Valódi és álhyperprolactinaemia Toldy Erzsébet Vas Megye és s Szombathely MJV Markusovszky KórhK rháza Központi Laboratórium, rium, PTE ETK DMI Gyakorlati Diagnosztikai Tanszék, Szombathelyi KépzK pzési KözpontK Endokrin betegségek gek laboratóriumi riumi diagnosztikája kötelezk telezı,, szinten tartó továbbk bbképzés, Rendezı: : PTE, OTK, LMI Pécs, P 2009. október 5-8. 5 Szervezık: Prof. Dr. Kovács L. G., Prof. Dr. Ludány Andrea
A prolactin (PRL) identifikálása 1933; Riddle O., Bate R. & Dyshorn S.: The preparation, identification and assay of prolactin- a hormone of the anterior pituitary. American Journal of Physiology, 105, 191-216. 1972; Hwang P., Guyda H. & Friesen H.: Purification of human prolactin. Journal of Biological Chemistry, 247, 1955-58.
A prolactin frakciók k :hypophysaer: forma I. 199 aminosav három diszulfid-híd a monomer forma : free PRL -bioaktivitása a legnagyobb Prehormon: 26 KDa proteolysis -a keringésben ez a domináns: 85% 23 KDa S S S postranslatiós Glycosilatio (25%), phosphorilatio További 14, 16, 22 Kda-os proteolizált formák a keringésben
A prolactin cirkuláló formái Molekulatömeg (kd) 200 150 100 Rogol, Suh, Von Werder, Guyda, Kiefer, Fang, Gamier: 50 0 Little free, monomer 1974-1978 Biológiai aktivitás 23 50 big Inaktív > 150 big-big, Macro-PRL
Arányeltol nyeltolódás s a prolactin frakciókban kban 1974; Rogol A.D & Rosen : Elsıként jelenti, hogy a keringésben domináló PRL forma a big PRL néhány hyperprolactinaemiás betegénél. J.of Clin. Endocrinol.and Metab. 38. 1981; Whittaker : Elsıként számol be arról, hogy relevans hyperprolactinaemiában, amikor a bbprl volt domináns, betege a terhességet komplikáció mentesen viselte. 1982; Andersen et al: bbprl: in vivo bioinaktív, in vitro bioaktív 1985; Jackson et al: Elıször használja a macroprolactin fogalmát. J. of Clin.Endocrinol.and Metab. 61. A felismerés >20 éves; Endokrin kézikönyv: 2001-csak említi
A cirkuláló PRL molekulaformák aránya megváltozik SZINONIMÁK Ábra a Kempinski elıadásból 20 2 78 85 10 5 >150 Kda 50 23 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Immunreaktív- Pseudo- hyperprolactinaemia Macroprolactinaemia: Biokémiai- Átlag populáció, t-yperprolactinaemia PRL frakciók %-os aránya little big big-big
Analitikai probléma ma: a rutinban alkalmazott immunoassay módszerek eltérı foka Monomer PRL szint: 270 mu/l Roche Elecsys 1.gen Abbott Imx ABBOTT AxSYM J & J Amerlite Bayer Immuno-1 Wallac DELFIA DPC Immulite and 2000 Roche Enzymun és Elecsys2.g J & J Vitros ECI Roche Cobas Core Bayer (Chiron Centaur, ACS:180) Beckman Access Fahie-Wilson Clin. Chem. 2000. PRL mu/l 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Macroprolactinaemia prevalenciája Normál populációban - Nık: ~2,00 % - Férfiak: ~0,02 % (Ichihara 1990 (Japán), Bjoro 1995 (Skandinávia)) Hyperprolactinaemiában (reproduktív korú nık: 3%, sec. am. 15%) 21-26 % (Fahie-Wilson, Leslie, Bjoro, Smith, Strachan 1995-2003.) 36-46 % (Viera 1998, Hauche 2002)- válogatott minták. Terhességben: 3-8 % (Pascoe-Lira, 2001) Gyermek és pubertás korban: kevés adat
Intraindividuális variáci ciók, genetikus faktorok 42 macroprolactinaemiás beteg nyomonkövetése 2-7 évig: intraindividuális variáció rendkívül széles (Vallette-Kasic et al 2002) A macroprolactinaemiások elsıfokú rokonai között : 10% -os gyakorisággal találtak nagyon magas bbprl szintet- az eredményük egy valós, de gyenge családi társulást igazol. (Leite et al 1992)
Hazai adat: macroprolactinaemia gyakorisága ga 1 051 hyperprolactinaemiás (>700 mu/l) szérum 77-79% Macroprolactinaemia recovery: <40% 21-23% n=215 Tényleges Hyperprolactinaemia recovery: >60% (Toldy, Lıcsei, L Góth,, Szabolcs, Kovács GL. 2005)
Macroprolactinaemia és s az életkor N=720 >45 év (n=105) 37%* 31-45 év (n=215) 16-30 év (n=400) 14% 23%* * p <0,001 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% A macroprolactinaemia gyakorisága ga (Toldy, Lıcsei, L Góth,, Szabolcs, Kovács GL. 2005)
Összefüggés a macroprolactinaemia gyakorisága és a szérum összes PRL szintje között N=215 Gyakoriság (%) 60 50 40 30 20 10 0 Soong et al 1982: Hasonló megállapítást tett kiegészítve azzal, ezekben az esetekben a bromocriptin hatástalan, viszont a mellékhatás kifejezettebb 700-2000 2000-3000 3000-5000 >5000 Szérum összes PRL szintek mu/l Toldy, Lıcsei, Góth, Szabolcs, Kovács, 2004: Orv.Hetilap., 2005: Endocrine
A macroprolactin szerkezete 1.) PRL-IgG komplexek - macroprolactin molekula-igg 150-170 KDa - gyakori forma: 24-86% 2.) Monomer PRL -aggregátumok - nem tartalmaznak IgG-t - ritkák: >170 KDa, - de lehet 200-600 KDa glycosilált forma? - a proteint kódoló gén DNS szekvenciáján nem találtak mutációt! (Carlson 1992, Hattori 1996.)
Az IgG tartalmú macroprolactin szerkezete IgG S S S S S S S S S S S S IgG IgG IgG IgG IgG IgG Localisatiója: -intravascularis, -CSF-ben nincs Clearence: -csökkent
Prolactin-autoantitest I. Izotípusa: fıként IgG, de leírtak már IgM, IgA-izoformát is Szubtípusa: - heterogének, de pár estben csak IgG4-et igazoltak krónikus Ag stimulusra utal. komplexben foglalt monomer PRL : - serin -phosphorilált, és -dephosphorilált izoformák, - az acidikus isoform (dihidrogén phosphatot köt meg): krónikus antigen stimulusa kifejezettebb. (Hattori et al 2005.).
Prolactin-autoantitest II. Nagyon alacsony affinitású: Ka= 3,2 ±4,2* 106 L/mol Nagy kapacítású: - in vivo kevésbé disszociál, - in vitro az assay-ben használt Ab affinitása sokkal nagyobb a PRL auto-antitestnél!!! Eltérı antitesteket használó módszerek, eltérıen mérik a bbprl-t
Prolactin-autoantitest III. Hattori munkacsoportja korábbi (1992-97) közleményeikben leírják: - a PRL autoantitest assay függıen okoz pseudohyperprolactinaemiát, - ezt I-125-el jelölt PRL felvétellel igazolták. - Ugyanakkor hangsúlyozzák: nem minden esetben igaz az a hypothesis, hogy a bbprl zömét a PRL- Ab komplex teszi ki!
PRL és autoimmunitás A PRL nem csak a hypophysisben, extrahypophyseálisan is pl. placenta) és az immunsejtekben is termelıdik. Endokrin/parakrin PRL stimulálja az immunsejteket (Th1 és Th2) azáltal, hogy a PRL-receptoraikhoz kötıdnek. Az autoimmun betegségekhez gyakran magas PRL szint társul. De Bellis A et al: Prolactin and autoimmunity.pituitary, 2005, 8: 25-30)
SLE-ben : Autoimmun betegségek gek- macroprolactinaemia összefüggései -emelkedett PRL szintek és ezzel együtt különbözı autoantitestek (PRL-, Tg-, TPO-, RF-Ab) emelkedett szintjei mérhetık (Kramer C et al. 2005.) - SLE aktivitása és a PRL-Ab jelenléte között inverz korrelációt találtak (Garcia M et al Lupus, 2004: 13;) -Terhes SLE-ésben a terhesség kimenetelére nézve prognostikus marker a bbprl (Leandos- Miranda et al Lupus, 2007, 16.) RA-ban (Ram S. et al.2004): : összes PRL oka szabad-prl nem a bbprl! Magasabb PRL szintőeknek nagyobb a steroid dosis igényük (Rovensky et al. Clin. Endocrinol. 2009: 70). Immundeficiencia (Ram S. et al.2004): -HIV+ és HIV- csoport összes PRL szintje között nincs különbség, viszont a pozitív esetek szabad PRL szintje alacsonyabb bbprl
[Prolactin-autoantitest]-komplex A komplexet összetartó erık: - nem kovalens kötés (Hattori et al. 1996-7, Carlson et al 1992) Különbözı behatásokra adott válasz: - a többszöri lefagyasztásra és felengedésre rezisztens, de csak a szérumok és a nem túl nagy molekulatömegő bbprl esetében, - a bb-prl preparátumok, valamint a rendkívül nagy molekulatömegő bbprl-aggregátumok nem! A szérumban lévı proteinek jelenléte megvédik a molekulát a disszociációtól. Ok: eltérı kötések, eltérı ionerısség
A macroprolactin biológiai aktivitásának vizsgálata in vitro bioassay-vel (Nb2, lactogen aktivítás: Schepper et al EJE 2003;149:201-7 Összesen 50 macroprolactinaemiás szérumot vizsgáltak PRL-IgG complex okozta macroprolactinaemia: - a lactogen activitás az immunoreactiv PRL szinttel szignifikáns korrelációt mutatott (r=0.64 p< 0.00001) Az IgG nélküli PRL aggregátumok okozta macroprolactinaemiában: - a lactogen aktivítás: a kalkulált szabad PRL-el mutatott pozitív korrelációt. -Hattori N. et al. : In vitro Nb2-bioassay-ben a higítás miatt a disszociáció kifejezettebb (Clin. Endocrinol. 2008, 68)
A macroprolactinaemia klinikai validítása a kétféle macroprolactin között Schepper et al EJE 2003;149:201-7 50 hyperprolactinaemiás eset domináns macroprolactinaemiával PRL-IgG komplex okozta hyperprolactinaemia (n=46) : idiopathiás hyperprolactinemia : 35 (76%) PRL aggregatum okozta hyperprolactinaemia (n=4) : 3-nak gyógyszer provokálta hyperprolactinemiája volt.
Frequency % 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Vezetı klinikai tünetek t elıfordul fordulása macroprolactinaemia tényleges hyperprolactinemia p < 0.01 p < 0.01 N.S. Galactorrhea Infertility Amenorrhea
Morphologiai abnormalitások az MRI leletekben N=123 100 p<0.05 macroprolactinaemia Gyakoriság % 80 60 40 20 p<0.05 tényleges hyperprolactinemia 0 Negativ Microadenoma Macroadenoma Egyéb eltérés
Macroprolactinaemiában a prolactin pulzatilis és diurnális ritmusa nem olyan kifejezett 550 430 Ebéd (Andersen 1982, Jackson 1985) Vacsora Elalvás Monomer PRL molekula dominanciájakor: Ébredés Reggeli PRL mu/l 320 220 110 0 12 18 24 06 h
PRL fiziológi giás emelkedésével járój állapotokban: A menstruáci ciós s ciklus folyamán: - Fraser, Larrea et al.. (1989); középidıben ill. lutealis fázisban: Terhesség - Whittaker 1981, Andersen et al. 1982; Az zisban: összes PRL, big-big PRL free PRL - egyforma arány Az összes PRL macroprolactinaemiában vs. free PRL - Hattori et al 1996; A trimesterek növekedtévelvel a big-big PRL és s a free PRL nı n, de arány nyában a bb PRL A monomer PRL szint a terhesség g során n nem különbk nbözik jelentısen azon terhesek értékétıl, akik macroprolactinaemiások sok. Szoptat Szoptatás Jackson 1985, Fraser 1989 összes PRL (30 után: 2-szeres 2 mu/l), big-big PRL --, monomer PRL
Hyperprolactinaemiát okozó gyógyszerek gyszerek hatására: a monomer PRL nın meg a bbprl nem változikv Neurolepticumok, Antiepileptikumok Antidepresszánsok Dopamin antagonisták Narcoticumok Antihypertensivumok (methyldopa, Ca2+ csatorna blokkolók pl. verapamil) Hormonok, hormon hatású szerek: E2, TRH, inzulin, cyprosteron acetát
Dopamin agonisták: bromocriptin hatás macroprolactinaemiában Egy egyszeri dosisra (2,5-5 mg) adott válasz macroprolactinaemiában - 5-6 óra múlva- csekély változás (Hattori: 1994, Bonhoff:1995) - monomer PRL (82%), bbprl (21%) Fraser et al (1989) Hosszabb ideig adott dosis: (Hattori: 1996, Heaney: 1999, Fabre 1997, Valette-Kasic, Olukoga 2002) - eredmények következetesen csökkenést igazolnak a bbprl-ben is, bár a csökkenés nem olyan kifejezett, mint a nem macroprolactinaemiások között. Fahie-Wilson et al Annals of Clin. Biochem. 2005; 42: 175-92
bbprl-elimin eliminálásánaknak analitikai lehetıségei Gél l diffúzi ziós s kromatográfia referencia módszer, de nem rutin Protein A precipitáci ciós s módszerm rutinban alkalmazható, 90%-os hatásfok Polyethylene glycol (PEG) precipitáci ció rutinban jól alkalmazható, megfelelı cut-off mellett 100%-os hatásfok Ultrafiltráci ciós módszer rutinban jól alkalmazható, 100%-os hatásfok, drága
PEG PEG H 2 O PEG módszer m korlátai : nem quantitatív H 2 O H 2 O nem specifikus precipitáció I g G S S S S S S S S S I g G H 2 O PE G S S S I g G I g G I g G I g G H 2 O I g G PE G H2O PEG PEG nem minden módszerhez használható (MEIA, ACS, Immulite) csak az Ab-PRL komplexet csapja ki nem tudjuk pontosan, a monomer PRL szintek referencia értékét
Nincs definiálva a PRL ref. tartománya a bbprl meghatározása után: 169 PEG kezelt minta PRL lelete három módszerrel mérve 30 normal MPRL thprl Fequency of MPRL (%) 25 20 15 10 5 0 ECLMA-I EC LMA-II C LMA Distribution of cases % 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% N=153 N=129 N=42 N=71 15 12 27 N=55 ECMA-I ECLMA-II C LMA Nincs meghatározva a PEG kezelt mintákból mért PRL referencia tartománya
Visszanyerési százalék visszanyerési százalék 90 88 86 84 82 80 78 76 74 72 p<0,001 p<0,001 ECLMA I ECLMA II CLMA
A klinikai csoportok PRL átlagértékei a PEG kezelést követıen ECLMA I ECLMA II CLMA HPRL valószínő n=70 ** ** ** ** ** HPRL nem valószínő n=45 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 PEG kezelést követı PRL szintek **Szignifikánsabb (p<0,0001) magasabb PRL szintek a nagy klinikai valószínőségő csoportban
Következtetések A PEG kezelést követı monomer PRL koncentrációk módszerfüggı különbsége jelentıs, hiszen terápiás konzekvenciája van. Az eltérı módszerekkel mért biológiailag aktív PRL értékek harmonizálást igényelnek. A gyártóknak a PRL szintek referencia tartományát a bbprl eliminálását követıen is meg kellene határoznia.
Clinical data of women with simultaneous macroprolactinemia and truet hyperprolactinaemia (8/59; 15%) Patient Age (y) Clinical findings PRL in native serum miu/l PRL after PEG precipitation miu/l PRL recovery % Pituitary MRI Drug treatment 1 22 Raromenorrhea, 2838 1002 35 microadenoma bromocriptine breast discomfort 2 43 Regular menses, 2194 570 26 microadenoma bromocriptine headache 3 54 Headache, prior 6153 898 15 normal bromocriptine uterus extirpation 4 28 Alopecia, hirsutism, 1652 662 40 normal bromocriptine infertility 5 28 Oligomenorrhea, 6006 706 12 normal estrogen infertility 6 24 Acne, alopecia, 2228 780 35 normal estrogen raromenorrhea 7 31 Raromenorrhea, 2000 800 40 normal estrogen galactorrhea 8 25 PCOS*, oligomenorrhea 1546 550 38 normal none *PCOS polycystic ovaries syndrome
A hyperprolactinaemia kivizsgálásának algoritmusa A PRL szint meghaladja a referencia tartományt PRL szint mérés, PEG kezelés után, a PRL szint és visszanyerési százalékának (PRL%) meghatározása 1. A PEG kezelés után a PRL magas és a PRL% >50 2. A PEG kezelés után a PRL magas és a PRL% <50 3. Ha a PEG kezelés után a PRL normális és a PRL%: <50 Tényleges hyperprolactinaemia >1000 mu/l sella MR 700-1000 mu/l Fiziológiás és iatrogen tényezık kizárása után, ha a magas PRL szint többször elıfordul, MR elvégzése javasolt Tényleges hyperprolactinaemia és macroprolactinaemia együttes elıfordulása >1000 mu/l sella MR 700-1000 mu/l Fiziológiás és iatrogen tényezık kizárása után, ha a magas PRL szint többször elıfordul, MR elvégzése javasolt Macroprolactinaemia Nincs teendı. (Autoimmun betegség fennállta mérlegelendı) (Endokrin Útmutató: 2008. Toldy E. és Lıcsei Z.)
Macroprolactinaemia összefüggése más s hormonleletekkel Hypothalamikus eredet: Monomer PRL: Ösztradiol : Macroprolactinaemia Monomer PRL: norm. Ösztradiol : - FSH, LH : - FSH, LH : v. bb PRL : Suliman et al 2003.
Saját t tapasztalatunk Vas megyében 214 macroprolactinaemiás eset közül 32 beteg fölöslegesen részesült bromocriptin terápiában
Why is this clinically important problem still so little known 8-158 years after it was first described? Although were described several years ago: 1974 The heterogeneity of PRL -Suh, Allolio,, Jackson 1992-9595 The anti-prl antibodies, big-big PRL -Suh, Allolio,, Jackson one reason is that a number of relevant advances in this field have been published in specialised laboratory-journals journals Fabio Cattaneo at al. Swiss Med. 2001.131.
Big Prolactin? Sokkal kevesebbet tudunk róla,mint a bbprl-rıl. Nem tisztázott: prohormon dimer? : PRL-protein komplex? 32 Kda binding proteinhez kötıdik 36%-a A big PRL jelenléte összefüggést mutat a bbprl-el. Eltér a bbprl-tıl, mivel hı-stresszre monomer formává alakul
Big Prolactin? Triton et al 1998. 4 esetismertetése Hyperprolactinaemia klinikai jelei hiányoztak 3 esetben, amikor a big PRL volt a domináns (>70%) A big PRL bioaktív in vitro bio-assay-ben. Lisurid eltolja a big PRL big-big PRL konverziót. Lehetıség: a big-big PRL big PRL keletkezik Jelentettek már akromegáliás esetet, ahol a domináns frakció a big PRL volt.
Köszönet a megtisztelı figyelemért!