tartalmazó üveg címkéjén feltüntetett egység mérőszámával. Minta OD Minta eredménye = x RNP ELISA mérs. Pozitív Kontroll (egység) RNP ELISA mérs. Pozitív Kontroll OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi adatok csak tájékoztatásra szolgálnak. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A minta besorolása lehet negatív, gyengén pozitív, mérsékelten pozitív vagy erősen pozitív az alábbi táblázat szerint: Egység Negatív < 20 Gyengén pozitív Mérsékelten pozitív Erősen pozitív >80 Ennek a tesztnek az eredményeit, amennyiben más adatok nem állnak rendelkezésre, úgy kell interpretálni, hogy a teszt eredménye pozitív (vagy negatív) Sm/RNP komplex antigénnel szemben, nem pedig csak az RNP-re vonatkoztatva. (lásd még az Sm és RNP értékek összehasonlítását alább). Az Sm és RNP értékek összehasonlítása A QUANTA Lite RNP ELISA tesztben kapott pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában az RNP/Sm komplexszel szemben reaktív ellenanyagok vannak, de nem képes különbséget tenni az anti-sm és az anti- RNP aktivitás között. Annak érdekében, hogy ez az elkülönítés megtörténhessen, szükség van a minta reaktivitásának meghatározására egy másik rendszerben, amelyik csak az Sm ellenanyagokat méri, és ennek eredményét a jelen teszt értékelésekor számításba kell venni. Miután megmértük az Sm antitest aktivitást, az RNP antitest aktivitása is kiszámítható. Az INOVA forgalmaz egy QUANTA Lite Sm ELISA tesztet, amellyel az Sm antitest aktivitás meghatározható. 5

6 Ha egy minta negatív az Sm ELISA módszerrel, de pozitív az RNP ELISA tesztben, akkor a reaktivitás döntően, vagy kizárólag az RNP antitesteknek tulajdonítható, és a reaktivitást meg lehet adni közvetlenül RNP egységekben. Azonban ha a reaktivitás az Sm ELISA tesztben megegyezik az RNP reaktivitással, akkor a mintában elsősorban anti-sm van. Egy átmeneti Sm aktivitás, ami a küszöbértéknél (cutoff) nagyobb, de kisebb, mint az RNP aktivitás 80%-a, azt jelzi, hogy a mintában Sm és RNP antitestek keveréke található, és úgy kell értékelni, hogy mindkét antitestre pozitív. Bármelyik esetben az RNP aktivitás becsülhető úgy, hogy a küszöb feletti (azaz a 20 egység feletti) Sm aktivitást kivonjuk a teljes RNP ELISA eredményből. Például, egy mintában 35 egységet mértünk Sm ELISA módszerrel, és 115 egységet az RNP ELISA módszerrel, tehát a minta Sm aktivitása 35 egység és RNP aktivitása 100 egység (azaz ). Előfordulhat, hogy nehéz kiszámítani a minta valódi RNP aktivitását, mert mind az RNP, mind az Sm aktivitás nagyon nagy. Ha egy minta erősen pozitív (azaz több, mint 100 egység) Sm-r e é s R N P -re egyaránt, az Sm aktivitás kivonása az RNP értékéből tévesen negatív eredményt adhat RNP-re. Javasoljuk, hogy minden mintát, amelyik erősen pozitív (>100 egység) RNP-r e é s S m -re is, teszteljék újra a minta további 1/10 és 1/20 arányú hígítása után (a mintahígítóval a már egyszer hígított mintából) annak érdekében, hogy kiderüljön, vajon az RNP aktivitása nagyobb-e mint az Sm aktivitása. A számításokhoz mindkét antitest eredményt a beteg mintájának azonos hígításából kell figyelembe venni. Alternatív megoldásként a minta vizsgálatát más módszerrel, például az Ouchterlony kettős diffúzióval is el lehet végezni. A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nem-specifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Nem minden SLE betegségben szenvedő páciens mintája pozitív RNP antitestekre. Ouchterlony vizsgálatok kimutatták, hogy csak az SLE páciensek 19%-ának (20/105) van RNP antitestje. 3. Az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 4. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva. Várható értékek A QUANTA Lite RNP ELISA teszt alkalmasságát az RNP antitestek detektálására egy kereskedelmi forgalomban lévő, INOVA Diagnostics, Inc. kettős immundiffúziós módszerrel történt összehasonlítás segítségével határozták meg. Az Ouchterlony teszt eredményét pozitívnak tekintették, ha a precipitin csík azonosságot jelzett, és negatívnak, ha nem volt észlelhető precipitáció, vagy a vizsgálat nem azonos antigént jelzett. Az ELISA eljárásban az Sm antitestek hatását az RNP assay reaktivitására korrigálták a QUANTA Lite T RNP ELISA tesztben mért reaktivitásnak és ugyanazon minta QUANTA Lite Sm ELISA tesztben mért reaktivitásának összehasonlításával. Referencia tartomány Százegy random szérum mintát választottak ki, és tesztelték az RNP ELISA assay használatával. A minta populáció átlagos eredménye 4.7 egység volt, a standard deviáció 1.1 egység. Az eredmények 1.4 és 10.1 egység között voltak. Ez a kísérlet azt mutatja, hogy egy átlagos normál minta eredménye több, mint 13 standard deviációnak megfelelő egységgel van a küszöbérték alatt. 6

7 Relatív szenzitivitás és specificitás A teszt relatív szenzitivitásának és specificitásának meghatározásához 223 ANA pozitív beteg mintáját, amelyek a nuclearis antigének elleni antitestek széles variációit tartalmazták, tesztelték együttesen az Ouchterlony és az ELISA módszerrel. Minden esetben, amikor az Ouchterlony és az ELISA eredmények nem egyeztek, a mintát tovább vizsgálták egy elismert ELISA módszerrel a specifikus RNP ellenes ellenanyagok meghatározására, amelyek koncentrációja esetleg nem érte el az Ouchterlony technika kimutatási határát. A vizsgált 223 mintából 71 volt pozitív és 146 volt negatív mindkét módszerrel. Egy minta pozitív lett Ouchterlony eljárással, de negatív az ELISA tesztben. Ez a minta egy másik kereskedelmi RNP ELISA teszttel is negatív volt. A maradék 5 minta pozitív volt az ELISA vizsgálattal, de negatív az Ouchterlony assayvel. Mindegyik mintát ezek közül ismét tesztelték egy másik kereskedelmi ELISA kittel, és az ötből egy pozitív eredményt adott RNP-re, míg a többi négy továbbra is negatív volt. Az RNP ELISA assay eredményeit az alábbi táblázat foglalja össze, a mindkét ELISA teszttel pozitív mintát valódi pozitívnak elfogadva. INOVA Relatív Szenzitivitás 98.6% OT Relatív Specificitás 97.3% Relatív Hatékonyság 97.8% Precizitás és reprodukálhatóság Az assay precizitását és reprodukálhatóságát egy erősen pozitív és egy gyengén pozitív minta hat paralell vzsgálatával határozták meg, hat különálló sorozatban megismételve. Az átlagos reaktivitás az erősen pozitív mintában egység, a gyengén pozitív minta átlaga 33.8 volt. Az alábbiakban összefoglalva láthatók a sorozatok standard deviációi és variációs együtthatói az egyes minták esetében. Erősen pozitív Gyengén pozitív SD CV SD CV Általános % % Sorozaton belül % % Sorozatok között % % 7

8 Hivatkozások 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ana): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Reichlin M and Maddison PJ: Soluble tissue autoantibodies which precipitate with sera of patients with connective tissue diseases. In: Immunopathology of the skin, 2nd ed(eh Beutner,TP Chorzelski, SF Bean, eds)john Wiley and Sons, NY pp , Reichlin M and Mattioli M.: Correlation of a precipitin reaction to an RNA protein antigen and a low prevalence of nephritis in patients with systemic lupus erythematosus. N Eng J Med 286: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: HUN November 2011 Mod. 1 QUANTA Lite és INOVA Diagnostics bejegyzett védjegyek. Copyright 2011 Minden jog fenntartva 8