ßhCG ELISA készlet. A mérés elve. Kód: EK-76

Átírás

1 ßhCG ELISA készlet Kód: EK-76 A hcg ELISA készlet humán szérum koriongonadotróp hormon (hcg) tartalmának direkt meghatározására szolgál. A készlet 96 meghatározásra elegendo reagenst tartalmaz, amellyel egyszeri standardizálás esetén két párhuzamossal mérve 42 minta hcg koncentrációja határozható meg, a miu/ml mérési tartományban. Tartalom oldal Bevezetés...1 A mérés elve...1 A készlet tartalma...2 A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök...2 A mérendo minták gyujtése és tárolása...3 A reagensek elokészítése...3 A meghatározás menete...4 Az eredmények számítása...5 Minoségi jellemzok...6 Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások...6 Egyéb tudnivalók...7 Biztonsági óvórendszabályok...7 Bevezetés A hcg (human koriongonadotróp hormon) kb es mólsúlyú glikoprotein, amelyet a placenta sejtjei választanak ki. Hasonlóan a többi glikoprotein hormonhoz (hfsh, hlh, htsh) a hcg is két különbözo alegységbol tevodik össze, az alfa és a béta láncból, amelyeket nem kovalens kötések kapcsolnak össze. Az alfa lánc aminosav sorrendje (92 aminosavból áll) gyakorlatilag azonos mind a négy hormon esetében, miközben a béta láncok (145 aminosav) eltéro felépítésuek. Az egyes molekulák biológiai sajátságaiért a béta láncok a felelosek. Így a hcg tartalom mérése csak akkor specifikus, ha a meghatározás a ß-alegységen történik.. Az így kapott total ßhCG tartalom tehát magába foglalja az intakt hcg molekulákat, valamint az esetleg jelenlévo szabad ß-alegységet is. A hcg hormon megjelenik a noi szérumban az embrió beágyazódása után körülbelül 5 nappal, és koncentrációja folyamatosan növekszik a terhesség harmadik hónapjáig. A maximális koncentráció akár 100 IU/ml-es értéket is elérhet. A hcg szint ezután lecsökken 25 IU/ml-re, és ezen érték körül marad az utolsó trimeszterig. A hcg koncentráció emelkedik trofoblasztikus és nem trofoblasztikus neopláziában, illetve korionkarcinómában. A hcg koncentráció növekedése férfi és nem terhes noi szérumban ektópiás hormontermelés eredménye. Ektópiás hcg termelést hepatóma, adenokarcinóma, gyomor, méh, tüdo, here és áttételes mell daganat okozhat. HONLAP: Technikai Kereskedelmi immuno@izotop.hu commerce@izotop.hu A mérés elve A készlet muködése a szilárd fázisú immunometrikus assay elvén alapul. Ehhez két olyan monoklonális antitest szükséges, amelyek a molekula két különbözo epitopját ismerik fel. A két antitest egyike IZOTÓP INTÉZET KFT, BUDAPEST

2 jelzett (jelzo antitest), a másik jelöletlen (ún. befogó, vagy "capture" antitest). Az immunokémiai folyamatban a standardokban, illetve a mintákban lévo hormon mindkét antitesttel reagálva immunkomplexet ("szendvics") képez, amely szilárd fázison kötodik, és mennyisége arányos a hormon koncentrációjával. Jelen készletben a szilárd fázis szerepét szabványos, 8x12-es mikrotiter plate látja el, amely 12 db. egysoros egységbol áll. Az immunreakció 37 o C-on 2 óra alatt játszódik le, és a jelzo funkciót torma-peroxidáz (HRPO) enzim látja el, amely peroxid és tetrametilbenzidin (TMB), szubsztrát kromogén, eleggyel reagálva 450 nmen detektálható jelet hoz létre. A szilárd fázison a jelet (optikai denzitást) szabványos ELISAfotométeren (ELISA-reader) mérjük, a mért jel intenzitása egyenesen arányos a rendszerben lévo hormon koncentrációjával. Az ismert koncentrációjú standardok kötési értékei alapján szerkesztett kalibrációs görbérol az ismeretlen minták koncentrációit kötési értékeik alapján visszaolvassuk. A készlet tartalma 1 üveg TRACER, felhasználásra kész. 12 ml pufferes oldat 0,01 % mertiolát és 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. 5 üveg STANDARD (0-4), felhasználásra kész. 5*1 ml szérum-oldat, 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval, koncentrációjuk O (S 0), 10 (S 1 ), 25 (S 2 ), 50 (S 3 ), 100 (S 4 ) miu/ml. Kalibrálva a 3 rd IRP Int. Std. WHO preparátumra. 1 üveg ELLENORZO SZÉRUM, felhasználásra kész. 1 ml szérum 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. Várható értékét a mellékelt minoségi bizonylat tartalmazza. 1 db MIKROTITER PLATE, 12 db. stripet tartalmaz szabványos keretben. 1 üveg TMB SZUBSZTRÁT, 25 ml felhasználásra kész oldat, sötét muanyag flakonban. Fénytol védve tartandó. 1 üveg MOSÓPUFFER KONCENTRÁTUM 20 ml puffer, 0,01 % mertiolát tartósítóval. Rekonstituálandó 600 ml desztillált vízzel. 1 üveg HÍGÍTÓ SZÉRUM. 15 ml puffer, 2 mg/ml CAA tartósítóval. További üveg hígító szérumok rendelhetok. 1 üveg STOP REAGENS 6 ml 1 M kénsav 1 db. Plate térkép 1 db Minoségellenorzési bizonylat 1 db Használati utasítás A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök muanyag kémcsövek és kémcsotartó adagoló pipetták, 100, 200 és 1000 µl-es eldobható muanyag hegyekkel örvénykevero (vortex) desztillált víz ELISA reagens-tálkák - 2 -

3 ELISA - termosztát ELISA - fotométer (450 nm hullámhosszra) Ajánlott: 8-csatornás adagoló pipetta orbitális kevero ELISA mosó-automata terhes szérumot, valamint a már azonosítottan magas hcg koncentrációjú mintákat hígítsuk a mellékelt hígító szérummal. A javasolt hígítási eljárás: 1. lépés: 10 µl minta µl hígító szérum (1:20 hígítás) 2. lépés: 10 µl 1:20 hígított minta (1. lépés alapján) µl hígító szérum (1: 1000 végso hígítási arány). A mérendo minták gyujtése és tárolása A vizsgálandó szérummintákat a más, ugyancsak szérumot igénylo laboratóriumi vizsgálatoknál követett módon készítjük el. Amennyiben a hcg-meghatározás a mintavételt követo 1-2 napon belül megtörténik, a mintákat C-on, késobbi felhasználás esetén -18 C-on mélyhutve tartjuk. A fagyasztott mintákat hagyjuk felolvadni, és felhasználás elott alaposan homogenizáljuk. Kerüljük az ismételt visszafagyasztást. Lipémiás, hemolizált, vagy más szempontból rendellenes szérumot ne használjunk mérésre. A reagensek elokészítése A mosópuffer koncentrátum kivételével minden reagens felhasználásra kész. A mosópuffer koncentrátumot öntsük hozzá 600 ml desztillált vízhez, így 620 ml hígított mosópuffert kapunk. A kihígított mosóoldatot késobbi felhasználásra C-on tároljuk. A mérés megkezdése elott engedjük szobahomérsékletre melegedni a reagens oldatokat, beleértve a mérendo mintákat is. Ha készletet terhességi tesztként, vagy tumor marker meghatározásra használjuk, a vizsgálandó szérumot hígítatlanul mérjük meg. Terhes szérumok esetében a minták koncentrációja meghaladja a a standardsor mérési tartományát (> 100 miu/ml), ezért minden - 3 -

4 A meghatározás menete (ld. folyamatábra, 1. táblázat) 1) Készítsük elo a mérendo mintákat, vegyük elo a készletbol a standardokat, az ellenorzo szérumot, a tracert, valamint az ELISA-platet, és hagyjunk mindent szobahomérsékletre melegedni. 2) Jelöljük meg külön plate térképen az alábbi minták pozícióját, 2-2 párhuzamosban: - standardok (S 0-4 )(S 0 =NSB) - ellenorzo szérum (C) - vizsgálandó minták (M x ) 3) Felhasználás elott a mintákat és az összes reagenst alaposan homogenizáljuk, de kerüljük el a habzást. Öntsük ki a tracert ELISA tálkába. 4) Mérjünk 100 µl Standardot (S 0-4 ), 100 µl Ellenorzo szérumot (C), és 100 µl szérummintát (Mx) a megfelelo wellekbe. Az adagolást egy-csatornás pipettával végezzük, és minden reagenshez új pipetta-hegyet használjunk. 5) Mérjünk minden wellbe 100 µl Tracer oldatot a 8-csatornás pipettával. Lásd még Megjegyzések 1. 6) Rögzítsük a zárófóliát, és helyezzük az ELISA-termosztátba. 7) Inkubáljuk a platet 2 órán keresztül 37 C homérsékleten. 8) Vegyük ki a platet a termosztátból, vegyük le a zárófóliát, és öntsük ki a wellek tartalmát. 8-csatornás ismétlo pipettával adjunk mindegyik wellbe 300 µl mosópuffert, majd öntsük le a felülúszót. Lásd még Megjegyzések 2. 9) Ismételjük meg egymás után ötször a 8. lépést. Ha rendelkezésre áll ELISA mosó, a hatszori mosást azzal végezzük. 10) Öntsük ki az TMB-szubsztrátot a tálkájába, majd 8-csatornás pipettával adagoljunk minden wellhez 200 µl-t, és hagyjuk szobahomérsékleten, fénytol védve 30 percig. Lásd még Megjegyzések 3. 11) Adjunk mindegyik wellhez 50 µl stop reagenst, és hagyjuk 5 percig szobahomérsékleten állni. Lásd még Megjegyzések Táblázat Folyamatábra, Pipettázási kalauz (térfogatok mikroliterben) Well Standard Minta Ellenorzo Reagensek szérum Standard 100 Minta 100 Ellenorzo szérum 100 Tracer Inkubálás 37 o C-on 2 órán át. Mosópuffer Felülúszó leöntése Mosás-leöntés ismétlése 5 további ciklusban TMB szubsztrát Inkubálás szobahomérsékleten 30 percig, fénytol védve. Stop reagens Inkubálás szobahomérsékleten 5 percig. Fotometriás mérés, kiértékelés 12) Tegyük a platet a fotométerbe, és végezzük el a mérést 450 nm hullámhosszon. 13) Számítsuk ki az eredményeket a következo fejezet szerint

5 Az eredmények számítása Kézi számítás A számítás menetét jellemzo mérési adatokkal szemléltetjük. A kapott számadatoknak, és a kalibrációs görbének hasonlítaniuk kell a 2. táblázathoz, illetve az 1. ábrához. Adatfeldolgozó program hiányában a kiértékelést manuálisan az alábbiak szerint végezzük el: 1) Számítsuk ki a párhuzamosok középértékét. 2) Vonjuk ki az NSB-t (azaz az So OD értékét) a standardok, illetve a minták átlagos OD értékeibol (NSB korrekció). 3) Lin-lin papíron ábrázoljuk a standard koncentrációkhoz tartozó NSB-vel korrigált OD értékeket. 4) Olvassuk le a mérendo minták koncentrációit a standard görbérol az NSB-vel korrigált OD értékek alapján. Egyes adat-kiértékelésekhez, rendszerint minoségellenorzési célból, szükség lehet a specifikus kötési értékekre. Erre a B/Bmax értékek használhatók, amelyek számításához szintén a standardok, illetve minták NSB-vel korrigált értékeit osztjuk a maximális standard OD értékével az alábbi egyenlet szerint: S1-4/Mx (AU) -S 0 (AU) B/Bmax (%) = x 100 S4 (AU) - S 0 (AU) Számítógépes adatkiértékelés A korszeru mérokészülékek lehetové teszik a fotometriás mérést követo azonnali ("on-line") számítógépes adatfeldolgozást is. A sokféle feldolgozó program közül jelen készítményhez speciálisan immunometrikus assayre kifejlesztett illeszto programok (spline vagy simított négyzetes spline) használatát javasoljuk. Ügyeljünk arra, hogy vannak olyan kiértékelo programok, amelyek a O- standard és az elso standard között is interpolálnak, de a számított koncentrációk közül csak azok tekinthetok valósnak, amelyek értéke magasabb, mint a mérés statisztikailag meghatározott kimutatási határa (ld. ÉRZÉKENYSÉG). 2. táblázat Jellemzo mérési eredmények ßhCG miu/ml O.D. O.D. O.D. átlag B/Bmax % ßhCG miu/ml S 0 0 0,043 0,047 0,045 1,871 - S ,255 0,283 0,269 9,314 - S ,712 0,728 0,720 28,066 - S ,471 1,470 1,471 59,293 - S ,442 2,368 2, C - 1,744 1,680 1,712 69,314 67,761 AU, O.D. (NSB korr.) 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Koncentráció, miu/ml 1. ábra Tipikus standard görbe (Mintameghatározásra nem használható!)

6 Minoségi jellemzok Az assay jellemzo paraméterei Bo/Bmax < 5 % Érzékenység Jelen készlettel az analitikai érzékenység a 0-standarddal 15 párhuzamos mérésbol meghatározva 1,5 miu/ml. Értéke egyenlo a Bo+2*SD kötési értékhez tartozó koncentrációval. Funkcionális érzékenység A készlet funkcionális érzékenysége 4 miu/ml. Meghatározása alacsony hcg tartalmú minták 15 független méréssorozatban kapott inter-assay imprecíziós profiljából történt, értéke egyenlo egyenlo az imprecíziós görbe 22 %-os metszéspontjához tartozó hcg koncentrációval. Nagy-dózisú Hook effektus Az effektus miu/ml alatti koncentrációban nem jelentkezik. Specificitás Az assay-ben felhasznált antitestek keresztreakciója human TSH-ra 0,18 %, human LH-ra 0,37 % és human FSH-ra 0,05 %. Ismert mennyiség visszanyerése ( "recovery") Egyéni szérummintákhoz ismert mennyiségu hcg-t adva, a visszanyerés (recovery) 91 ± 11,6 % (középérték ± SD, n= 16). Pontosság és reprodukálhatóság Az intra-assay pontosságot 15 párhuzamossal egy sorozaton belül, az inter-assay pontosságot 2 párhuzamossal, 15 független mérésben értékelve, 6 mintára az alábbi adatokat kaptuk. Intra-assay Inter-assay átlag (miu/ml) CV % átlag (miu/ml) CV % 4,30 11,07 4,84 18,46 12,74 4,34 12,59 14,85 28,53 8,65 26,84 10,44 62,14 4,99 56,73 5,06 76,19 2,89 70,69 7,58 83,93 4,83 80,57 6,56 Várható referens tartomány: Egészséges felnottekben a referens tartomány: 5 miu/ml. 16. hetes terhes szérum: miu/ml (1 MoM) Kóros értékek: Daganatos szérum koncentrációk: >20 miu/ml Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások 1) A standardok, ellenorzo minta, szérum minták, valamint a tracer bemérése után a reakcióelegy homogenizálása céljából a plate-t a termosztát keverteto programjával, vagy - ha ez nem áll rendelkezésre - akkor egy keverogép alacsony fordulatszámú használatával kb. 5 másodpercig kevertessük. A kevertetésnél ügyeljünk arra, hogy a wellek tartalma ne fröccsenjen ki. 2) Ha nem áll rendelkezésünkre ELISA mosó, akkor kézi mosást kell végrehajtanunk, ami a reakcióelegy leöntésébol és 6 db. mosópuffer adagolás - leöntés ciklusból áll. A leöntéseket mindig a plate hirtelen lefordításával végezzük, majd csapkodjuk ki a wellek-ben maradt cseppeket egy nedvszívó papírra. A gyors kiöntésnek elsosorban a reakcióelegy eltávolítása esetén van nagy jelentosége, hiszen ellenkezo esetben a wellek tartalma elszennyezheti egymást, ami meghamisítja a mérést

7 3) Ha rendelkezésünkre áll olyan ELISA inkubátor, vagy rázógép, amellyel a plate - a reagensek kifröccsenésének veszélye nélkül - rázatható, akkor a szubsztrát reakciók (pnpp, TMB) elején, valamint a stop reagens adagolása után ajánlott egy kb. 10 másodperces óvatos rázatás. Egyéb tudnivalók Tárolás A készlet komponensei -felbontott reagensek is- 2-8 C között tárolhatók a lejárati idon belül. A készlet lejárati ideje A készlet a gyártástól számítva általában legalább 16 hétig használható. A pontos lejárati ido a kíséro bizonylaton és a dobozcímkén van feltüntetve. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a különbözo gyártási számú készletek egyes komponensei nem helyettesíthetok sem egymással, sem más gyártó hcg készletének komponenseivel. Biztonsági óvórendszabályok Fertozésveszély A kitben lévo humán szérumot tartalmazó komponensek eloállításához felhasznált szérum HIV-Ab és HBsAg vizsgálatra negatív eredményt adott. Ennek ellenére a humán szérumot tartalmazó komponenseket potenciálisan fertozoként kell kezelni, és az erre vonatkozó általános laboratóriumi higiénés szabályokat be kell tartani

8 IZOTÓP INTÉZET Kft Budapest, Pf.: 851. Tel.: Fax:

9 EK-76m/3. verzió/