2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -1 2.5.33. ÖSSZES FEHÉRJE 01/2008:20533 javított 6.0 Az alábbi meghatározási módszerek között több olyan található, amely kereskedelemből beszerezhető reagenskészletekkel (kit) is kivitelezhető. 1. MÓDSZER Oldatban a fehérjék a felépítésükben résztvevő aromás aminosavaknak (főként a tirozinnak és a triptofánnak) köszönhetően abszorbeálják a 280 nm-es ultraibolya fényt. Ez a tulajdonság felhasználható tartalmi meghatározás céljára. Amennyiben a fehérje oldására használt tompítóoldat abszorbanciája a vízéhez képest nagy, ez arra utal, hogy a tompítóoldat zavaró anyagot tartalmaz. A zavarás megszüntethető, ha a tompítóoldatot alkalmazzuk kompenzáló folyadékként. Ha azonban a zavaró anyag nagy abszorbanciával rendelkezik, az eredmények bizonytalanok lehetnek. Kis koncentrációk esetében még a küvetta falán adszorbeálódó fehérje is lényegesen csökkentheti az oldat koncentrációját. Ez elkerülhető, ha nagyobb koncentrációjú mintákat vizsgálunk, vagy nemionos detergenst használunk a minta előkészítésekor. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag megfelelő mennyiségét az előírt tompítóoldatban oldjuk; az oldat fehérjetartalma milliliterenként 0,2-2 mg legyen. Összehasonlító oldat. A megfelelő referenciaanyagból a vizsgálandó anyag oldásához használt tompítóoldattal a vizsgálati oldatéval megegyező fehérjekoncentrációjú oldatot készítünk. Vizsgálat. A vizsgálat folyamán a vizsgálati oldatot, az összehasonlító oldatot és a kompenzáló folyadékot azonos hőmérsékleten tartjuk. A vizsgálati oldat és az összehasonlító oldat abszorbanciáját kvarcküvettákban mérjük, 280 nm-en (2.2.25); kompenzáló folyadékként az előírt tompítóoldatot alkalmazzuk. Ahhoz, hogy pontos eredményeket kapjunk, a meghatározandó fehérjekoncentrációk teljes tartományában a válasznak lineárisnak kell lennie. Fényszóródás. A vizsgálati mintán bekövetkező fényszóródás csökkentheti a fehérjemeghatározás pontosságát. Amennyiben az oldatban lévő fehérjerészecskék mérete összemérhető a mérési hullámhosszal (250-300 nm), a fénynyaláb szóródása a vizsgálati minta abszorbanciájának látszólagos növekedését eredményezi. A 280 nm-en fényszóródás következtében létrejött
2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -2 abszorbanciahányad kiszámításához a vizsgálati oldat abszorbanciáját 320, 325, 330, 335, 340, 345 és 350 nm-en is meghatározzuk; a leolvasott abszorbanciaértékek logaritmusait a hullámhossz logaritmusának függvényében ábrázoljuk, majd lineáris regressziót alkalmazva, meghatározzuk a felvett pontokhoz legjobban illeszkedő egyenest. Extrapolálással meghatározzuk a 280 nm-hez tartozó abszorbancia logaritmusát. Ennek az értéknek az antilogaritmusa egyenlő a fényszóródás által okozott abszorbanciával, amelyet a 280 nm-en leolvasott összes abszorbanciából levonva megkapjuk az oldott fehérje korrigált abszorbanciáját. A fényszóródás okozta abszorbanciát különösen abban az esetben, ha az oldat észrevehetően zavaros az oldat szűrésével (0,2 μm-es szűrőn, amely a fehérjéket nem adszorbeálja) vagy centrifugálással történő tisztításával csökkenthetjük. Az eredmények kiszámítása. A számításokhoz a korrigált értékeket használjuk. A vizsgálati oldat fehérjekoncentrációja (C U ): C U = C S (A U /A S ), Ahol C S az összehasonlító oldat fehérjekoncentrációja, A U és A S pedig a vizsgálati oldat, ill. az összehasonlító oldat korrigált abszorbanciaértékei. 2. MÓDSZER Ez a Lowry-meghatározás néven ismert módszer azon alapul, hogy a fehérjék redukálják a foszfor-molibdén-volfrámsav reagensben lévő foszfor-molibdénvolfrám-heteropolisav kromogént és ennek eredményeként 750 nm-en abszorpciós maximum jön létre. A foszfor-molibdén-volfrámsav reagens elsősorban a fehérje tirozinrészével reagál. Szobahőmérsékleten a szín 20-30 percen belül éri el maximumát, ezután fokozatosan halványul. Minthogy a meghatározást bizonyos anyagok zavarják, a fehérjéket kicsapással elkülöníthetjük. A zavaró anyagok többsége gyengíti, egyes detergensek viszont kissé erősítik a színeződést. Nagy sókoncentráció csapadékleválást idézhet elő. A különböző fehérjék különböző színintenzitással reagálhatnak, ezért a referenciaanyagnak és a vizsgálandó fehérjének azonosnak kell lenniük. Amennyiben a vizsgálati mintában lévő fehérjék mellől el kell távolítani a zavaró anyagokat, ezt az alábbiakban leírtak szerint, a vizsgálati oldat készítése előtt kell elvégezni. A zavaró anyagok hatása az oldat hígításával is csökkenthető, de csak addig, amíg a vizsgált fehérje koncentrációja még elegendő a pontos méréshez. Ehhez a módszerhez minden tompítóoldatot és reagenst R desztillált vízzel kell készíteni.
2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -3 Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag megfelelő mennyiségét az előírt tompítóoldatban oldjuk; az oldatot úgy készítjük, hogy koncentrációja a kalibrációs görbe tartományába essék. Olyan tompítóoldatot kell alkalmazni, amellyel 10,0-10,5 közötti ph-t biztosíthatunk. Összehasonlító oldatok. A meghatározandó fehérjének megfelelő referenciaanyagot az előírt tompítóoldatban oldjuk. Az oldat részleteit ugyanazon tompítóoldattal hígítva, legalább öt összehasonlító oldatot készítünk, melyeknek fehérjekoncentrációi egyenletesen oszlanak el egy megfelelő, 5 és 100 μg/ml közötti tartományban. Üres oldat. A vizsgálati oldat és az összehasonlító oldat készítésére használt tompítóoldat. Réz(II)-szulfát reagens. 100 mg R réz(ii)-szulfátot és 0,2 g R nátrium-tartarátot R desztillált vízzel 50 ml-re oldunk. 10 g R vízmentes nátrium-karbonátot R desztillált vízzel szintén 50 ml-re oldunk. A nátrium-karbonát oldatot lassan, kevergetés közben a réz(ii)-szulfát oldathoz öntjük. A reagens a készítést követő 24 órán belül használható fel. Lúgos réz(ii) reagens. A következő oldatokat elegyítjük: réz(ii)-szulfát reagens (1 térfogatrész), R nátrium-dodecil-szulfát 50 g/l töménységű oldata (2 térfogatrész) és R nátrium-hidroxid 32 g/l töménységű oldata (1 térfogatrész). A reagenst szobahőmérsékleten tároljuk és 2 héten belül felhasználjuk. Hígított foszfor-molibdén-volfrámsav reagens. 5 ml R foszfor-molibdénvolfrámsav reagenst 55 ml R desztillált vízzel hígítunk. Az oldatot barna üvegben, szobahőmérsékleten tároljuk. Vizsgálat. Az összehasonlító oldatok, a vizsgálati oldat és az üres oldat 1,0-1,0 mléhez 1,0-1,0 ml lúgos réz(ii) reagenst elegyítünk. 10 perc várakozás után valamennyi oldatot 0,5 ml hígított foszfor-molibdén-volfrámsav reagenssel elegyítjük, majd szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldatok abszorbanciáját 30 perc elteltével 750 nm-en mérjük (2.2.25). Kompenzáló folyadékként az üres oldattal készített oldatot használjuk. Számolás. A fehérjekoncentráció és az abszorbancia közti összefüggés nem lineáris; ha azonban a kalibrációs görbe felvételéhez készített oldatok koncentrációtartománya elég szűk, akkor a görbe megközelítőleg egyenes lesz. Az összehasonlító oldatok abszorbanciáját a fehérjekoncentráció függvényében ábrázoljuk, és lineáris regresszió alkalmazásával meghatározzuk a kalibrációs egyenest. A vizsgálati oldat abszorbanciájából a kalibrációs görbe alapján megállapítjuk a vizsgálati oldat fehérjekoncentrációját.
2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -4 Zavaró anyagok. A következő eljárás során dezoxikolát-triklórecetsavat adunk a vizsgálati mintához, hogy a fehérjéket a meghatározás előtt kicsapással elkülönítsük a zavaró anyagoktól; ezt a technikát híg oldatok fehérjekoncentrációjának növelésére is felhasználhatjuk. A vizsgálandó anyagot tartalmazó oldat 1 ml-éhez R nátrium-dezoxikolát 1,5 g/l töménységű oldatából 0,1 ml-t mérünk. Az oldatot vortex keverővel összekeverjük és szobahőmérsékleten 10 percig állni hagyjuk. Ezután R triklórecetsav 720 g/l töménységű oldatának 0,1 ml-ét mérjük hozzá, vortex keverővel összekeverjük, majd 3000 g-t alkalmazva, 30 percen át centrifugáljuk. A folyadékot dekantáljuk és az esetleg visszamaradó folyadékot pipettával leszívjuk. Az összetömörült fehérjét 1 ml lúgos réz(ii) reagensben oldjuk. 3. MÓDSZER Ez a Bradford-meghatározás néven ismert módszer azon alapul, hogy amikor a savkék 90 nevű festék fehérjéhez kötődik, az abszorpció 470 nm-ről 595 nm-re tolódik. A savkék 90 legkönnyebben a fehérje arginin- és lizin-részeihez kötődik, ebből következik, hogy a különböző fehérjék meghatározása során a válaszok eltérőek lehetnek. Ezért a referenciaanyagként használt fehérjének azonosnak kell lennie a vizsgálandó fehérjével. Ezt a meghatározást viszonylag kevés anyag zavarja, de detergensek és amfolitok lehetőleg ne legyenek jelen a vizsgálati mintában. Erősen lúgos minták a savas reagenssel zavaró kölcsönhatásba léphetnek. Ehhez a vizsgálathoz minden tompítóoldatot és reagenst R desztillált vízzel kell készíteni. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag megfelelő mennyiségét az előírt tompítóoldatban oldjuk; az oldatot úgy készítjük, hogy koncentrációja a kalibrációs görbe tartományába essék. Összehasonlító oldatok. A meghatározandó fehérjének megfelelő referenciaanyagot az előírt tompítóoldatban oldjuk. Az oldat részleteit ugyanazon tompítóoldattal hígítva legalább öt összehasonlító oldatot készítünk, melyeknek fehérjekoncentrációi egyenletesen oszlanak el egy megfelelő, 0,1-1 mg/ml közti tartományban. Üres oldat. Azt a tompítóoldatot használjuk, amellyel a vizsgálati oldatot és az összehasonlító oldatot készítettük. Savkék 90 reagens. 0,10 g R savkék 90-et 50 ml R alkoholban oldunk. Az oldatot 100 ml R tömény foszforsav hozzáadása után R desztillált vízzel 1000 ml-re
2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -5 hígítjuk. Az így nyert oldatot megszűrjük és barna üvegben, szobahőmérsékleten tároljuk. Az eltartás folyamán lassú festékkiválás figyelhető meg. Felhasználás előtt a reagenst meg kell szűrni. Vizsgálat. Az összehasonlító oldatok, a vizsgálati oldat és az üres oldat 0,100-0,100 ml-éhez 5-5 ml savkék 90 reagenst elegyítünk. Az elegyítést a kémcsövek megfordításával végezzük. A habzást kerülni kell, mivel ez rontaná a reprodukálhatóságot. Az összehasonlító oldatok és a vizsgálati oldat abszorbanciáját 595 nm-en mérjük (2.2.25). Kompenzáló folyadékként az üres oldattal készített oldatot használjuk. Ne használjunk kvarcküvettákat, mert a festék kötődik ezek anyagához. Számolás. A fehérje-koncentráció és az abszorbancia közti összefüggés nem lineáris; ha azonban a kalibrációs görbe felvételéhez készített oldatok koncentrációtartománya elég szűk, akkor a görbe megközelítően egyenes lesz. Az összehasonlító oldatok abszorbanciáját a fehérjekoncentráció függvényében ábrázoljuk, és lineáris regresszió alkalmazásával meghatározzuk a kalibrációs görbét. A vizsgálati oldat abszorbanciájából a kalibrációs görbe alapján megállapítjuk a vizsgálati oldat fehérjekoncentrációját. 4. MÓDSZER Ez a bicinchoninsavas vagy BCA-meghatározás néven ismert módszer azon alapul, hogy a fehérje a réz(ii)-iont réz(i)-ionná redukálja; a bicinchoninsav reagens a réz(i)-ion kimutatására szolgál. A reakciót kevés anyag zavarja. Ha zavaró anyagok vannak jelen, ezek befolyása az oldat hígításával is csökkenthető, de csak addig, amíg a vizsgált fehérje koncentrációja még elegendő a pontos méréshez. Egy másik lehetőség a zavaró anyagok eltávolítására a 2. módszer leírásában található fehérjekicsapásos eljárás. A különböző fehérjék különböző színintenzitással reagálhatnak, ezért a referenciaanyagnak és a vizsgálandó fehérjének azonosnak kell lenniük. Ehhez a vizsgálathoz minden tompítóoldatot és reagenst R desztillált vízzel kell készíteni. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag megfelelő mennyiségét az előírt tompítóoldatban oldjuk; az oldatot úgy készítjük, hogy koncentrációja az összehasonlító oldatok koncentrációtartományába essék. Összehasonlító oldatok. A meghatározandó fehérjének megfelelő referenciaanyagot az előírt tompítóoldatban oldjuk. Az oldat részleteit ugyanazon tompítóoldattal hígítva, legalább öt összehasonlító oldatot készítünk, melyeknek
2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -6 fehérjekoncentrációi egyenletesen oszlanak el egy megfelelő, 10-1200 μg/ml közti tartományban. Üres oldat. Azt a tompítóoldatot használjuk, amellyel a vizsgálati oldatot és az összehasonlító oldatot készítettük. BCA reagens. 10 g R dinátrium-bicinchoninátot, 20 g R nátrium-karbonátmonohidrátot, 1,6 g R nátrium-tartarátot, 4 g R nátrium-hidroxidot és 9,5 g R nátrium-hidrogén-karbonátot R desztillált vízben oldunk. Szükség esetén az oldat ph-ját R nátrium-hidroxid vagy R nátriumhidrogén-karbonát oldatával 11,25-ra állítjuk be, majd térfogatát R desztillált vízzel 1000 ml-re egészítjük ki. Réz(II)-BCA reagens. R réz(ii)-szulfát 40 g/l töménységű oldatának 1 ml-ét 50 ml BCA reagenssel elegyítjük. Vizsgálat. Az összehasonlító oldatok, a vizsgálati oldat és az üres oldat 0,1-0,1 mléhez 2-2 ml réz(ii)-bca reagenst elegyítünk. Az oldatokat 30 percen át 37 C-on inkubáljuk. Az időpontot feljegyezzük és az elegyeket hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletre. Az inkubálás befejezésétől számított 60 percen belül, 562 nmen, kvarcküvettákban mérjük az összehasonlító oldatok és a vizsgálati oldat abszorbanciáját (2.2.25). Kompenzáló folyadékként az üres oldattal készített oldatot használjuk. A szobahőmérsékletre lehűlt oldatok színintenzitása fokozatosan tovább nő. Számolás. A fehérje-koncentráció és az abszorbancia közti összefüggés nem lineáris; ha azonban a kalibrációs görbe felvételéhez készített oldatok koncentráció-tartománya elég szűk, akkor a görbe megközelítően egyenes lesz. Az összehasonlító oldatok abszorbanciáját a fehérje-koncentráció függvényében ábrázoljuk és lineáris regresszió alkalmazásával meghatározzuk a kalibrációs görbét. A vizsgálati oldat abszorbanciájából a kalibrációs görbe alapján megállapítjuk a vizsgálati oldat fehérje-koncentrációját. 5. MÓDSZER Ez a biuret-meghatározás néven ismert módszer azon alapul, hogy réz(ii)-ion lúgos közegben fehérjével reagál és ennek eredménye egy 545 nm-en kialakuló abszorbancia. Ez a vizsgálat igen kis különbséget mutat ekvivalens mennyiségű IgG- és albuminminták között. Ha a nátrium-hidroxidot és a biuret reagenst kombinált reagensként alkalmazzuk, és a nátrium-hidroxid hozzáadása után az elegyítés nem kielégítő, vagy túl hosszú idő telik el a nátrium-hidroxid oldat hozzáadása és a biuret reagens hozzáadása között, akkor az IgG-mintákra magasabb értékeket fogunk kapni, mint az albuminmintákra. A zavaró anyagok
2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -7 hatásának minimalizálására alkalmazott triklórecetsavas módszer is használható a fehérjetartalom meghatározása során, ha a vizsgálati minta koncentrációja kisebb, mint 500 μg/ml. Ehhez a vizsgálathoz minden tompítóoldatot és reagenst R desztillált vízzel kell készíteni. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag megfelelő mennyiségét R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatában oldjuk; az oldatot úgy készítjük, hogy koncentrációja az összehasonlító oldatok koncentrációtartományába essék. Összehasonlító oldatok. A meghatározandó fehérjének megfelelő referenciaanyagot R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatában oldjuk. Az oldat egy-egy részletét R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával hígítva legalább három összehasonlító oldatot készítünk, melyeknek fehérjekoncentrációi egyenletesen oszlanak el egy megfelelő, 0,5-10 mg/ml közti tartományban. Üres oldat. R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatát használjuk. Biuret reagens. 3,46 g R réz(ii)-szulfátot 10 ml forró R desztillált vízben oldunk. Az oldatot hagyjuk lehűlni (A-oldat). 34,6 g R trinátrium-citrátot és 20,0 g R vízmentes nátrium-karbonátot 80 ml forró R desztillált vízben oldunk és ezt az oldatot is hagyjuk lehűlni (B-oldat). Az A- és B-oldatot elegyítjük és az elegy térfogatát R desztillált vízzel 200 ml-re egészítjük ki. Az oldat 6 hónapig használható. Zavaros vagy üledékes reagens nem használható. Vizsgálat. 1 térfogatrész vizsgálati oldathoz R nátrium-hidroxid 60 g/l töménységű oldatának 1 térfogatrészét elegyítjük. Ehhez haladéktalanul és gyors elegyítéssel 0,4 térfogatrész biuret-reagenst adunk. Az elegyet 15-25 C-on legalább 15 percen át állni hagyjuk. A biuret-reagens hozzáadásától számított 90 percen belül, 545 nmen meghatározzuk a vizsgálati oldat és az összehasonlító oldatok abszorbanciáját (2.2.25). Kompenzációs folyadékként az üres oldatot használjuk. Olyan oldatok, amelyek zavarossá válnak, vagy amelyekben csapadék képződik, nem alkalmasak a fehérjekoncentráció meghatározására. Számolás. A fehérjekoncentráció és az abszorbancia közötti összefüggés csaknem lineáris az összehasonlító oldatok fehérjekoncentrációira megadott tartományban. Az összehasonlító oldatok abszorbanciáit a fehérjekoncentrációk függvényében ábrázoljuk és lineáris regresszió alkalmazásával megszerkesztjük a kalibrációs görbét. Kiszámoljuk a kalibrációs görbe korrelációs együtthatóját. A rendszer alkalmas, ha olyan egyenest kapunk, amelynek korrelációs együtthatója legalább 0,99. A vizsgálati oldat abszorbanciájából a kalibrációs görbe alapján meghatározzuk a vizsgálati oldat fehérjekoncentrációját.
2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -8 Zavaró anyagok. Annak érdekében, hogy a zavaró anyagok hatását a lehető legkisebbre csökkentsük, a vizsgálati minta fehérjetartalma az alábbi módon csapható ki. A vizsgálati minta oldatának 1 térfogatrészéhez R triklórecetsav 500 g/l töménységű oldatának 0,1 térfogatrészét adjuk. A felülúszót elöntjük és a csapadékot 0,5 M nátrium-hidroxid oldat kis mennyiségében feloldjuk. Az így nyert oldatból készítjük a vizsgálati oldatot. 6. MÓDSZER Ez a fluorimetriás módszer azon alapul, hogy o-ftálaldehiddel, amely a fehérje primer aminocsoportjaival (N-terminális aminosavakkal és a lizinrészek ε-aminocsoportjaival) reagál, származékot képezünk. A meghatározás érzékenysége növelhető, ha a fehérjét az o-ftálaldehid hozzáadása előtt hidrolizáljuk. A hidrolízis után a fehérjét alkotó aminosavak szabaddá vált α-amino-csoportjai is képesek lesznek reagálni az o-ftálaldehid reagenssel. A módszer igen kis mennyiségű fehérje meghatározására alkalmas. Primer aminok, mint pl. trometamol vagy aminosav-tartalmú tompítóoldatok, reagálnak a ftálaldehiddel, ezért használatukat kerülni kell, illetve adott esetben el kell távolítani őket. Az ammónia, ha nagy koncentrációban van jelen, szintén reagál a ftálaldehiddel. Az amin és a ftálaldehid reakciója eredményeképpen létrejövő fluoreszcencia nem minden esetben stabil. A módszer standardizálását célzó automatizált eljárások alkalmazása javíthatja a vizsgálat torzításmentességét, pontosságát. Ehhez a vizsgálathoz minden tompítóoldatot és reagenst R desztillált vízzel kell készíteni. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag megfelelő mennyiségét R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatában oldjuk; az oldatot úgy készítjük, hogy koncentrációja az összehasonlító oldatok koncentrációtartományába essék. Az oldat ph-ját a ftálaldehid reagens hozzáadása előtt 8-10,5-re állítjuk be. Összehasonlító oldatok. A meghatározandó fehérjének megfelelő referenciaanyagot R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatában oldjuk. Az oldat egy-egy részletét R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával hígítva legalább öt összehasonlító oldatot készítünk, melyeknek fehérjekoncentrációi egyenletesen oszlanak el egy megfelelő, 10-200 μg/ml közötti tartományban. Az oldatok ph-ját a ftálaldehid reagens hozzáadása előtt 8-10,5-re állítjuk be. Üres oldat. R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatát használjuk. Borát tompítóoldat. 61,83 g R bórsavat R desztillált vízben oldunk és az oldat phját R kálium-hidroxiddal 10,4-re állítjuk be. Végül az oldat térfogatát R desztillált vízzel 1000 ml-re egészítjük ki.
2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -9 Ftálaldehid törzsoldat. 1,20 g R ftálaldehidet 1,5 ml R metanolban oldunk. Az oldatot 100 ml borát-tompítóoldattal, majd R makrogol-23-lauriléter 300 g/l töménységű oldatának 0,6 ml-ével elegyítjük. A szobahőmérsékleten tárolt törzsoldat 3 hétig használható. Ftálaldehid reagens. 5 ml ftálaldehid törzsoldathoz 15 μl R 2-merkaptoetanolt elegyítünk. A reagenst felhasználás előtt legalább 30 perccel el kell készíteni és 24 órán belül fel kell használni. Vizsgálat. Az összehasonlító oldatok és a vizsgálati oldat 10-10 μl-éhez 0,1-0,1 ml ftálaldehid reagenst elegyítünk. Az oldatokat 15 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd mindegyikhez 3 ml 0,5 M nátrium-hidroxid oldatot elegyítünk. Ezután meghatározzuk az összehasonlító oldatok és a vizsgálati oldat fluoreszcenciáját (2.2.21); gerjesztési hullámhossz 340 nm, emissziós hullámhossz 440-455 nm között. Adott minta fluoreszcenciáját csak egy ízben mérjük, mivel a besugárzás hatására csökken a fluoreszcencia intenzitása. Számolás. A fehérjekoncentráció és a fluoreszcencia közötti összefüggés lineáris. Az összehasonlító oldatok fluoreszcencia-intenzitását a fehérjekoncentráció függvényében ábrázoljuk és lineáris regresszió alkalmazásával meghatározzuk a kalibrációs görbét. A vizsgálati oldat fluoreszcencia-intenzitásából a kalibrációs görbe alapján meghatározzuk a vizsgálati oldat fehérjekoncentrációját. 7. MÓDSZER Ez a módszer a nitrogénanalízisen alapuló fehérjemeghatározási módszer. Egyéb nitrogéntartalmú vegyületek jelenléte zavarhatja a meghatározást. A nitrogénanalízisen alapuló módszerek hátránya, hogy a vizsgálati mintát el kell roncsolni, előnye viszont, hogy a meghatározáshoz nem szükséges a fehérjét vízben feloldani. A-eljárás. Vagy a 2.5.9 fejezetben előírt, kénsavas roncsolással járó nitrogénmeghatározás szerint járunk el, vagy a Kjeldahl-féle nitrogénmeghatározásra szolgáló, kereskedelemből beszerezhető készüléket használjuk. B-eljárás. A nitrogénanalízist kereskedelmi forgalomban kapható készülékkel végezzük. A legtöbb nitrogénanalizátor hőbontást alkalmaz (vagyis a mintát oxigénben égeti el, csaknem 1000 C-os hőmérsékleten), amelynek folyamán a vizsgálandó anyag nitrogénjéből nitrogén-monoxid (NO) és egyéb nitrogén-oxidok (NO x ) keletkeznek. Vannak olyan készülékek, amelyek a nitrogén-oxidokat
2.5.33. Összes fehérje Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6. 2.5.33. -10 nitrogéngázzá alakítják, amelyet azután hővezetőképességi detektorral határozhatunk meg. Más készülékek a nitrogén-oxid (NO) és ózon (O 3 ) keverékéből gerjesztett nitrogén-dioxidot (NO 2 *) állítanak elő, amely bomlás közben fényt bocsát ki és ennek mennyisége kemilumineszcenciás detektorral mérhető. Az injektálás és a hőbontás paramétereinek optimalizálására, valamint az analízis megbízhatóságának értékelésére olyan referenciaanyagot használunk, amely viszonylag tiszta és összetétele hasonló a vizsgált fehérje összetételéhez. Számolás. A fehérjekoncentráció kiszámolásához a minta nitrogéntartalmát osztjuk a fehérje ismert nitrogéntartalmával. A fehérje ismert nitrogéntartalmát vagy a fehérje kémiai összetételéből, vagy megfelelő referenciaanyaggal történő összehasonlítás alapján határozzuk meg.