Molekuláris pathologia alkalmazása a mindennapi pathologiai diagnosztikában Tóth Erika, Csernák Erzsébet, Gallai Mónika Mit? Országos Onkológiai Intézet Hogyan? Miért?
The field of molecular diagnostics is growing, adapting, changing constantly, and beginning to permeate virtually every area of medicine. (MB Rita Molecular diagnostics Hematology 2003)
Molekuláris biológiai alapfogalmak 1. DNS szerkezete Tm= 4(G:C) + 2(A:T)
Molekuláris biológiai alapfogalmak 2. DNS replikáció
Molekuláris biológiai alapfogalmak 3. Fehérje szintézis Centralis dogma
Molekuláris biológiai alapfogalmak 4. Fehérje szintézis Kód táblázat
Szekvenálás
Mit Molekuláris célpontok a diagnosztikában I. Fehérjék II. DNS, RNS 1.Génátrendeződések, transzlokációk fiziológiás pathologiás 2.Mutációk (SNP-szinonim, non-szinonim; non-sens; missens) 3.Kromoszóma régió többlet, inzerció, amplifikáció 4.Kromoszóma régió vesztés, deléció III. Kórokozók (fehérje, RNS, DNS alapján)
Mit Fehérjék Sejtfelszíni Intracytoplasmaticus Nuclearis Hogyan Immunhisztokémia Miért Daganatok sejteredete Differenciáltság Prognózis Terápiás célpont
Mit Génátrendeződések, transzlokációk - fiziológiás (IgH, TCR): poliklonális, monoklonális -patológiás: jelen van, nincs jelen Qualitatív Quantitatív Chimera gének protoonkogének bcr-abl t(9;22) c-myc t(8;14) ALK t(2;5) bcl-2 t(18;14)
Hogyan Génátrendeződés, transzlokációk PCR hagyományos valós idejű Kariotipizálás (1000kb-tól) Cytogenetika Interfázis cytogenetika, FISH (1-100kb-ig) CISH fúziós szignál FISH split szignál FISH
IgH génátrendeződés VH D JH C 5 3 5 3 FR1 CDR1 FR2 IgH gén somaticus CDR2 FR3 hypermutatio FR4 CDR3 5 3 5 3 5 3 CDR1 CDR2 CDR3 Intraclonalis divergencia
IgH génátrendeződés (FR3A/LJH) folliculáris lymphomákban Hagyományos PCR módszert követő agaróz gélelektroforézis 100bp
Kapilláris elektroforézis
IgH génátrendeződés, RT-PCR, poliklonális FL CD10
IgH génátrendeződés, RT-PCR, monoklonális FL
Molekuláris vizsgálat indikációi lymphomákban: Diagnosztikus (neoplasticus/reaktív-igh, TCR) Klasszifikáció (specifikus transzlokáció kimutatása- BCL2, BCL1, c-myc, ALK) Prognózis (IGH szomatikus hypermutáció-cll, transzformációra való hajlam-api2/malt1, IGH/BCL10) Beteg követés (IGH, BCL2)
IgH és TCR génátrendeződés vizsgálatának buktatói Álpozitivitás: Kontamináció Pseudoklonalitás (kis minta) Helicobacter gastritis Hepatitis C fertőzés Sjögren syndroma Rheumatoid arthritis tumor reaktív immunválasz Álnegativitás preanalítikai tényezők (degradáció, fixálás) egyetlen V-régió konszenzus primer használata nagyszámú reaktív sejt a mintában részleges IgH átrendeződés szomatikus hypermutáció IgH gén deletio (1/10 lymphoma)
Hogyan FISH módszerek Fusion-Signal FISH LNA-FISH e-fish Split-Signal FISH COBRA-FISH ACM-FISH cat-fish Comet-FISH PNA-FISH arm-fish CB-FISH DBD-FISH CO-FISH D-FISH cryo-fish Fiber-FISH CARD-FISH COMBO-FISH Halo-FISH COD-FISH M-FISH
Hogyan FISH módszerek, fúziós próba Töréspont A gén B gén Fúziós próba hátránya: - alternatív partnerhez való fúziót nem mutatja ki - magas álpozitivitás (5-10%) a véletlen ko-lokalizáció miatt
Burkitt lymphoma, c-myc-igh t(8;14) reciprok transzlokáció Fúziós szignál próba
FISH módszerek, split (hasadó) próba Töréspont A gén Split próba előnye: - detekció független a partner géntől - nincs ko-lokalizációs hiba - könnyű értékelni
Burkitt lymphoma, c-myc transzlokáció Split szignál próba
Dako DuoCISH Automated Dual Color CISH Visualization AP HRP AP HRP Hybridisatio Texas Red és FITC jelölésű próbákkal (Hagyományos FISH) Inkubáció CISH antitest keverékkel Hátrány: kék és lila jel elkülönítése nehéz Előny: mindenütt elérhető, ahol van jó immunhisztokémia érdekelt asszisztens és pathologus technikai háttér Inkubáció piros majd kék chromogen szubsztrát oldattal
Miért Köpenysejtes lymphoma Cyclin D1-IgH transzlokáció t(11;14) IgH Split próba Dako DuoCISH Automated Dual Color CISH Visualization Cyclin D1
DLBCL GC fenotípussal, atípusos Burkitt-szerű megjelenéssel CD10 Ki-67 c-myc split próba, transzlokáció nincs
Real-time PCR módszer Bcl-2 (14;18) transzlokáció kimutatása Exon1 Exon 2 Exon 3 IgH Bcl-2 exon 3 primer primer Fluorescein- Probe Amplicon LC Red - Próba Translocation specific probe anchor próba detector Olvadáspont analízis: Hőmérsékletet fokozatosan 0.1 ºC-kal emeljük az amplifikációs ciklus végén
PCR reakció szenzitivitásának meghatározása DOHH2 sejtvonal hígítási sorral
Olvadáspont analízis valós idejű PCR reakció után
Miért Minimális reziduális betegség kimutatása Gyógyszerek tumorellenes hatásának mérése Csontvelői infiltráció kimutatása Betegkövetés Relapsus korai kiszűrése Normál egyénekben detektált transzlokációk: t(14;18) BCL-2-IGH Follicularis lymphoma t(9;22) BCR-ABL1 Ph+ ALL, CML t(2;5) NPM1-ALK ALCL
Mit RNS alapú vizsgálatok Fúziós gének kimutatása lágyrész daganatokban Hogyan RT PCR mrns cdns PCR Amplifikáció
Fúziós partner Fli1 (11q24) 85-95 % Erg (21q22) Tumor típus PNET / Ewing sarcoma Askin tumor 5-10 % EWS 22q12 TLS 16q11 WT1 (11q13) >80 % ATF1 (12q13) 85-100 % CHN (16p11) 75 % CHOP (12q13) 5+95 % DSRCT Világossejtes sarcoma Extrasceletalis myxoid chondosarcoma Myxoid / kereksejtes liposarcoma
Specifikus molekuláris eltérésekre, transzlokációkra jellemző fehérje expressziók FLI1- EWS/FLI1 PNET/ Ewing sc ALK- ALCL, inflammatoricus myofibroblastos tumor Cyclin D1- IGH/BCL1 köpenysejtes lymphoma CD10, BCL6- germinalis centrum eredetű DLBCL MUM1, FOXP1, BCL2- nem germinalis centrum eredetű DLBCL ZAP70- SHM negatív CLL BCL10- IGH/BCL10, API2/MALT1 gyomor MALT lymphoma
Mit Kromoszóma régió többlet gains N-myc amplifikáció.neuroblastoma EGFR amplifikáció.. tüdőrák, vastagbél ca HER-2 amplifikáció..emlőrák Cyclin D1 amplifikáció fej-nyaki laphámrákok
Hogyan FISH módszer, centromerikus próba
Adenoid cysticus ca 2 kópia EGFR
Valós idejű PCR Abszolút quantifikáció 1-, 13- és 25-szörös N-myc amplifikációt tartalamzó IMR 32 neuroblastoma sejtvonal segítségével. 25 13 1 copies
N-myc status Túlélési valószínűség P= 0.192 Nem amplifikált Amplifikált Túlélés (hónapok)
N-myc amplifikáció és szövettani megjelenés közötti öszefüggés 30 kópia MYCN Differenciálatlan tumor Magas MKI Prominens nucleolusok
Mit Kromoszóma régió vesztés, silencing EGFR deletio.tűdőrák 3p, 5q,18q allélvesztés.fej.nyaki laphámrák P16 metiláció (silencing) fej-nyaki laphámrákok MMR metiláció vastagbélrák, nem herediter
Mit Mutációk K-ras. Vastagbélrák B-raf..vastagbélrák, melanoma, pajzsmirigy EGFR.tüdőrák P53.fej-nyaki laphámrákok, Li-Fraumeni syndroma BRCA1/BRCA2..emlőrák APC.FAP, Turcot syndr (CNS tumor+colon ca) MMR HNPCC C-kit.GIST PDGFR.GIST
BRAF: 7q34 protoonkogén, serin-threonin kináz mutáció: 89%, exon 15(V600E): szubsztrát-kötő helyet védi 11%, exon 11 (G loop): ATP-kötődés mediálása Membrane RAS P RAF P P Cytosol MEK P P A mitogén-aktiválta-protein-kináz (MAPK) kaszkád egyik génje. Specifikus mutációi önmagukban is génaktivációt idéznek elő. Növekedési faktor-szignál nélkül is sejtproliferációt indukál. Differenciációt gátolja. V600E V600E B-RAF is approximately 480 fold more active than wt B-RAF ACA GTG AAA wt ACA GAG AAA mut Nucleus Nuclear substrates Val Glu ERK P P enhanced signal and cellular responses
DNS minta Mutáció kimutatása Real-time PCR-t követő olvadáspont analízissel Az amplifikációs ciklus befejeztével 0.1 fokonként emeljük a hőmérsékletet a sensor próba leolvadásáig
A BRAF V600E mutáció kimutatásának jelentősége Diagnosztikai BRAF negatív Spitz naevus (van Dijk, 2005) Világossejtes sarcoma Endometrium komplex hyperplasia HNPCC Follicularis pajzsmirigy ca Low grade serosus ovarium ca BRAF pozitív Spitzoid melanoma Melanoma Endometrium carcinoma Sporadikus MSI-H rák Papilláris ca follicularis var. High grade serosus ovárium ca Prognosztikai A BRAF+ vastagbélrák kórlefolyása kedvezőtlen Terápiás Nexavar
Mutáns BRAF solaris melanomában Vad típusú BRAF vulva melanomában
A KRAS (vagy BRAF) mutáció gátolja a cetuximab EGFR gátló hatását EGFR Anti- EGFR mab EGFR-től független szignálút aktiváció G12D G12V G13D G13C KRAS V600E P P RAF P MEKP P ERK P P Aktivált állapot gyakoriság 54 % gyakoriság 11 % Blokkolt anti-egfr hatás
Primer tumor Máj áttét 42 éves ffi. - Jobb colonfél ca. + cseplesz áttét. - Anti-EGFR kezelés után rebiopsia. G12V KRAS Wt kontroll - Májáttétek a fenti kezelés alatt. - Non-responder, 2 éven belül meghalt EGFR IH
Mit Kórokozók EBV.lymphomák, nasopharyngealis carcinoma HPV cervix és fej-nyaki laphámrákok HIV.AIDS Mycobactérium tuberculosis Hogyan ISH PCR
Angioimmunoblastos T-sejtes lymphoma, EBV Miért CD21 EBER-EBV encoded RNA ISH CD4 CD10 CD20
Recurralo juvenilis laryngealis papillomatosis HPV 6-11 Recurralo juvenilis laryngealis papillomatosis HPV 6-11
Előnyök, hátrányok FISH PCR alapú módszer Anyag minősége Friss, paraffinos Friss, paraffinos Időigény 2 nap 2-4 nap Szubmikroszkópos eltérések kimutatása igen igen Numerikus eltérések igen nem Heterogén töréspont igen Kisebb találati arány Több partner gén a transzlokációban igen nem Pontmutációk nem igen Érzékenység % tumorsejt 5-10% 0,001-1%
Futó vizsgálatok listája FISH/CISH IGH/BCL-2 dual fusion, IGH split, MALT1 split, C-MYC split, bcl-6 split N-myc dual color EGFR dual color IgH, TCR génátrendeződés EBV kimutatás (whole genom) Mutációk: BRAF KRAS EGFR C-kit Microsatellita instabilitás HPV tipizálás
Molekuláris pathologia Információ, amihez a hagyományos pathologiai feldolgozás során nem jutunk hozzá Sok lehetőséget rejt magában.de csak a puzzle egy darabja A többi adattal együtt kell értékelni az adott összefüggéseket (klinikum, morfológia, immunhisztokémia) figyelembe véve Pozitív eredmény.nem mindig neoplasticus Negatív eredmény.nem mindig nem neoplasticus Racionálisabb, biológiai alapú diagnózis, célzott terápiák