QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) a mitochondrium antitestek szemikvantitatív kimutatására humán szérumban. A mitochondrium antitesteknek a jelenléte felhasználható a klinikai adatokkal és más laboratóriumi vizsgálatok eredményével együtt kiegészítő adatként a primer biliaris cirrhosis diagnózisának felállítása során. A teszt összegzése és magyarázata Az elsődleges biliaris cirrhosis (PBC) krónikus májbetegség, melyet a kis intrahepatikus epevezetékek elpusztulása jellemez. A vezetékek előrehaladott pusztulása a máj egyre jelentősebb funkcionális károsodását okozza, és idővel májelégtelenséghez, majd a májátültetés szükségességéhez vezethet. 1, 2 A PBC etiológiája nem ismert, bár a genetikai komponens, valamint egyéb faktorok jelentős szerepet játszhatnak a betegség kialakulásában. 1,3,4 A PBC tipikusan éves korban fordul elő, és a nőket gyakrabban érinti, mint a férfiakat (a becsült nő:férfi arány 9:1). 3,4 A PBC gyakorisága a PBC-betegek elsőfokú rokonságában 1,3% - 6.4% között mozog 4,5. A PBC világszerte minden emberfajnál előfordul. Az előfordulási gyakoriság a jelentések szerint földrajzi helyenként igen eltérő, a becslések szerint 2 per főtől (Japában és Ausztráliában) a 40 per főig (az Egyesült Államokban) terjed. 3, 6 A szerológiai assay-ek fontos segítséget nyújtanak a PBC felismerésében és diagnosztizálásában, mivel sok, a PBC-vel asszociált antitest jelen van, mielőtt a tünetek nyilvánvalóvá válnak. 7-9 Az antimitochondriális antitestek (AMA) amelyeket indirekt módon detektál az immunofluoreszcens assay (IFA) - a PBC klasszikus szerológiai markerei. 10 Annak ellenére, hogy az AMA a jelentések szerint a PBC betegek akár 90-95%-ában is kimutatható, a detekció gyakorisága ennél jóval alacsonyabb lehet. 11 Az IFA-módszerrel történő AMA detekció nagymértékben függ a vizsgáló képességeitől, az assay technikai komponenseitől, illetve más antitestek jelenlététől, melyek takarhatják vagy megzavarhatják az IFA mintázatok értelmezését. Korábbi vizsgálatok a mitochondriális antigének 9 szubtípusát írták le, melyeket M1-M9 nevekkel láttak el. 12 A fő autoantigének, a PBC betegek szérumja által kiválasztva, az M2 antigén frakciót ismerik fel. Az M2 antigén elsődleges komponenseit az 1-oxosav dehidrogenáz komplex tagjaiként ismerték fel. A specifikus antigéneket a következőként azonosították: piruvát dehidrogenáz komplex (PDC-E2) E2 alcsoportja, az elágazó láncú 2-oxosav dehidrogenáz komplex (BCOADC-E2), és a 2- oxo glutarát dehidrogenáz komplex (OGDC-E2). 13 Ezeknek az antigéneknek az azonosítása tette lehetővé az ELISA assay-ek kifejlesztését. Az ELISA tesztek szenzitívebbnek bizonyultak az IFA teszteknél Az első generációs anti-m2 ELISA tesztek a PDC-E2-t hasznosították elsődleges szubsztrátként a PBC-specifikus antitestek detektálására. Bár a hisztológiailag igazolt PBC betegek 80-90%-ánál vannak jelen PDC-E2 antitestek, a PBC betegek mintegy 10%-a csak a BCOADC-E2 és/vagy OGDC-E2 komplexre reagál. 18,19 Gershwin és Leung kifejlesztett és szabadalmaztatott egy tripla expressziójú hibrid klónt ( MIT3 ), amely kilöki az immunodomináns epitópokat: PDC-E2, BCOADC-E2, és OGDC-E2. 11, 15, 16, 19 A MIT3-n alapuló ELISA kiemelkedő teljesítményt mutatott az IFA vagy a hagyományos PDC-E2-alapú ELISA tesztekhez képest, és észlelte az AMA-t az IFA által AMA negatívnak bizonyuló PBC beteg szérumának több mint kétharmadában. 15, 16 Mivel az AMA jelenléte a tünetes betegség kialakulásának előjele lehet, a PBC markereinek pontosabb azonosítására való képessége hozzájárul a korábbi diagnosztizáláshoz ill. kezeléshez, és a betegség előrehaladását lassíthatja. 7,8,9 1

2 A módszer elve Affinitástól tisztított rekombináns antigén (MIT3) tartalmaz immunodomináns adag PDC-E2-t, BCOADC-E2-t, és OGDC-E2-t, kötődik a polisztirén mikrokutas lemez vájataihoz olyan körülmények mellett, amelyek megőrzik az antigén natív állapotát. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő anti-mitochondrium antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A tesztet spektrofotometriás módszerrel lehet értékelni úgy, a betegek mintáival kapott szín intenzitását lemérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított MIT3 antigénnel fedve (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek humán Mitochondrium M2 antigén ellenes antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. M2 EP (MIT3) ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum Mitochondrium M2 ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. M2 EP (MIT3) ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum Mitochondrium M2 ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínre festve, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP mosó koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kék színűre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a M2 EP (MIT3) ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a M2 EP (MIT3) ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében 2

3 vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. 3

4 A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálndó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 M2 EP (MIT3) mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL M2 EP (MIT3) ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll) előhígítva 1 1.2mL M2 EP (MIT3) ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll) előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Wash (mosó) Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HS HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, , és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény a HRP mosó koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosó koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosó koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer egy hétig stabil 2 8 C között tartva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a M2 EP (MIT3) ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, a M2 EP (MIT3) ELISA erősen pozitív kontrollt, és az ELISA negatív kontrollt. 4. A M2 EP (MIT3) antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységekben történő meghatározása céljából használjon mind a három kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. 4

5 A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t az előhígított M2 EP (MIT3) ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, a M2 EP (MIT3) ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon µL hígított HRP mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. A M2 EP (MIT3) ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a M2 EP (MIT3) ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a M2 EP (MIT3) ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a M2 EP (MIT3) ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet 5

6 érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított M2 EP (MIT3) ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított M2 EP (MIT3) ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított M2 EP (MIT3) ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A M2 EP (MIT3) ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint d. Az ELISA negatív kontroll és a M2 EP (MIT3) ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek minőségének lényeges eltérését kontrollálja. A M2 EP (MIT3) ELISA erősen pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást a teszt küszöbértékének közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A2 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. 21 Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután minden egyes minta reaktivitása kiszámítható olyan módon, hogy a minta OD átlagát elosztjuk a M2 EP (MIT3) ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. A kapott eredményt szorozzuk a M2 EP (MIT3) ELISA mérsékelten pozitív kontrollt tartalmazó üveg címkéjén feltüntetett egység mérőszámával. Minta OD Minta eredménye = x M2 EP (MIT3) ELISA mérs. poz. kontr. (egység) (egység) M2 EP (MIT3) ELISA mérs. poz. kontr. OD A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi adatok csak tájékoztatásra szolgálnak. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. Ekkor a mintát be lehet osztályozni mint negatív, gyenge, mérsékelten pozitív, vagy erősen pozitív, az alábbi táblázat szerint Egység Negatív < 20 Gyengén pozitív Mérsékelt illetve erősen pozitív > 25 6

7 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában mitochondrium antitestek vannak, és felveti a primer biliaris cirrhosis fennállásának lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs mitochondrium antitestje, vagy annak koncentrációja nem éri el a teszt kimutathatósági küszöbét. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA kit használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott M2 EP (MIT3) eredmények ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgG érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nemspecifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Nem minden primer biliaris cirrhosisban szenvedő beteg mintája pozitív mitochondrium antitestekre. 3. Az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 4. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva. Várható értékek A PBC előfordulási gyakorisága becslések szerinti 2 per főtől kezdve (Japában és Ausztráliában) 40 per főig (az Egyesült Államokban) terjedhet. 3, 6 Bár általánosságban azt feltételezték, hogy az anti-mitochondriális antitestek 90-95%-os arányban vannak jelen a PCB betegekben, a detektált antitestek gyakorisága függ a vizsgált társanyagtól, és az érzékenység lehet akár 72 %-os alacsonyságú. 11 Az AMA specificitása az IFA szerint PBC esetén % között mozog. 11 Referencia tartomány Anti-M2 (MIT3) antitestek tünetmentes egészséges egyénekben 520 tünetmentes, egészséges egyénből álló csoportot vizsgáltak M2 EP(MIT3) antitestekre a QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA-val. Korra és nemre vonatkozó adatok 299 mintánál álltak rendelkezésre. A kor év között mozgott, 150 férfi és 149 nő tartozott a csoportba. Erre a populációra az átlagérték 7.6 egység, a mediánérték 6.0 volt. Az assay specificitása 98.5% volt (512/520) a normális alanyok számára. Két reaktív mintánál az IFA vizsgálata tisztán kimutatta az AMA mintákat. Specifikus Működési Jellemzők A QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA-val észlelt M2 (MIT3) antitestek gyakorisága összesen 980 biztos PBC (978) vagy PBC/Autoimmun Hepatits (AIH) (2) mintánál, amelyeket több klinikai csoport állított össze, az 1. számú táblázatban található. Kizártuk az AIH-tartalmú mintákat, az ismerten MA-negatív PBC vagy az olyan betegeket, akiknek a betegsége gyanított, de nem bizonyított. Az assay összetett szenzitivitása 87,3% (856/980) volt. Az assay specificitása 98,7% volt (512/520) (590/598). A pozitív prediktív érték 99,1%, míg a negatív prediktív érték 82,6% volt. Minden nem- PBC vagy PBC/AIH középértéke és mediánértéke 7,5 illetve 5,9 egység volt. 7

8 1. Táblázat: Szenzitivitás ból QUANTA Lite M2 EP (MIT3) ELISA N=1578 QUANTA Lite M2 EP (MIT3) ELISA Betegcsoport n= poz kétes neg PBC (967) vagy PBC/AIH (13) Egészséges kontrollok (520); Primer sclerotizáló cholangitis PSC (47), Más betegségben szenvedő kontrollok (31) Szenzitivitás: 87.3% (856/980); 95% Megbízhatósági Intervallum (CI): 85.1% hoz 89.4% Specificitás: 98.7% (590/598); 95% Cl: 97.4% hoz 99.4% Kereszt-Reaktivitás 155 nem-pbc májbetegségben szenvedő beteg szérumát (70 AIH, 46 PSC, 8 AIH/PSC) és autoimmun- vagy fertőző betegségekben szenvedő beteg szérumát (3 LKM-1, 2 SLA, 3 GPA, 3 chromatin, 3 ASCA, 2 Sm, 2 RNP, 2 SS-A, 2 SS-B, 2 Scl-70, 2 Jo-1, 1 SLE, 2 HCV, 2 gyanítottan nem-pbc májbetegégben szenvedő beteg szérumát) vizsgálták a QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA-val az assay specificitásának felmérése céljából. A QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA egyetlen autoimmun- vagy fertőző betegségekben szenvedő beteg szérumát sem értékelte pozitívnak. Öt AIH minta pozitív volt, de ezek lehettek nem diagnosztizált vagy kialakulóban levő AIH/PBC szindróma esetek. Minden AIH vagy AIH/PSC mintát kizártak a specificitás számításakor.. Precizitás és reprodukálhatóság Az intra-assay teljesítményt 6 minta egyenként összesen hatszoros futtatásával értékelték. 2. Táblázat Intra-assay Teljesítmény ból QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA A B C D E F Átlag egység SD CV % Az inter-assay teljesítmény értékelése dupla-teszteléssel történt, öt mintán, a készlet magas pozitív kontrollja (HPC) és negatív kontrollja (NC) naponta kétszer (egyszer reggel és egyszer délután), három napon keresztül. 3. Táblázat: Inter-assay Teljesítmény -ért QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA HPC NC A B C D E Átlag egységs SD CV % Hivatkozások 1. Kaplan, M. M. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 335, (1996). 2. Heathcote, E. J. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 31, (2000). 3. Feld, J. J. & Heathcote, E. J. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 18, (2003). 4. Talwalkar, J. A. & Lindor, K. D. Primary biliary cirrhosis. Lancet 362, (2003). 5. Jones, D. E., Watt, F. E., Metcalf, J. V., Bassendine, M. F. & James, O. F. Familial primary biliary cirrhosis reassessed: a geographically-based population study. J Hepatol 30, (1999). 6. Kim, W. R. et al.: Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology 119, (2000). 7. Metcalf, J. V. et al.: Natural history of early primary biliary cirrhosis. Lancet 348, (1996). 8

9 8. Kisand, K. E. et al.: The follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 36, (2001). 9. Prince, M., Chetwynd, A., Newman, W., Metcalf, J. V. & James, O. F. Survival and symptom progression in a geographically based cohort of patients with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 123, (2002). 10. Walker, J. G., Doniach, D., Roitt, I. M. & Sherlock, S. Serological Tests in Diagnosis of Primary Biliary Cirrhosis. Lancet 39, (1965). 11. Muratori, P. et al.: 'True' antimitochondrial antibody-negative primary biliary cirrhosis, low sensitivity of the routine assays, or both? Clin Exp Immunol 135, (2004). 12. Berg, P. A. & Klein, R. Mitochondrial antigens and autoantibodies: from anti-m1 to anti-m9. Klin Wochenschr 64, (1986). 13. Fussey, S. P., Guest, J. R., James, O. F., Bassendine, M. F. & Yeaman, S. J. Identification and analysis of the major M2 autoantigens in primary biliary cirrhosis. Proc Natl Acad Sci USA 85, (1988). 14. Vergani, D. & Bogdanos, D. P. Positive markers in AMA-negative PBC. Am J Gastroenterol 98, (2003). 15. Miyakawa, H. et al.: Detection of antimitochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMAnegative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantigens. Hepatology 34, (2001). 16. Moteki, S. et al. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 24, (1996). 17. Fritzler, M. J. & Manns, M. P. Anti-mitochondrial autoantibodies. Clin Appl Immunol Rev 3, (2002). 18. Nishio, A., Keeffe, E. B. & Gershwin, M. E. Immunopathogenesis of primary biliary cirrhosis. Semin Liver Dis 22, (2002). 19. Leung, P. S. et al. Use of designer recombinant mitochondrial antigens in the diagnosis of primary biliary cirrhosis. Hepatology 15, (1992). 20. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Fourth Edition, HHS Pub#(CDC) , (CDC/NIH, 1999). 21. Internal Quality Control: Principles and Definitions, Approved Guidline, NCCLS Doc C24-A2 (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1991). A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. Technical Service Old Grove Road HUN May 2007 San Diego, CA Revision HUN0 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: