A keringő tumor markerek klinikai alkalmazásának aktuális kérdései és irányelvei

A keringő tumor markerek klinikai alkalmazásának aktuális kérdései és irányelvei

Malignus megbetegedések gyakorisága és megoszlása kor és nem szerint Magyarországon Férfiak Korosztály (év) Létszám Új megbetegedés/év Gyakoriság/ 10.000 fő 0-14 836827 176 2 15-39 1822275 1650 9 40-59 1345532 11898 89 60 év felett 813822 25274 311 Nők 0-14 796861 161 2 15-39 1763761 2109 12 40-59 1465521 11778 81 60 év felett 1297763 24392 188

Onkológiai beteg gyógyítási és túlélési esélyeit alapvetően befolyásoló tényezők Korai felismerés Biokémiai jellemzők: proliferáció, inváziós képesség, Patológia, labordiagnosztika metasztázis képződés potenciálja Hatékony egyéni terápia

A TM vizsgálatok hatékony klinikai alkalmazását befolyásoló tényezők Irreális elvárások a TM információs értékéről (pl. rákteszt ) Gyakran a vizsgálatkérőknek hiányos az ismerete a rendelkezésre álló lehetőségekről, az alkalmazás módjáról (pl. TM kombinációk) Analitikai eredmények klinikai interpretálásának bizonytalanságai Hiányoznak a kidolgozott klinikai és laboratóriumi protokollok (pl. sok esetben ötletszerű vizsgálatkérések) Laboratóriumi háttér problémái (technikai, szervezési, személyi)

A tumorsejt lehetséges változásai, amelyekből a TM anyagok származnak Változó sejtfelszíni enzimek Onkofetális antigének és más tumor asszociált antigének, izoenzimek kiválasztása Új antigének Változó phagocytosis Csökkent intracellularis kommunikáció és növekedési kontaktgátlás Szintézis és a Sejtmag változása Antigének vesztése Módosult glikoproteinek (gangliozidok) Változó permeabilitás Glikoproteinek módosulása vagy vesztése Változó transzport folyamatok Változó adhézió és kontaktgátlás

Keringő tumor markerek ( tumor produkált markerek Tumor asszociált antigének Hormonok és alegységeik Enzimek, izoenzimek Speciális szérumproteinek Metabolitok

TUMOR ASSZOCIÁLT ANTIGÉNEK CEA CA125 CA19-9 CA15-3 CA72-4 PSA fpsa TPA Gyomor, bél, hámszövet Petefészek Hasnyálmirigy Emlő Gyomor Prostata Hólyag, proliferációs faktor

Szöveti polipeptid antigén (TPA) A TPA 180 000 Dalton molsúlyú polipeptid, amely cytokeratinok keveréke: Fiziológiás előfordulás: Cytokeratin 19 44% Cytokeratin 18 36% Cytokeratin 8 30% Foetalis szövetekben, placentában és az üreges szerveket borító epitheliumban Normál érték: szérumban: 0 90 U/l Vizeletben: <500 U/l Felezési idő: 1 nap A TPA az emberi ráksejtek membránjában termelődik és aktívan szekretálódik a biológiai folyadékokban. Univerzális tumorasszociált antigénnek tekinthető, mivel a tumor lokalizációtól függetlenül emelkedet értéket mutat.

TPA klinikai alkalmazhatósága Önálló alkalmazás Kombináció más TM vizsgálatokkal Húgyhólyag carc. Proliferációs markerként minden solid tumornál

HORMONOK EUTOP hormonképződés Endokrin szövet tumora EKTOP hormonképződés Nem-endokrin tumor termel hormont

EUTOP HORMONKÉPZŐDÉS TUMOROKBAN TUMOR HORMON HATÁS Mellékvesevelő tumorok Pheochromocytoma Neurobastoma Mellékvesekéreg tumorok Hipofízis tumorok Pancreas-Langerhans sejt tumorok (inzulinoma) Pancreas non-béta insulinoma (gastrinoma) Adrenalin Aldosteron Cortisol Prolactin Növekedési hormon Inzulin Gastrin Katekolaminok és metabolitok fokozott kiválasztása vizeletben Conn féle szindróma szérum elektrolit változás Cushing-szindróma Fokozott 17-ketosteroid kiválasztás vizeletben Vércukor ingadozás Mellékpajzsmirigy adenoma Parathormon Szérum kalcium szint ingadozás Medulláris pajzsmirigy carcinoma Chorioncarcinoma Calcitonin hcg

EKTOP HORMONKÉPZŐDÉS TUMOROKBAN 1. APUDOMÁK TUMOR Kissejtes hörgőrákok Karcinoid tumorok Pankreas-szigetsejt tumorok Rosszindulaú epiteliális thymomák 2. Nem-APUDOMÁK Tüdő epidermoid és adeno carcinomái Mamma carcinoma ACTH Lipotrophin (LPH) Vasopressin (AVP HORMON Calcitonin, parathormon, gastrin, (insulin, glukagon) Calcitonin, parathormon, hgh növekedési hormon, prolactin, insulin, glukagon Parathormon, ACTH

SPECIÁLIS SZÉRUMPROTEINEK TG (Thyreoglobulin) Béta-2-mikroglobulin S100 protein AFP (alfa-fetoprotein) Pajzsmirigy carcinoma Melanoma - máj carcinoma - máj metasztázis

ENZIMEK NSE (Neuron specifikus enoláz) - Neuroblastoma - Kis-sejtes tüdőrák - Apudoma TK1 (Timidin kináz) - Limfoproliferációs malignus kórképek (leukemia, limfomák, myeloma, stb.) - Aktivitás marker solid tumorokban

TK1 Timidin kináz Két izoenzim TK1 - citoplazma TK2 - mitochondrium Fiziológiás funkció Timidin TK timidin-trifoszfát (dttp) Tumor marker funkció TK1 aktivitása, mennyisége jellemzően változik a sejtciklussal Alacsony - G0 fázis (rövid felezési idő) Gyors emelkedés - G1/S átmenetben (hosszabb felezési idő) Csökken - M fázis (rövid felezési idő)

TK1 onkológiai alkalmazásai In vitro: In vivo: Immun hisztokémia Szérum (LIAISON) PET - tracer anyag [18F] FLT 3 -deoxi-3 - [18F] flurorotimidin felvételét a TK1 szabályozza Aktív tumor proliferáció kimutatása Specifikusabb, mint a [18F] FDG a kezelésre adott válasz megítélésében. (glukóz metabolizmus a sikeres kezelés után hosszabban fenn marad, gyulladásos makrofágok)

A TK1 önálló alkalmazhatósága Hematológiai neoplasztikus betegségek Hodgkin lymphoma (HL) Non- Hodgkin lymphoma (NHL) Kronikus lymphoid leukemia (CLL) Acut myleoid leukemia (AML) Acut lymphoid leukemia (ALL) Myeloma multiplex (MM) Myelodysplasticus syndroma (MDS) Klinikai alkalmazás Malignitás foka Prognózis Tünetmentes túlélés Terápiás stratégia kiválasztása Követés

A TK1 kombinált alkalmazása más tumor markerekkel a malignitás és a prognózis megítélésére Kissejtes tüdő carcinoma (SCCL) Prostata carcinoma Emlő carcinoma Colorectalis carcinoma Laphámsejtes fej-nyak rákok

Kiegészítő vizsgálatok ( tumor indukált markerek ) Ferritin Akut fázis fehérje (CRP, stb.) Hormonok (ACTH, Prolaktin, Kortizol, stb.) Máj, vese funkció Tápláltsági állapot Gyulladási faktorok

A rosszindulatú daganat kialakulásának detektálása Tumor marker detektálási küszöb Klinikailag kimutatható tumor Tumor növekedés Tumor tömeg 1µg 1mg 1g 10-100g 1kg Tumor sejtek 10³ 10 6 10 9 10 10-11 10 12 Lead time

Daganatnövekedés Tumorsize Daganat méret mass cells tömeg 10kg 10 13 1kg sejtszám 10 12 Letális Lethal 1g 10 9 Coloncancer Malignt melanom Malignt melanom Diagnózis Diagnostic 1mg 10 6 1µg 10 3 1ng 10 0 0 5 10 15 20 Time years Idő (év)

A tumor markerek szérum koncentrációját meghatározó tényezők Tumor tömege és kiterjedtsége TM szintézis TM szekréció Tumor kapcsolata a keringéssel TM katabolizmus (vese, máj funkció, stb.)

Genetikai mutáció okozta malignus transzformáció Kémiai szignál Kis tumor Kapillárisok kialakulása Keringési rendszer

S 100 protein -- melanoma

A tumor markerek laboratóriumi meghatározása

Immunoassay módszerek Antigén (Ag) + Antitest (Ab=antibody)

Antigének (immunválaszt kiváltó idegen molekulák ) Természetes antigének 3000 Dalton móltömeg feletti anyagok, melyek képesek immunválaszt kiváltani(proteinek, glikoproteinek, peptidek stb.) Haptének 1000 Dalton móltömeg alatti vegyületek, amelyek csak hordozó fehérjéhez kötve fejtenek ki antigén hatást (gyógyszerek, steroid hormonok stb.)

Antitestek (Ab) Biokémiai típus IgG osztályú immunglobulinok Előállítás állati immunizációval Tisztítás, ellenőrzés nagy specificitású Ab antiszérum nagytisztaságú MAb (1975) Poliklonális antitestek különböző Ab molekulák keveréke eltérő specificitással Monoklonális antitestek jól definiált egységes Ab molekulák azonos specificitással

Megjegyzendő Másodlagos (poliklonális) antitesteket használnak a mintából megkötött analit kimutatására Másodlagos antitestek: keresztreakció léphet fel a vérben jelen levő antitestekkel (heterofil antitestek)

A detektálási módszerek érzékenysége Latex (PACIA) 10-5 mol Abszorbancia (EIA) 10-9 mol Fluoreszcencia (FIA) 10-12 mol Radioaktivitás (RIA) 10-18 mol Kemilumineszcencia (LIA) 10-19 mol

TM diagnosztika fejlődése Specificitás Anti-szérum 80-as évek Poliklonális antitestek 90-es évek Monoklonális antitestek Jelölés RIA Alternatív módszerek (pl. LIA) Analízis idő 1-2 nap 1-2 óra Módszerek Heterogén-manuális rendszerek Standardizált automata Minőségbiztosítás - igen Paraméterszám: 5-10 15-20 Alkalmazási terület: követés Korai felismerés (PSA) Diagnózis, követés Fajlagos vizsgálati költség: 10-15 US$ 3-5 US$ Vizsgálati szám 5-10 millió/év Immunkémiai vizsg.: 1-2% 300-500 millió/év Immunkémiai vizsg.: 25%

A tumorsejt heterogenitás hatása a poliés monoklonális antitestek által meghatározot tumor markerek expressziójára Heterogén tumorsejtek Minden tumorsejt különböző tumor markereket termelhet Tumorsejt Tumorsejt Minden tumor marker több epitópot tartalmazhat különböző mintázatokkal Tumor marker 1 Tumor marker 2 Tumor marker 3

Multiparametrikus TM vizsgálat A tumor különböző tulajdonságú sejtek keveréke Több TM egyidejű alkalmazása növeli a szenzitivitást A tumor markerek nem szerv, hanem szövetspecifikusak. Epithel sejtek termelik a CA 125 (ovarium) CA 15-3 (emlő) CA 19-9 (pancreas) CEA (vastagbél) antigéneket, ezek specifikus mintázata jellemez egy-egy lokalizációt.

TPA; CEA és CA 15-3 alkalmazása a recidiva illetve a metasztázis korai detektálására emlőrákban Marker Érzékenység (%) Specificitás (%) TPA 63 98 CA 15-3 46 98 CEA 7 99 CA 15-3+TPA 83 96 CEA +TPA 70 98

Ajánlott TM kombinációk vastagbél daganatokban CEA CA 72-4 CA19-9 TPA AFP

Tumor gyanú esetén első választásként ajánlható TM Tumor TM Tumor TM Máj (primer) AFP; CEA Prostata PSA; fpsa Here AFP; hcg Hólyag TPA; CEA; CA 19-9 Fej/Nyak SCC; CEA Emlő CA 15-3;CEA; TPA Tüdő NSE; SCC; CEA; TPA Cervix SCC; CEA; CA 125; TPA Epe, epevezeték CA 19-9; CEA; TPA Ovarium CA 125; CA19-9; CA 72-4; TPA Pankreasz CA 19-9; CEA Neuroblastoma NSE; VMA; HVA Gyomor Kolorectal CA 72-4; CA 19-9; CEA; TPA CEA; CA 19-9; TPA Limfomák, leukémia TK1; ß-2-mikrogl.; Bence- Jones fehérje; monoklon. Immunglob. Pajzsmirigy Tg (papill.); Calcitonin (Medul.) Melanoma S-100

A biomarkerek klinikai hatékonysága az onkológiai gyakorlatban 1. Diagnózis, korai felkutatás 2. A túlélés és a tünetmentes túlélés prognózisa 3. Előrejelzés adjuváns és palliatív kezelés alatt 4. A terápiás válasz monitorozása 5. Különböző markerek kombinálása

Aktív betegfelkutatás tünetmentes rizikócsoportokban Prosztatarák 50 év feletti férfiaknál 40 év feletti fokozott kockázatú férfiaknál PSA és DRV vizsgálat évente; ha PSA konc. 4-10 ng/ml között van és DRV negatív, akkor szabad PSA meghatározás Petefészekrák Javasolt évente transzvaginális UH és CA 125 meghatározást elvégezni azon nőknél, akiknek családjában az emlő- és petefészekrák előfordult. Postmenopausás nők, akiknél a képalkotó módszerek kismedencei térfoglaló folyamatot jeleznek, javasolt a CA 125 meghatározás elvégzése. Ha CA 125 konc. >95 U/mL, részletes onkológiai vizsgálat javasolt.

PSA kimutatása Immunreakcióval ELISA, FEIA, LEIA, stb. Mindegyik gyártónak saját kitje, saját antitestje van, ami más-más epitópra érzékeny fpsa: a kötés során elfedésre kerülő epitópot mutatja ki cpsa: a kötés során felszínen jelen levő epitópot mutatja ki

fpsa kimutatás Probléma: fpsa: 4 C felett gyorsan bomlik 3 órán belül le kell(ene) mérni; ha nem, akkor -70 C-on kell tárolni a mérésig

Diagnózis Általános vizsgálat Fizikális vizsgálat Endoszkópia Képalkotás Sebészi feltárás A kezelés megválasztása Specifikus elemzés Kórszövettan/citológia Klinikai kémia Tumor markerek DNS diagnózis Tumor osztályozás Stádium meghatározás (szóródás) Osztályozás (ráktipizálás) Grading (magas/alacsony rizikó)

Tumor Markerek Túlélési arány (%) Túlélési görbe 100 alacsony TM érték 80 60 magas TM érték 40 20 2 10 20 Túlélési idő (hónapok)

Tumor markerek prognosztikai értéke előrehaladott csírasejtes tumorokban Prognosztikai csoport AFP (ng/ml) hcg (U/L) Jó < 1.000 < 5.000 Közepes 1.000 10.000 5.000 50.000 Rossz > 10.000 > 50.000

Szérum TPA A recidíva prediktív faktora felszíni hólyagrákban

túlélés % túlélés % % 100 Preoperatív koncentrációk prognosztikai értéke TPA % 100 CEA 8 0 <200 U/l 88% 8 <20 ng/ml 88% 0 6 0 p<0,0001 6 0 p<0,0001 4 0 2 0 >200 U/l 4 0 >20 ng/ml 25% 2 28% 0 0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 3 3 8 2 6 hónap 0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 3 3 8 2 6 hónap

Overall Survival TK1 prognosztikai faktor a fej-nyaki laphámrákokban 1,0 0,8 0,6 0,4 TK < 7 IU/L 0,2 TK > 7 IU/L 0,0 0 10 20 30 40 50 60 Time (months) Fontana et at Head&Neck 1993;15; 425-432

Tumor Markerek Szérumkoncentráció TM koncentrációk jellemző változásai a betegkövetés során kezdeti, preoperatív értékek csökkenés, kezelésre adott válasz tartósan normalizálódott érték remisszióban kemoterápia kezelésre adott válasz remisszióban lévő betegnél Visszaesés, emelkedő koncentráció hónapok

TPA használata a tüdőrák monitorozásában HÓNAPOK

Szérum TPA értékek hólyagrákban szenvedő betegek monitorozása során

Szérum NSE (ng/ml) A szérum NSE szint változása magas kezdeti szérumkoncentrációt mutató, SCLC-ben szenvedő beteg 22 hónapos monitorozása során Kemoterápia Áttét az agyban Radioterápia Komplett remisszió Komplett remisszió idő NSE mint a neuroblastoma és a SCLC markere S. Páhlman, T. Esscher, J. Bergh, I. Steinholtz, E. Nou, K. Nilsson Tumour Biology, 5 (1984) 119-126

Az NSE alakulása egy 54 éves, előrehaladott SCLC-ben szenvedő betegnél Komplett remisszió Máj- és csontáttét

Terápia és állapot követés ALL betegekben TK1-el TK1 (U/L) Nap TK1 (U/L) Nap K.L.O Neil és mts; Leukemia (2007) 1-3

A TPA alkalmazható a terápiás válasz megítélésében

Log 10 HCG Log 10 HCG 6 MARKER számítógépes tanácsadó rendszer csírasejtes tumorok kemoterápiás kezelésében M.S Learning és mts. (BMJ. 305. 1995) - HCG koncentráció csökkenés - Leíró regresszió egyenes alapértékek várhatói dőeloszlásával 6 A - hatékony kezelés B - javasolt a terápia változtatás 4 4 2 2 0 kezelés kezelés 0 50.0 100.0 150.0 50.0 100.0 150.0 Idő (nap) Idő (nap)

A TM vizsgálatok ajánlott gyakorisága betegkövetésnél Postoperatív szakban il. kemo- vagy sugárterápia alkalmazásánál A terápia előtt és 2-10 nappal a terápia után (felezési időtől függően) A műtét után 1-2. évben legalább negyedévente A műtét után 3-5. évben legalább félévente Terápia váltás előtt Recidíva, ill. metasztázis gyanújánál Új stádium besorolásnál A kóros TM érték meghatározást követően 14-30 nap múlva

A TM-alkalmazás ajánlott algoritmusa az onkológiai betegkövetésben Tumor marker alapértékek meghatározása Műtét Adjuváns kezelés (ha szükséges) Rutin ellenőrzés*, amely tartalmzza a TM vizsgálatot 1-4 év - 3 havonta 5 év után - 6 havonta A relapsus klinikai jelei Szignifikánsan emelkedett TM értékek TM vizsgálat ismételve egy hónapon belül Emelkedés Csökkenés vagy nem változott A relapsus ellenőrzése Értékelés és kezelés Igen Nem TM értékek folyamatos meghatározása a kezelés alatt és metasztázis követésében Ellenőrzés 1-3 hónapon belül *Rutin fizikális és laborvizsgálatok, évente mellkas-röntgen, mammográfia és csont szcintigráfia

A tumor markerek klinikai használhatósága A. Szenzitivitás 90% - kiváló Specificitás Kitűnő monitorozási célokra 70% - jó Alkalmazható rizikó csoportokban szűrésre B. Szenzitivitás 90% - kiváló Specificitás Alkalmas monitorozásra Alkalmatlan szűrésre 30% - gyenge C. Szenzitivitás 40% - gyenge Specificitás 80% - jó Kérdéses a monitorozásra való alkalmazhatóság

Normál érték Laboratóriumi eredmények klinikai interpretálása Individuális érték A változás kinetikája Multiparametrikus adatkép értékelése Az eredményt befolyásoló tényezők

KÖVETÉS Egyéni állapotváltozás megítélése daganatmentes progresszió terápiás válasz Analitikai jelváltozás =?biológiai változás Szekvenciális vizsgálatok jelváltozás változás időtartama (sebesség) Normál érték nem alkalmas erre a célra Analitikai jelet befolyásoló faktorok C A analitikai módszer szórása C G intraperszonális biológiai szórás C P interperszonális biológiai szórás C p homeosztatikus állapotban a TM szórása Pl. egészséges nőkben CA 15-3 - 6,2% CEA - 3,3% TPA - 28,3% Egzakt értékelési módszer a szignifikáns változások felismerésére

Kóros TM érték klinikai korreláció nélkül Lehetőség Analitikai hiba A vizsgálat ismétlése Nem-malignus betegség További klinikai és labor vizsgálatok (máj, gyulladás stb.) ism. TM vizsgálat Malignus betegség Multiparametrikus TM (szubklinikaqi stádium) vizsgálat Szoros követés Onkológiai vizsgálat Egyéb faktorok Anamnézis (heterofil antitest) Teendők állatharapás immunoszcintigráfia állati eredetű immunstimuláció tranjszfúzió stb.

A TM vizsgálatok klinikai hatékonysága Preanalitika Analitika Postanalitika

Tévedések okai és gyakorisága Preanalitikai szakasz helytelen mintavétel mintacsere téves vizsgálati igény adatkezelés hiba Analitikai tevékenység a mérőberendezés egyedi, váratlan hibája a módszer analitikai specificitása nem kielégítő a mérőrendszer teljesítménye nem kielégítő Posztanalitikai szakasz Téves analitikai értékelés Adatkezelési hiba Késve közölt eredmény stb. stb. 48% 13% 39%

Preanalitika Mintavétel, kezelés, tárolás Klinikai információk Beteg aktuális státusza (pl. műtét előtt, terápia alatt, követés) Befolyásoló in vivo faktorok (pl. nem-malignus társbetegség, gyógyszerek) Korábbi vagy máshol végzett TM vizsgálat (eredmény, időpont, módszer) Laboratóriumi tanácsadó, konzultatív szolgáltatás (pl. további vizsgálatok, TM kombinációk)

Analitika Korszerű, gyors, automatizált immunkémiai módszerek Intra-assay szórás < 5% Inter-assay szórás < 10% Belső és külső minőség-ellenőrzés Külső kontroll anyagok (normál, határérték, extrém magas koncentrációk) Standardizáció, módszerek összevethetősége (AFP, hcg, CEA, PSA nemzetközi standard anyagok)

Postanalitika Laboratóriumi eredményközlés formája és tartalma Analitikai eredmény Referencia tartomány Alkalmazott módszer Analitikai érzékenység Korábbi TM értékek Információ az időbeli változás megítéléséhez (biológiailag szignifikáns vagy nem ± 25%) Javasolt megerősítő vizsgálatok (ismételt mintavétel) Betegtájékoztatás (TM vizsgálatoknak önmagukban nincs diagnosztikai értéke) Laboratóriumi tanácsadó, konzultatív szolgáltatás (pl. további vizsgálatok, TM kombinációk)

Tumor marker vizsgálat jövője Új markerek bevezetése (p53; CA 242; PSMA; stb.) Molekuláris biológiai módszerek: mikro RNS Onkológiai centrumokban (nem pedig háziorvosok részéről) célzottan lehessen kérni

MikroRNS

Tumormarkerek kimutatása kapcsán megjegyzendő Utánkövetésben jelentősége egyértelmű Ehhez azonban ismerni kell a kiindulási értéket BÁRMELY TUMOR MARKER VIZSGÁLAT ESETÉBEN A KEZELÉS ELŐTTI ALAPÉRTÉK NAGYON-NAGYON FONTOS Mielőtt elkezdenék a kezelést, TEGYENEK FÉLRE MINTÁT (fagyasszák le) Következetesen ugyanazt a módszert használják a mérésekhez