ANTIBIOTIKUMOK MIKROBIOLÓGIAI ÉRTÉKMÉRÉSE

Átírás

1 01/2009: ANTIBIOTIKUMOK MIKROBIOLÓGIAI ÉRTÉKMÉRÉSE Az antibiotikumok hatóértékét úgy állapítjuk meg, hogy összehasonlítjuk a vizsgálandó antibiotikum és a referenciaanyag ismert koncentrációinak az antibiotikumra érzékeny mikroorganizmusok szaporodására kifejtett gátló hatását. Az értékmérésekben alkalmazott referenciaanyagok olyan anyagok, amelyeknek aktivitását a megfelelő nemzetközi standardhoz vagy nemzetközi referenciakészítményhez viszonyítva pontosan meghatározták. Az értékmérést úgy kell megtervezni, hogy a hatóérték kiszámításának alapját képező matematikai modell érvényességét (validitását) ellenőrizhessük. Ha a párhuzamos egyenesek módszerét választjuk, akkor a vizsgálandó készítményre és a referenciaanyagra kapott log dózis-válasz (vagy transzformált válasz) görbéknek a számolás alapjául szolgáló koncentrációtartományban lineárisnak valamint egymással párhuzamosnak kell lenniük. Ezen feltételek teljesülését adott valószínűségi szinten (rendszerint P= 0,05) végzett validitási próbákkal igazolni kell. Más matematikai modell, pl. az iránytangens-hányados módszer is alkalmazható, ha annak érvényessége bizonyított. Ha a vonatkozó cikkelyben nincs más előírás, az értékmérés során kapott megbízhatósági határok (P = 0,95) a becsült hatóérték %-án belül legyenek. A vizsgálatot az A vagy a B módszerrel végezzük. A. DIFFÚZIÓS MÓDSZER A meghatározáshoz alkalmas táptalajt felolvasztjuk, és megfelelő en, vegetatív alakok esetében pl C-on, beoltjuk a vizsgálandó antibiotikumra érzékeny mikroorganizmus szuszpenziójának ismert mennyiségével, úgy, hogy a meghatározáshoz használt antibiotikum-koncentrációk hatására megfelelő átmérőjű, egyértelműen mérhető gátlási zónák alakuljanak ki. A beoltott táptalajból a szükséges mennyiséget azonnal Petri-csészékbe vagy nagyméretű négyszögletes edényekbe öntjük, oly módon, hogy 2 5 mm-es, egyenletes vastagságú réteg keletkezzék. Kétrétegű táptalajjal is dolgozhatunk, ez esetben csak a felső réteget oltjuk be. A csészéket illetve edényeket ezután úgy tároljuk, hogy felhasználás előtt a mikroorganizmusok ne szaporodjanak, de ne is pusztuljanak észrevehető mértékben, és amikor a felhasználásra sor kerül, a táptalaj felülete száraz legyen. A táblázatban megadott oldószer és tompítóoldat felhasználásával a referenciaanyagból és a vizsgálandó táblázat Diffúziós módszer Antibiotikum Referenciaanyag A törzsoldat készítéséhez használt oldószer Táptalaj és végső ph Amfotericin B CRS amfotericin B R dimetil -szulfoxid ph 10,5 (0,2 M) Bacitracin-cink CRS bacitracin-cink 0,01 M sósav ph 7,0 (0,05 M) Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 IP Micrococcus luteus NCTC 7743 CIP ATCC F ph 6, C A ph 7, C Bleomicin-szulfát CRS bleomicin- szulfát R víz ph 6,8 (0,1 M) Mycobacterium smegmatis ATCC 607 G ph 7, C 1

2 táblázat Diffúziós módszer (folytatás, 1) Antibiotikum Referenciaanyag A törzsoldat készítéséhez használt oldószer Táptalaj és végső ph Framicetinszulfát Gentamicinszulfát CRS framicetinszulfát CRS gentamicinszulfát Jozamicin CRS jozamicin R metanol (l. a cikkelyt) Jozamicinpropionát Kanamicinmonoszulfát Savanyú kanamicinszulfát CRS jozamicinpropionát Kolisztimetátnátrium CRS kanamicin monoszulfát CRS kolisztimetátnátrium R víz ph 8,0 (0,05 M) Bacillus subtilis Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP R víz ph 8,0 (0,05 M) Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP epidermidis NCIB 8853 CIP ATCC R metanol (l. a cikkelyt) ph 5,6 ph 5,6 Bacillus subtilis 0 Bacillus subtilis NCTC10400 R víz ph 8,0 (0,05 M) Bacillus subtilis R víz ph 6,0 (0,05M) Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP ATCC 4617 Escherichia coli NCIB 8879 CIP ATCC Neomicin-szulfát CRS neomicin-szulfát R víz ph 8,0 (0,05 M) Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP Bacillus subtilis Netilmicin-szulfát CRS netilmicinszulfát Nisztatin CRS nisztatin R dimetilformamid R víz ph 8,0 ± 0,1 ATCC 6538P ph 6,0 (0,05 M); 5 %V/V R dimetilformamidot is tartalmaz Candida tropicalis CIP NCYC 1393 Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 CIP ATCC 9763 E ph 7,9 E ph 7,9 A ph 7, C A ph 7, C A ph 6, C A ph 6, C A ph 7,9 A ph 7, C E ph 7, C E ph 7, C A ph 7, C F ph 6,0 F ph 6, C

3 táblázat Diffúziós módszer (folytatás, 2) Antibiotikum Referenciaanyag A törzsoldat készítéséhez használt oldószer Táptalaj és végső ph Rifamicinnátrium CRS rifamicinnátrium R metanol ph 7,0 (0,05 M) Micrococcus luteus NCTC 8340 CIP ATCC 9341 A ph 6, C Spiramicin CRS spiramicin R metanol ph 8,0 (0,05 M) Bacillus subtilis A ph 7, C Sztreptomicinszulfát CRS sztreptomicinszulfát R víz ph 8,0 (0,05 M) Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 Bacillus subtilis A ph 7,9 A ph 7,9 Teikoplanin CRS teikoplaninum ph 6,0 (0,05M) ph 6,0 (0,05M) Bacillus subtilis CIP 5262 ATCC 9341 H-pH 7,8-8, C Tilozin állatgyógyászati célra CRS tilozin R metanol R 0,1 M foszfát tompítóoldattal (ph7,0) készült 2,5 %V/V-os oldata 40 térfogatrész R metanol és 60 térfogatrész R 0,1 M foszfát-tompítóoldat (ph 8,0) elegye Micrococcus luteus NCTC 8340 CIP ATCC 9341 A ph 8, C Tilozin-tartarát állatgyógyászati célra Vankomicinhidroklorid CRS vankomicinhidroklorid R víz ph 8,0 Bacillus subtilis NCTC 8236 A ph 8, C antibiotikumból azonos hatáserősségűnek feltételezett, ismert koncentrációjú oldatokat készítünk. Ezeket az oldatokat a táptalaj felületén elhelyezett, pl. porcelánból, rozsdamentes acélból vagy más alkalmas anyagból készült steril hengerekbe, vagy az agarban kialakított lyukakba visszük. Minden hengerbe vagy lyukba azonos térfogatú oldatot mérünk be. Úgy is eljárhatunk, hogy megfelelő minőségű, steril szűrőpapírkorongokat használunk; a korongokat átitatjuk a referenciaanyag, illetve a vizsgálandó antibiotikum oldatával és az agar felületére helyezzük. Annak érdekében, hogy az értékmérés érvényességét (validitását) ellenőrizhessük, a referenciaanyagból legalább három különböző mennyiséget kell vizsgálnunk, a vizsgálandó antibiotikumból pedig három akkora mennyiséget, melyeknek hatáserőssége feltehetőleg a referenciaanyag-mennyiségek hatáserősségével azonos. Célszerű a koncentrációsorozatokat mértani sor szerint készíteni. Rutinvizsgálatok esetében, ha a rendszer linearitása megfelelő számú, háromdózisos értékméréssel bizonyított, kétdózisos vizsgálat is elegendő lehet, feltéve, hogy az illetékes hatóság ehhez hozzájárul. Vitás esetekben azonban mindig a fent leírt, háromdózisos értékmeghatározást kell alkalmazni. A nagyobb Petri-csészékbe vagy a négyszögletes edényekbe a statisztikai szempontoknak megfelelően rendezzük el az oldatokat, a kisméretű Petri-csészék esetében viszont amelyekbe csak hat-hat oldat mérhető be arra kell ügyelni, hogy a vizsgálandó antibiotikum és a referenciaanyag oldatai úgy váltakozzanak, hogy a töményebb oldatok egymást zavaró hatása ne érvényesülhessen. Kb. 18 órán át megfelelő en inkubálunk. Annak érdekében, hogy az oldatok bemérése közötti időeltolódás kihatását a lehető legkisebbre csökkentsük, és hogy a regressziós egyenesek meredekségét növeljük, ajánlatos az inkubálást megelőzően időt hagyni a diffúzióra, ami az adott esettől függően szobaen vagy 4 C körül rendszerint 1 4 óra. A kör alakú gátlási zónák átmérőit legalább 0,1 mm pontossággal lemérjük, vagy területüket megfelelő pontossággal megállapítjuk, és a szokásos statisztikai módszerekkel kiszámítjuk a hatóértéket. Az egyes meghatározások folyamán annyi párhuzamos mérést végzünk egy-egy mennyiséggel, amennyi a megkövetelt pontosság biztosításához elegendő. A megkövetelt pontosság elérése érdekében és annak megállapítására, hogy a vizsgált antibiotikum hatóértéke eléri-e a megkövetelt minimális értéket, a meghatározást megismételhetjük, és a mérések eredményeit statisztikai 3

4 módszerekkel egyesíthetjük.

5 B. TURBIDIMETRIÁS MÓDSZER A megfelelő táptalajt oly módon oltjuk be a vizsgálandó antibiotikumra érzékeny mikroorganizmus szuszpenziójával, hogy a vizsgálati körülmények között a mikroorganizmusok növekedésére kifejtett gátló hatás elegendően nagy legyen. A kiválasztott szuszpenzióból akkora ismert mennyiséget használunk, hogy a kb. 4 órás inkubálás után mutatkozó zavarosság jól mérhető legyen. A beoltott táptalajt elkészítése után azonnal felhasználjuk. A táblázatban megadott oldószerrel és tompítóoldattal a referenciaanyagból és a vizsgálandó antibiotikumból olyan ismert koncentrációjú oldatokat készítünk, amelyeknek hatáserőssége feltehetőleg azonos. A meghatározás érvényességének igazolására a referenciaanyagból legalább három különböző mennyiséget mérünk be; a vizsgálandó antibiotikumból szintén három különböző mennyiséget veszünk, amelyek hatáserőssége feltehetőleg azonos a referenciaanyag-mennyiségek hatáserősségével. A mennyiségeket mértani sor szerint célszerű megválasztani. A kívánt linearitás elérése érdekében szükség esetén nagy-számú koncentráció közül táblázat Turbidimetriás módszer Antibiotikum Referenciaanyag A törzsoldat készítéséhez használt oldószer Táptalaj és végső ph Framicetinszulfát CRS framicetinszulfát R víz ph 8,0 Gentamicinszulfát CRS gentamicinszulfát R víz ph 7,0 Gramicidin CRS gramicidin R metanol ph 7,0* Enterococcus hirae CIP ATCC * Szükség esetén detergenst, pl. 0,1 mg/ml R poliszorbát 80-at kell a tompítóoldathoz adni, hogy a hígítások folyamán elkerüljük az adszorpciót az anyagon. Jozamicin CRS jozamicin R metanol (l. a cikkelyeket) ph 5,6 C-pH 8, C

6 táblázat Turbidimetriás módszer (folytatás, 2) Antibiotikum Referenciaanyag A törzsoldat készítéséhez használt oldószer Táptalaj és végső ph Jozamicinpropionát CRS jozamicinpropionát R metanol (l. a cikkelyeket) ph 5,6 C- ph 8, C Kanamicinmonoszulfát Savanyú kanamicin-szulfát CRS kanamicinmonoszulfát R víz ph 8,0 Kolisztimetátnátrium CRS kolisztimetátnátrium R víz ph 7,0 Escherichia coli NCIB 8666 CIP 2.83 ATCC 9637 Neomicin-szulfát CRS mikrobiológiai értékmérésre szánt neomicin-szulfát R víz ph 8,0 Rifamicin-nátrium CRS rifamicinnátrium R metanol ph 7,0 Escherichia coli NCIB 8879 CIP ATCC Spiramicin CRS spiramicin R metanol ph 7,0 Sztreptomicinszulfát Tilozin állatgyógyászati célra Tilozin-tartarát állatgyógyászati célra CRS sztreptomicinszulfát CRS tilozin R víz ph 8,0 Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP ATCC R metanol R 0,1 M foszfát tompítóoldattal (ph 7,0) készült 2,5 %V/V-os oldata ph 7,0 NCTC 6571 ATCC 9144 CIP Tirotricin CRS gramicidin R alkohol R alkohol Enterococcus hirae ATCC C ph 7,0 37 C C ph 7,0 37 C Vankomicinhidroklorid CRS vankomicinhidroklorid R víz ph 8,0 C ph 7, C kell három egymást követőt úgy kiválasztani, hogy a referenciaanyag és a vizsgált antibiotikum mennyiségei megfeleljenek egymásnak. Egyforma kémcsövekbe mindegyik oldatból azonos térfogatot mérünk, majd mindegyik kémcsőbe azonos térfogatú mennyiséget adagolunk a beoltott táptalajból (például 1 ml oldathoz 9 ml táptalajt). A tirotricin értékmérésénél 9,9 ml beoltott táptalajhoz 0,1 ml oldatot mérünk. Kontrollként egyidejűleg két kémcsövet készítünk elő a beoltott táptalajjal, de antibiotikum nélkül, és az egyikhez azonnal 0,5 ml R formaldehid oldatot keverünk. Ezeket a kémcsöveket használjuk a zavarosság meghatározására szolgáló optikai eszköz beállítására. A kémcsöveket randomizált, latin négyzetes vagy randomizált blokk elrendezés szerint vízfürdőbe vagy más olyan készülékbe helyezzük, amely alkalmas arra, hogy az összes kémcsövet egyidejűleg és gyorsan a megfelelő inkubálási re melegítse, majd 3-4 órán át ezen a en tartsa. Ügyeljünk arra, hogy a és az inkubálási időtartam mindegyik kémcső esetében azonos legyen. Inkubálás után mindegyik kémcső tartalmához 0,5 ml R formaldehid oldatot elegyítünk vagy hőkezelést alkalmazunk a mikroorganizmusok növekedésének leállítása céljából, majd alkalmas optikai eszköz segítségével három értékes 5

7 jegy pontossággal meghatározzuk az opacitást. Olyan mérőmódszert is alkalmazhatunk, amely lehetővé teszi, hogy a zavarosságot mindegyik kémcsőben pontosan azonos inkubációs időtartam után mérjük. Megfelelő statisztikai módszerekkel kiszámítjuk a hatóértéket. A dózis válasz összefüggés akár transzformáljuk, akár nem gyakran csak nagyon szűk tartományban lineáris. Ezt a tartományt kell a hatóérték kiszámításához felhasználni. A tartománynak legalább három, egymást követő koncentrációt kell tartalmaznia, hogy a vizsgálat alkalmas legyen a linearitás igazolására. Rutinvizsgálatok esetén, ha a rendszer linearitása megfelelő számú, háromdózisos értékméréssel bizonyított, kétdózisos vizsgálat is elegendő lehet, feltéve, hogy az illetékes hatóság ehhez hozzájárul. Vitás esetekben azonban mindig háromdózisos meghatározást kell alkalmazni. Az egyes meghatározások során dózisonként annyi párhuzamos mérést végzünk, amennyi a szükséges pontosság eléréséhez elegendő. Annak érdekében, hogy a kívánt pontosságot elérjük, és megállapítsuk, hogy a vizsgált antibiotikum hatóértéke eléri-e az előírt alsó határértéket, a meghatározást megismételhetjük, és a mérések eredményét statisztikai módszerekkel egyesíthetjük. A fejezet következő részei tájékoztató jellegűek. AJÁNLOTT MIKROORGANIZMUSOK A következőkben ismertetjük az ajánlott mikroorganizmusokat és azok felhasználásának körülményeit. Ezeken kívül más, a vizsgálandó antibiotikumra bizonyítottan érzékeny mikroorganizmusokat is felhasználhatunk, ha biztosítjuk a megfelelő táptalajt, valamint a megfelelő et és ph-t. A felhasznált oldatok koncentrációját úgy kell megválasztani, hogy a vizsgálati körülmények között a dózis logaritmusa és a biológiai válasz közti összefüggés lineáris legyen. Inokulumok készítése. Bacillus cereus var. mycoides; Bacillus subtilis; Bacillus pumilus. Az inokulumként használandó mikroorganizmusok spóraszuszpenzióját az alábbiak szerint készítjük. A mikroorganizmust C-on, 7 napon át tenyésztjük alkalmas táptalaj felszínén; a táptalajhoz előzetesen literenként 0,001 g R mangán(ii) -szulfátot adunk. A tenyészetet, amely főként spórákból áll, steril R vízzel lemossuk. A szuszpenziót 30 percig 70 C-on melegítjük, majd úgy hígítjuk, hogy a spórakoncentráció megfelelő általában milliliterenként és közötti érték legyen. A spóraszuszpenziók 4 C-ot meg nem haladó en hosszú ideig eltarthatók. Spóraszuszpenziót úgy is készíthetünk, hogy a mikroorganizmusokat a C-táptalajon, 26 C-on, 4 6 napon át tenyésztjük, majd aszeptikus körülmények között literenként 0,001 g R mangán(ii) -szulfátot adunk a táptalajhoz, és további 48 órán át folytatjuk az inkubálást. A szuszpenziót hogy a megfelelő mennyiségű spóra (kb. 80%) képződéséről meggyőződjünk mikroszkóposan megvizsgáljuk, majd centrifugáljuk. Az üledéket annyi steril R vízben szuszpendáljuk, hogy a spórakoncentráció milliliterenként és között legyen, majd a szuszpenziót 30 percig 70 C-on melegítjük, és 4 C-ot meg nem haladó en tároljuk. Bordetella bronchiseptica. A teszt-mikroorganizmust a B-táptalajon, C-on, órán át tenyésztjük. A baktériumtenyészetet steril R vízzel lemossuk és olyan mértékben hígítjuk, hogy a szuszpenzió opacitása megfelelő legyen. ; Klebsiella pneumoniae; Escherichia coli; Micrococcus flavus; epidermidis. A B. bronchiseptica tenyésztésére előírtak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az A-táptalajt használjuk, és az opacitást úgy állítjuk be, hogy turbidimetriás meghatározás esetében kielégítő dózis válasz összefüggést kapjunk, a diffúziós módszer esetében pedig úgy, hogy megfelelő átmérőjű, jól körülhatárolt gátlási zónákat kapjunk. Saccharomyces cerevisiae; Candida tropicalis. A tesztmikroorganizmusokat F táptalajon, C-on, 24 órán át tenyésztjük. A tenyészetet R nátrium-klorid 9 g/l töménységű, steril oldatával lemossuk, és a kellő opacitás elérése érdekében ugyanilyen oldattal hígítjuk. ok. Az 5,8 és 8,0 közötti ph-értékű tompítóoldatokat úgy készítjük, hogy 50,0 ml R 0,2 M káliumdihidrogén-foszfát oldatot a táblázatban megadott mennyiségű 0,2 M nátrium-hidroxid oldattal elegyítünk. Az oldatokat frissen készített R desztillált vízzel 200,0 ml-re hígítjuk. ph táblázat 0,2 M nátrium-hidroxid oldat (ml) 5,8 3,72 6,0 5,70 6,2 8,60 6,4 12,60 6,6 17,80 6,8 23,65 7,0 29,63 7,2 35,00 7,4 39,50 7,6 42,80 7,8 45,20 8,0 46,80 A táblázatban felsorolt valamennyi mikrobiológiai értékméréshez, a bleomicin-szulfát és az amfotericin B kivételével, ezeket a tompítóoldatokat használjuk. A bleomicin-szulfáthoz a tompítóoldatot (ph 6,8) úgy készítjük, hogy 6,4 g R kálium-dihidrogén-foszfátot és 18,9 g R dinátrium-hidrogén-foszfátot R vízzel 1000 ml-re oldunk. Az amfotericin B-hez a következő módon készítjük a 0,2 M foszfát-tompítóoldatot (ph 10,5): 35 g R dikáliumhidrogén-foszfátot 900 ml R vízben oldunk, az oldathoz 20 ml 1 M nátrium-hidroxid mérőoldatot elegyítünk, és az így nyert oldat térfogatát R vízzel 1000 ml-re kiegészítjük.

8 Táptalajok. Az alábbiakban megadott vagy velük egyenértékű táptalajok használhatók. A dinátrium-hidrogén-foszfátot steril oldat formájában adjuk az előzetesen sterilezett táptalajhoz. A-táptalaj F-táptalaj Pepton 6 g pepton 9,4 g kazein-pepton (pankreász-hidrolizátum) 4 g élesztő-kivonat 4,7 g marhahús-kivonat 1,5 g marhahús-kivonat 2,4 g élesztő-kivonat 3 g nátrium-klorid 10,0 g glükóz-monohidrát 1 g glükóz-monohidrát 10,0 g Agar 15 g agar 23,5 g Víz ad 1000 ml víz ad 1000 ml B-táptalaj G-táptalaj kazein-pepton (pankreász-hidrolizátum) 17 g glicerin 10 g szójapepton (papain-hidrolizátum) 3 g pepton 10 g nátrium-klorid 5 g hús-kivonat 10 g dikálium-hidrogén-foszfát 2,5 g nátrium-klorid 3g glükóz-monohidrát 2,5 g agar 15g Agar 15 g víz ad 1000 ml poliszorbát g Víz ad 1000 ml A táptalaj ph-ja sterilezés után 7,0 ± 0,1 legyen. A poliszorbát 80-at a többi alkotórész felforralt, még forró oldatához adjuk, közvetlenül az adott térfogatra történő hígítást megelőzően. C-táptalaj Pepton marhahús-kivonat élesztő-kivonat nátrium-klorid glükóz-monohidrát dikálium-hidrogén-foszfát kálium-dihidrogén-foszfát víz 6g 1,5 g 3g 3,5 g 1 g 3,68 g 1,32 g ad 1000 ml H-táptalaj Pepton 5,0 g agar 15,0g marhahús-kivonatpor 3,0 g víz ad 1000 ml A táptalaj ph-ja, 0,1 M nátrium-hidroxid oldattal beállítva, 7,0-8,0 legyen. D-táptalaj szív-kivonat élesztő-kivonat kazein-pepton glükóz-monohidrát nátrium-klorid dikálium-hidrogén-foszfát kálium-dihidrogén-foszfát kálium-nitrát víz 1,5 g 1,5 g 5g 1 g 3,5 g 3,68 g 1,32 g 2g ad 1000 ml E-táptalaj pepton hús-kivonat dinátrium-hidrogén-foszfát 12 H 2 O agar víz 5g 3 g 26,9 g 10 g ad 1000 ml