A HAEMOCHROMATOSIS ÉS A HAEMOPHILIA A MOLEKULÁRIS GENETIKAI DIAGNOSZTIKÁJA

A HAEMOCHROMATOSIS ÉS A HAEMOPHILIA A MOLEKULÁRIS GENETIKAI DIAGNOSZTIKÁJA Ph.D. értekezés dr. Andrikovics Hajnalka Témavezetők: Dr. Tordai Attila és dr. Sarkadi Balázs Országos Gyógyintézeti Központ, Haematológiai és Immunológiai Intézet, Budapest, 2003 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Szigorlati bizottság: Dr. Fekete György, Dr. Sasvári Mária és Dr. Béres Judit Hivatalos bírálók: Dr. Marcsek Zoltán, Dr. Somogyi Anikó és Dr. Vásáhelyi Barna

TARTALOMJEGYZÉK 1. Bevezetés 3 1.1. A molekuláris genetikai vizsgálatok alkalmazása az öröklődő betegségek diagnosztikájában _ 3 1.2. Öröklődő haemochromatosis - irodalmi háttér 6 1.3. Haemophilia A - irodalmi háttér 18 2. Célkitűzések 34 2.1. Öröklődő haemochromatosis 34 2.2. Haemophilia A 34 3. Módszerek 36 3.1. Vizsgált egyének 36 3.2. DNS izolálás 37 3.3. PCR technikán alapuló molekuláris genetikai módszerek 38 3.4. Southern blot analízis 43 3.5. A vasanyagcsere klinikai paramétereinek mérése 44 3.6. Statisztikai feldolgozás 44 4. Eredmények és megbeszélés 46 4.1. Az öröklődő haemochromatosis molekuláris genetikai vizsgálata 46 4.2. A haemophilia A molekuláris genetikai vizsgálata 63 5. Következtetések 87 5.1. Öröklődő haemochromatosis 87 5.2. Haemophilia A 88 6. Összefoglalás 89 7. Angol nyelvű összefoglalás 90 8. Köszönetnyilvánítás 91 9. Saját közlemények jegyzéke 92 10. Irodalomjegyzék 94 2

Bevezetés 1. Bevezetés 1.1. A molekuláris genetikai vizsgálatok alkalmazása az öröklődő betegségek diagnosztikájában A molekuláris genetika az orvostudomány, ezen belül a laboratóriumi diagnosztika egyre gyorsabban fejlődő területe, amely segítséget nyújthat a diagnózis felállításában, annak pontosításában, a genotípus-fenotípus összefüggések vizsgálatában, egyes örökletes rizikófaktorok azonosításában, valamint a súlyos, monogénes öröklésmenetű betegségek esetében a prenatális és a hordozó (carrier) diagnosztikában. Jelenleg több mint 10 000 olyan betegséget (vagy tulajdonságot) ismerünk, amelyek monogénesen, azaz a Mendel-i szabályok szerint öröklődnek (1). Az említett csoportból eddig azonban csak mintegy 1000 kórkép génjét azonosították. A betegség-gén azonosítása során a 3 gigabázisnyi humán genom mintegy harminc-harmincötezer génje közül kell azt az egyet megtalálni, amelynek hibája (eltérése) a kérdéses öröklődő betegség oka (2, 3). A monogénesen öröklődő betegségek génjeinek azonosítása két különböző módszerrel, a funkcionális illetve a pozicionális klónozással valósítható meg. A funkcionális klónozás akkor alkalmazható, ha a betegség tünetei utalnak a betegség kialakulásáért felelős, hibás fehérje élettani funkciójára és ez alapján a fehérje azonosítható. A fehérje aminosav sorrendjének ismeretében meghatározható a gén nukleotid sorrendje és helye megkereshető a megfelelő kromoszómán. A funkcionális klónozásnak köszönhető például a haemophilia A-ért felelős VIII. véralvadási faktor génjének az azonosítása. A pozicionális klónozás elve a funkcionális klónozás gondolat menetének az ellentéte: először a betegség génjének a kromoszómális elhelyezkedését azonosítják. Ha sikerült a gént 1-2 megabázisnyi szakaszon belülre lokalizálni, a következő feladat valamennyi, ezen a területen elhelyezkedő gén azonosítása. Az a gén a keresett betegség génje, amelyről sikerül kimutatni, hogy az egészségesekben és a betegekben különböző formában fordul elő, tehát a betegség megjelenése és az adott gén mutációi között egyértelmű ok-okozati összefüggés áll fenn. A gén nukleotid sorrendjének meghatározása után következik a kódolt fehérje funkciójának megismerése. Pozicionális klónozással azonosították az öröklődő haemochromatosis génjét, amelynek 3

Bevezetés kromoszómális elhelyezkedésének azonosításában a HLA antigénekkel való kapcsolt öröklődésének a felismerése nyújtott segítséget. Egy adott gén nukleotid sorrendjének és mutációinak ismerete a molekuláris genetikai diagnosztika alap feltétele. A genetikai vizsgálatok segítséget nyújthatnak a diagnózis felállításában olyan esetekben, ahol a klinikai tünetek és az egyéb laborvizsgálatok nem utalnak egyértelműen az adott örökletes betegségre (pl. szerzett formák elkülönítése). Külön kiemelhető a preszimptomatikus, azaz még a klinikai tünetek előtt végzett diagnosztika is. A DNS-diagnosztika célja az is lehet, hogy a mutáció és a betegség lefolyása között összefüggéseket keressen. Egyes esetekben különböző mutációk azonosítása lehetőséget adnak arra, hogy optimális terápiát ill. életmódot lehessen kialakítani. Ez főként a kevésbé súlyos, (azonban legtöbbször gyakori) kórképek diagnosztikájában és megelőzésében játszik szerepet. Példaként említhető az V. véralvadási faktor Leiden mutációja (c.1691g>a; p.506r>q), amelynek heterozigóta gyakorisága a kaukázusi populációkban mintegy 1-15%. Heterozigóta formában három-nyolcszorosára, homozigóta formában ötvenszázszorosára növeli a mélyvénás trombózis kockázatát (4). Mutáció hordozóknál a trombózisra hajlamosító kockázati tényezők (így pl. orális fogamzásgátló tabletta, tartós immobilizáció) kerülése javasolt. Hasonló példa lehet a metilén-tetrahidrofolát-reduktáz termolabilis variánsa (c.677c>t; p.222a>v). Homozigóta formája (a populáció mintegy 15%-a) hiper-homociszteinémiára, így arterioszklerózisra, terhesség esetén a magzatnál velőcső záródási rendellenességekre hajlamosíthat (5, 6). A hiperhomociszteinémia kialakulása fólsav bevitellel megelőzhető. A súlyosabb, csak igen nehezen vagy egyáltalán nem kezelhető öröklődő betegségek (pl. cisztikus fibrózis, Duchenne féle izomdisztrófia) esetében az érintett családok gyakran igénylik a prenatális, tehát a magzati korban elvégezhető diagnosztikát. A magzat genetikai státusának pontos meghatározása a modern genetikai tanácsadás alapja. Rendkívül fontos a mutációt hordozó, de egészséges családtagok azonosítása is (hordozó [carrier] diagnosztika). A súlyos, örökletes betegségek oki terápiájának, a génterápiának a betegség-gén és mutációinak ismerete szintén alap feltétele. Dolgozatomban a molekuláris genetikai diagnosztika fent említett, kétféle szerepét az öröklődő haemochromatosis és a haemophilia A példáján mutatom be. Mindkét betegségnél (bár eltérő módon) a molekuláris genetikai vizsgálat bevezetése, és 4

Bevezetés elérhetősége a rutin laboratóriumi vizsgálatok között jelentős előrelépést jelentett a kórkép diagnosztikájában. Az öröklődő vagy herediter haemochromatosis (HH) a vasanyagcsere betegsége, amelyben a fokozott vasfelszívódás szabályozható kiválasztó mechanizmus hiányában a felszívódott vasfelesleg tárolásához vezet. A lerakódott vas a szervekben parenchymás szövetkárosodást okoz. A leggyakoribb szervi manifesztáció a májcirrhosis, szintén jellemző lehet a diabetes mellitus, a bronzszínű bőrpigmentáció, a cardiomyopathia, illetve az izületi panaszok. Az újabb genetikai kutatások révén vált ismertté, hogy a betegség hátterében az esetek jelentős részében a HFE gén p.282c>y (C282Y) pontmutáció homozigóta formája áll a kaukázusi népcsoportokban. A HFE gén C282Y mutációja által okozott, autoszomális recesszív módon öröklődő haemochromatosis Nyugat-Európában mintegy minden 400-dik, Magyarországon saját vizsgálataink szerint minden 700-dik embert (főként férfit) érinti. Mindezek alapján a haemochromatosis egyike a kaukázusi populáció leggyakoribb örökletes betegségeinek. A tünetek gyakran lappangva alakulnak ki és a betegség korai szakában sem a klinikai kép, sem a laboratóriumi eltérések nem specifikusak. Egyes esetekben az örökletes és a szerzett formák elkülönítése is nehézséget jelenthet. Mindkét esetben segítséget nyújthat a diagnózis kialakításában a molekuláris genetikai vizsgálat. A korai preszimptomatikus (a tünetek megjelenése előtti) diagnosztika az egyszerű preventív terápia lehetősége miatt is kiemelt fontosságú. A haemophilia A (HA) X kromoszómához kötötten, recesszív módon öröklődő vérzékenység, amely minden 5000-10000-dik fiúgyermeket érint. Magyarországon mintegy 900 HA-beteget tartanak nyilván. A kórképet a VIII. véralvadási faktor csökkent illetve hiányzó aktivitása okozza. Az elhúzódó vérzések, az izületek és az izmok bevérzésének súlyossága a beteg maradék VIII. faktor aktivitásától függ és különböző mértékben, esetenként jelentősen csökkenti az élettartamot és rontja az életminőséget. A betegség diagnózisa az érintett betegeknél fenotípusos vizsgálatokkal biztonsággal felállítható. A tünetmentes hordozók azonosítása és a hordozók fiúmagzatainál a betegség kimutatása (prenatális vizsgálattal) fenotípus vizsgálatokkal nehézségekbe ütközik, míg molekuláris genetikai vizsgálatokkal könnyen megoldható. 5

Bevezetés 1.2. Öröklődő haemochromatosis - irodalmi háttér 1.2.1. Az öröklődő haemochromatosis patogenezise A kórkép lényege, hogy egy genetikai eltérés következtében fokozódik az intesztinális vasfelszívódás és ez szabályozható kiválasztó mechanizmus hiányában nagy mennyiségű vas lerakódásához, valamint következményes szövetkárosodáshoz vezet. A vas fehérjékhez kötése nemcsak a metabolikus, a tárolási és a szállítási funkciók szempontjából fontos, hanem a sejtalkotók védelmét is szolgálja a szabad vas toxikus hatásaival szemben (összefoglalásként lásd 7). A vas nagy redoxpotenciálja lehetővé teszi, hogy oldatban szabad oxigén gyököket képezzen. Ezek toxikus hatásúak a biológiai struktúrákra, különösen a membránszerkezetek foszfolipidjeire. A vas toxikus hatása következtében kialakuló lizoszómális membrán fragilitás sejtkárosító enzim kiszabadulást okoz, a mitochondriális membránkárosodás a sejt energia egyensúlyának megbomlását, az endoplazmatikus retikulum sérülése pedig a sejt metabolikus zavarát eredményezi. Mindezek a folyamatok sejtdegenerációhoz, sejthalálhoz és következményes fibrogenezishez vezetnek. A vas a kollagén szintézis legfontosabb enzimjeinek, a prolin- és szerin-hidroxilázoknak a kofaktora, így direkt kollagén szintézist fokozó hatását is megfigyelték. A szabad vas egyrészt közvetlenül, másrészt közvetett módon a szabad oxigéngyökökön keresztül, károsítja a DNS állományt. A szervezet a vasegyensúlyt döntően a vasfelszívódás változtatásával biztosítja. Normális vastelítettség esetén a napi 10 mg vasbevitelnek mintegy 10%-a szívódik fel. Ez az arány akár 30%-ra is emelkedhet vashiányos állapotokban, illetve jelentősen csökken vastúltelítettségben. A felszívódással ellentétben a vaskiválasztás fiziológiásan nem szabályozható. Napi 1 mg vasat veszít egy felnőtt szervezet a gasztrointesztinális, a genitourinális traktusból és a bőrről leváló sejtekkel, amelyhez nőknél további 1 mg vasveszteség társul a menstruáció miatt. Az öröklődő haemochromatosis (HH) egyik jellegzetessége a vastúltelítettség ellenére is megfigyelhető fokozott vasfelszívódás. A betegség korai szakaszában a vasfelszívódás akár napi 3-4 mg-ra is emelkedhet, amely a betegség előrehaladtával csökken. A szervezet normális össz-vastartalma 3-4 g. HH esetében évi 0,5-1 g többlet vas felszívódásával számolhatunk (7). 6

Bevezetés 1.2.2. Az öröklődő haemochromatosis kialakulásáért felelős gének 1.2 2.1. A HFE gén és fehérje A HH-nak megfelelő klasszikus klinikai és patológiai képet, a májcirrhosissal járó bronz-diabetest 1865-ben Trousseau írta le. A kórkép örökletes természetét 1935-ben Sheldon vetette fel, feltételezését azonban többen kétségbe vonták. Csak 1976-ban, a HH és a HLA-A3 antigén gyakori társulásának és kapcsolt öröklődésének felfedezésekor igazolódott biztosan a kórkép genetikai háttere (8), és ezzel a betegség génjét a 6. kromoszóma rövid karjára, a HLA-A antigént kódoló régió közelébe lokalizálták. A pozicionális klónozás alkalmas olyan gének azonosítására, amelyek génterméke, és annak aminosav sorrendje illetve funkciója ismeretlen. A pozicionális klónozás során a gént feltételezhetően tartalmazó régiót olyan kicsire kell leszűkíteni, amely már lehetővé teszi a teljes bázissorrend meghatározását. A primer haemochromatosist okozó mutáció valószínűleg egy D6S265-1, HLA-A3, D6S105-8 és D6S1260-4 haplotípusú kromoszómán keletkezett, mivel e DNS markerek nagy allél-asszociációt mutattak a HH-val. A régió alacsony rekombinációs gyakorisága elősegítette a konzervált haplotípus fennmaradását, viszont megnehezítette a pozicionális klónozást. Csak 20 évvel a HLA-antigénekkel való kapcsoltság felismerése után, 1996-ban sikerült Feder és munkatársainak azonosítaniuk egy új gént (HFE), amelynek az egyik pontmutációja a vizsgált haemochromatosisos betegek 83%-ánál homozigóta formában fordult elő, míg a kontrollok egyike sem volt homozigóta (9). Ez a mutáció (c.845g>a) az újonnan felfedezett gén 282. aminosavánál egy cisztein-tirozin cserét (C282Y) eredményez. A C282Y mutáció mellett egy másik polimorfizmust is találtak ezen a génen (c.187c>g), amely a 63. aminosav hisztidin aszparaginsav cseréjét (H63D) eredményezi. Ez a második polimorfizmus a haemochromatosisban szenvedő C282Y-heterozigóta betegek C282Y mutációt nem hordozó kromoszómáján 89%-ban volt kimutatható, a kontroll kromoszómák 17%-os allél-frekvenciájával szemben. A C282Y-negatív betegeknél nem volt gyakoribb a H63D mutáció a kontroll csoporthoz képest. Feder és mtsai ebből arra következtettek, hogy a két mutáció társulása, azaz kettős vagy compound heterozigóta állapot a C282Y és a H63D mutációk szempontjából, növeli a haemochromatosis kialakulásának az esélyét; míg önmagában a H63D mutáció nem okoz 7

Bevezetés haemochromatosist. Feder és mtsai az azonosított gént a HLA-A-hoz mutatott hasonlósága alapján HLA-H-nak nevezték el, de jelenleg a WHO ajánlása szerint HFE a hivatalos neve (10). Feder és mtsai felfedezését később több munkacsoport vizsgálata is megerősítette. Valamennyi tanulmány a C282Y-homozigótaság gyakori (64-100%-os) előfordulását igazolta a HH-ban szenvedő kaukázusi betegpopulációkban (11, 12, 13, 14, 15). A haemochromatosisos csoportok eltérései valószínűleg a diagnosztikus kritériumok és a populációk különbségeivel magyarázhatók. Azokban a tanulmányokban, ahol a pozitív családi anamnézis feltétele volt a besorolásnak nagyobb százalékban találtak C282Y homozigótákat, mint azokban a tanulmányokban, ahol csak klinikai diagnosztikai kritériumokat (lásd 1.2.3.2. fejezet) vettek figyelembe. Az észak-európai eredetű haemochromatosisos betegeknél nagyobb százalékban találták meg a mutációt, mint a dél-európai országokban. A kaukázusi népeknél a haemochromatosisban szenvedő betegeknél talált magas C282Y allél-frekvenciával szemben (69-100%) a normál populációban a mutáció allélfrekvenciája 1-10% között mozog, amely 2-19%-os heterozigóta és 0,1-1%-os homozigóta aránynak felel meg. A normál populációból kiszűrt, panaszmentes C282Yhomozigóta egyéneknél a vasfelhalmozódás gyakran laborvizsgálatokkal már kimutatható. A korábbi, vasparaméterek (szérum ferritin koncentráció és transzferrin szaturáció) mérésén alapuló szűrővizsgálatok a haemochromatosis előfordulási gyakoriságát, a homozigóta C282Y prevalenciához hasonlóan, szintén 0,05-0,5% közé tették (16). Merryweather-Clarke és mtsai (17) számos etnikai csoportban, összesen 2978 normál egyénnél vizsgálták a C282Y mutáció prevalenciáját. Azokban a populációkban találtak magas mutáns allél-frekvenciát, ahol az öröklődő haemochromatosis is gyakori, míg azoknál az etnikai csoportoknál, ahonnan eddig a betegség kisebb előfordulási gyakoriságáról számoltak be a C282Y mutációs ráta is alacsonyabb lett. A legmagasabb előfordulási gyakoriságot az ír kromoszómákon találták. Az afrikai, az ázsiai és az ausztráliai bennszülött kromoszómákon a mutáció gyakorlatilag nem fordult elő. A C282Y mutáció előfordulása különböző népcsoportokban alátámasztotta azt a korábbi feltételezést, hogy a mutáció kelta eredetű népcsoportban keletkezett ( founder effect ), és ennek megfelelően az allél-frekvencia nyugatról keletre és északról délre csökkenő tendenciát mutat Európában (1. ábra). A 8

Bevezetés mutáns gén magas prevalenciájának oka nem ismert. Feltételezhető, hogy a mutáció jelenléte szelektív előny jelentett, mivel az védelmül szolgálhatott a vashiány ellen. 1. ábra: A HFE C282Y allél-frekvencia alakulása Európában. A HFE H63D mutációjának társulása a C282Y mutációval elősegítheti a haemochromatosis kialakulását (18, 19). A C282Y mutációra nézve nem homozigóta haemochromatosisban szenvedő betegek között kettős C282Y és H63D heterozigóták gyakrabban fordulnak elő, mint a normál populációban. Valószínű, hogy önmagában a kettős heterozigóta állapot nem elég a haemochromatosis kialakulásához, mivel a homozigóták és kettős heterozigóták összesített előfordulása meghaladja az öröklődő haemochromatosis előfordulási arányát, ezen kívül a kettős heterozigóták a normál populáción belül is nagy százalékban fordulnak elő. A C282Y-negatív H63Dheterozigóta és homozigóta egyéneknél is fokozott a haemochromatosis kialakulásának kockázata a normál genotípusú egyénekhez képest, azonban a mutáció penetranciája igen alacsony. A HFE gén aminosav sorrendje alapján az MHC I. osztályba tartozó fehérjékkel mutat rokonságot (2. ábra): egy transzmembrán fehérjét kódol, amelynek három extracelluláris doménje az MHC fehérjék α1, α2 és α3 doménjeivel analóg. A fehérje fontos jellemzője az a négy cisztein aminosav, amelyek az α2 és az α3 domének diszulfid hídjait képezik. Az MHC I-es fehérjék α3 doménjének pontos konfigurációja 9

Bevezetés nélkülözhetetlen a β2-mikroglobulinnal történő nem-kovalens kapcsolódáshoz és a sejtfelszíni expresszióhoz. 2. ábra: A HFE gén által kódolt fehérje feltételezett szerkezete (9). Már a HFE gén klónozása előtt is számos indirekt bizonyíték utalt az MHC I-es osztályba tartozó fehérjék vasanyagcserében betöltött szerepére. A β2-mikroglobulinhiányos egerekben nemcsak a membránhoz kötött MHC I-es fehérjék expressziója hiányzik, hanem progresszív, a HH-hoz hasonló szöveti megoszlású vaslerakódás figyelhető meg (20, 21). Santos és mtsai (22) a β2-mikroglobulin-hiányos egereken csontvelő transzplantációt végeztek, így olyan kiméra állatokat hoztak létre, amelyek normál β2-mikroglobulin gént hordoztak a csontvelő eredetű sejtvonalaikban, (a reticuloendothelialis rendszerükben is), míg az összes többi sejtjeik β2-mikroglobulin hiányosak voltak. Ezeknél állatoknál fokozott enterális vasfelszívódást figyeltek meg, viszont a vasat a reticuloendothelialis rendszerhez tartozó, hepatikus makrofágjaik tárolták, nem a májsejtek. Ez arra utalt, hogy β2-mikroglobulin-hiányban (és valószínűleg HFE gén defektusánál is) mind az enterocitákban, mind a reticuloendothelialis rendszer sejtjeiben kóros a vasanyagcsere szabályozása. A HFEhiányos egértörzs létrehozása (23) bizonyította, hogy ennek a fehérjének a mutációja valóban okoz vasfelhalmozódást. A gén klónozása után elvégzett funkcionális vizsgálatok igazolták, hogy a HFE fehérje β2-mikroglobulint köt, valamint a sejtfelszínen komplexet képez a 10

Bevezetés vasanyagcsere egyik kulcsfontosságú elemével, a transzferrin receptorral, és csökkenti a receptor transzferrin kötő képességét. A C282Y mutáció az α3 domén egyik cisztein aminosavát érinti, a cisztein hiányában nem jöhet létre diszulfid híd. A mutáns fehérje nem képes a β2-mikroglobulinnal kapcsolódni, transzláció után az endoplazmatikus reticulumban, illetve a Golgi-apparátusban marad és degradálódik, így a sejtfelszínen nem expresszálódik. A H63D mutáció a HFE fehérje α1 doménjét érinti, nem befolyásolja a fehérje sejtfelszíni expresszióját és a transzferrin receptorhoz való kötődését, azonban a vad típusú fehérjével ellentétben, nem csökkenti a receptor ligand kötő képességét (24, 25). A HFE fehérje szabályozó szerepet tölthet be a duodenális transzferrinhez kötött vas felvételben. HFE hiányos egér duodenális transzferrin receptorhoz kötött vasfelvétele csökkent (26). Jelenlegi feltételezések szerint ez a mechanizmus szolgálja a szervezet vasraktárainak érzékelését a duodenumban (27). A szervezet vasraktárainak érzékelése a májban szintén zavart HFE hiányban: az emelkedett vasraktárak ellenére hepcidin expresszió szint csökkenés figyelhető meg, amely szintén fokozott vasfelszívódáshoz vezet (28). Leírtak a H63D mutáció közelében egy másik aminosav cserével járó (missense) mutációt (S65C), amelynél felmerült, hogy szintén rizikófaktor lehet a haemochromatosis kialakulásának szempontjából (29). Ismertek a HFE gén egyéb ritkább mutációi is, amelyek korai stop kodont [E168X, W169X] (30, 31), kóros mrns érést ( splice site mutációk) [IVS3+1G>T, IVS5+1G>A] (32, 33), vagy aminosav cserét eredményeznek [V53M, V59M, Q127H, V212K, E277K, R330M] (34, 35). A leírt missense mutációk funkcionális vizsgálata a legtöbb esetben nem történt meg, így kapcsolatuk az öröklődő haemochromatosissal nem bizonyított. 1.2.2.2. Egyéb géndefektusok, amelyek haemochromatosis kialakulásához vezetnek A klinikai kritériumok alapján diagnosztizált haemochromatosisban szenvedő betegek 0-26%-a nem hordozza sem a C282Y, sem más HFE mutációt. Az elmúlt években több haemochromatosis gént is azonosítottak, ezért a HFE génnel kapcsoltan öröklődő haemochromatosist (HH) 1-es típusú, a juvenilis haemochromatosist (JH) 2-es típusú, a transzferrin receptor 2 mutációihoz kötődő haemochromatosist 3-as típusú és a 11

Bevezetés ferroportin 1 génjéhez kötődő haemochromatosist 4-es típusú haemochromatosisnak nevezték el (összefoglalásként lásd 27, 36). A JH autoszomális recesszív módon öröklődő, progresszív vasfelhalmozódással jellemzett ritka kórkép, amely a HH-val ellentétben már fiatal felnőttkorban (<30 év) tüneteket okoz és a nőket és a férfiakat egyaránt érinti. A tünetek hasonlóak, azzal a különbséggel, hogy JH-ban a szív és az endokrin szervek érintettsége gyakrabban fordul elő. A betegség génje nem ismert, pozicionális klónozással az 1. kromoszóma hosszú karjára (1q21) lokalizálták (37). Két JH családban a hepcidin peptidet kódoló HAMP gén (19q13) mutációit azonosították (38). A transzferrin receptor 2 (TFR2) gén mutációi által okozott haemochromatosis autoszomális recesszív módon öröklődik. Mutációit (E60X, M172K, Y250X, AVAQ594-597del, Q690P) izolált non-hfe haemochromatosisos családokban azonosították (39, 40, 41, 42). A ferroportin 1 gén mutációi autoszomális domináns módon öröklődő haemochromatosist okoznak. Nemcsak öröklésmenete, hanem a klinikai képe is eltér a HH-tól. A betegség korai szakaszában főként a reticuloendothelialis rendszer sejtjei érintettek. A laboratóriumi eltérések közül a szérum ferritin emelkedés hamarabb kialakul, mint a transzferrin szaturáció emelkedés. A ferroportin 1 gén mutációi (N144H, A77D, Y64N) közül a V162del mutációt több különböző populációban is leírták (43, 44, 45, 46). A 2-4-es típusú HH-ra vonatkozóan pontos epidemiológiai adatok nem ismertek. Az 1-es típusú HH-val szemben ritkán fordulnak elő és izolált, non-hfe HH-ban szenvedő betegeknél azonosították az említett különböző gének mutációit. Egészséges és emelkedett vasparaméterekkel rendelkező véradók (300 illetve 178 fő) ismert TFR2 mutációkra történő szűrése során mutációt hordozó egyéneket nem azonosítottak (31, 47). Esetleg a ferroportin 1 gén V162del mutációja lehet gyakoribb, mivel több populációban is leírták előfordulását (44, 45). 1.2.3. Az 1-es típusú öröklődő haemochromatosis klinikai képe, diagnózisa és terápiája 1.2.3.1. Klinikai megjelenés A HFE gén mutációi által okozott 1-es típusú haemochromatosis klinikai tünetei (összefoglalásként lásd: 7, 48, 49) leggyakrabban 40-60 éves életkorban jelentkeznek. A tünetek súlyosságát számos endogén és exogén faktor befolyásolja (pl. táplálkozási 12

Bevezetés szokások, alkoholfogyasztás). Nőknél a menstruáció és a terhesség alatti vasveszteség miatt a haemochromatosis klinikai képe 5-10-szer ritkábban alakul ki. A vastúltelítettség legtöbb tünete nem specifikus. A betegség korai szakaszában a betegek gyakran krónikus fáradtságról, gyengeségről, hasi és izületi fájdalmakról, impotenciáról panaszkodnak (50). A lappangó kezdetet jellemzi, hogy a tünetek megjelenése és a diagnózis felállítása között eltelt idő nőknél átlagosan 5, férfiaknál átlagosan 8 év (51). A klasszikus klinikai triász a bronz-diabetesszel járó májcirrhosis a betegség késői szakaszára jellemző. A máj érintettsége a kórkép egyik legállandóbb jellemzője. Mikroszkóposan a májsejtekben Berlini-kék festéssel nagy mennyiségű vas mutatható ki. A vaslerakódás főként a hepatocitákban mutatkozik és jellemző a reticuloendothelialis rendszerhez tartozó makrofágok (Kupffer-sejtek) relatív megkíméltsége. Szekunder haemochromatosisban a vaslerakódás főleg a Kupffer-sejtekben figyelhető meg. A vaslerakódás fokozódásával először fibrosis, majd cirrhosis alakul ki. Klinikai vizsgálattal hepatomegália a betegek több, mint 90%-ánál észlelhető. A májenzimek közül enyhe aminotranszferáz (AST, ALT) emelkedés gyakran megfigyelhető. A máj érintettség legfőbb komplikációja a hepatocelluláris karcinóma megjelenése, amely fibrosisnál és cirrhosisnál hozzávetőleg az esetek 20-30%-ában alakul ki. A haemochromatosisos betegek 90%-ánál figyelhető meg abnormális bőrpigmentáció. A klasszikus bronzszín ritka, gyakran fémes szürke pigmentáció figyelhető meg főleg a napnak kitett helyeken, a genitálékon és a hegvonalakban. A krónikus vasterhelés a hasnyálmirigy fibrosisához vezethet. A társuló hepatopathia szintén hozzájárul az inzulinrezisztencia kialakulásához. Diabetes mellitus (DM) a haemochromatosisos betegek 65%-ánál, főként a cukorbetegség szempontjából pozitív családi anamnézisűeknél és a cirrhosisban szenvedőknél alakul ki. A diabetes kezelése során nagyobb arányban számolhatunk inzulin rezisztencia megjelenésével. Az exokrin pancreas klinikai érintettsége nem jellemző a kórképre. A vas az izületekben a synoviumot borító epitheliumban rakódik le. Radiológiailag subchondralis csontciszták, izületi porcvesztés izületi rés szűkülettel, diffúz demineralizáció és hipertrófiás csontproliferáció figyelhető meg. Az említett eltérés legtípusosabban a kéz második-harmadik metacarpo-phalangealis izületeinél jelenik meg. Panaszokat okozó arthropathia a betegek 25-50%-ánál alakul ki, és általában 50 év 13

Bevezetés felett jelentkezik, de a kórlefolyás bármely szakaszában megjelenhet, akár a betegség első tünete lehet vagy a venoszekciós terápia alatt is elkezdődhet. Kardiális diszfunkció a kezdeti diagnóziskor a betegek kb. 15%-ánál mutatható ki. A leggyakoribb kardiális manifesztáció a dilatatív cardiomyopathia és az ingerületvezetési zavarok. Kardiális tünetek fiatal betegeknél gyakrabban fordulnak elő és esetenként a beteg hirtelen halálát okozhatják. A pajzsmirigyben, a mellékpajzsmirigyekben, a hipofízis elülső lebenyében és a mellékvesék zona glomerulosájában kifejezett vaslerakódás figyelhető meg, míg a herékben nincs vaslerakódás. A hypogonadotrop hypogonadismus libidó csökkenéssel, impotenciával, tesztikuláris atrófiával vagy amenorrhoeaval történő megjelenése megelőzheti az egyéb tünetek jelentkezését. Hypothyreosis, hypoparathyreosis vagy hypadrenia ritkán alakul ki. 1.2.3.2. Az öröklődő haemochromatosis diagnózisa A haemochromatosis lehetősége a specifikus tünetek hiánya és a lappangó kezdet miatt minden krónikus parenchymás májbetegség, bőrpigmentáció, diabetes mellitus, cardiomyopathia vagy arrhythmia, arthropathia vagy endokrin diszfunkció diffenciál diagnózisánál fel kell, hogy merüljön, különösen, ha e tünetek társulása figyelhető meg (52). A diagnózis alappillére a szérum vas, illetve ferritin szintek és a transzferrin telítettség (szaturáció) meghatározása (53). A szérum vas szint HH-ban sokáig a normális tartományban marad. A transzferrin szaturáció mérése jobban megfelel szűrővizsgálat céljára, nőknél 50% feletti, férfiaknál 62% feletti érték jellemző a HH-ra. A szérum ferritin koncentráció általában jól jellemzi a szervezet vasraktárainak mennyiségét. Klinikailag manifesztálódott haemochromatosisnál a ferritin szint általában 1000 µg/l felett van, de alacsonyabb értékek lehetségesek a betegség korai szakaszában. Ugyanakkor a ferritin egy akut fázis fehérje és emelkedése nem specifikus a HH-ra. Amennyiben a szérum vas, illetve ferritin szintek vagy a transzferrin szaturáció értékei vastúlterhelésre jellemzők és a vaslerakódáshoz vezető szekunder okok kizárhatók, a diagnózis felállításához májbiopszia szükséges. A szövettani képen 3+, 4+ parenchymás Berlini-kék reakció mutatható ki. Magyarországon nem elterjedt a 14

Bevezetés Nyugat-Európában diagnosztikus kritériumként alkalmazott májvas koncentráció (HIC) [>4500 µg/g száraztömeg] és a májvas index [HII=HIC (µg/g)/56 x életkor> 2,0] meghatározása (54, 55). A HH-ra jellemző a mobilizálható vasraktárak emelkedett szintje, azaz terápiás kvantitatív vérlebocsátással több, mint 4 g vas (=16 U vér) távolítható el anaemia kialakulása nélkül. A haemochromatosis fenotípusát mutató egyéneknél a C282Y-homozigóta (esetleg C282Y/H63D) genotípus kimutatása megerősíti a diagnózist, esetleg kiválthatja az invazív májbiopsziát (56), ugyanakkor egy negatív eredményt adó genetikai vizsgálat nem zárja ki a HFE gén másfajta mutációinak és egyéb gének mutációinak következtében kialakuló öröklődő haemochromatosist. Szekunder haemochromatosis alatt olyan vastúltelítettségi állapotokat értünk, amelyek más örökletes vagy szerzett betegségek (pl. diszeritropoetikus vagy hemolítikus anaemiák, különböző eredetű májcirrhosisok) vagy túlzott parenterális vasbevitel, transzfúziók következményei (57). Ezeknél a kórképeknél a kialakult vaslerakódás a HH laboratóriumi leleteit utánozza. A molekuláris diagnosztika ezekben az esetekben is új lehetőséget kínál a differenciál diagnózisban. 1.2.3.3. Az öröklődő haemochromatosis terápiája A szervezet vasraktárai hetenkénti 400-500 ml vér terápiás lebocsátásával csökkenthetők, amíg a szérum ferritin szint az alsó normál értékre süllyed. A betegek általában jól tűrik a vérveszteséget. A szérum ferritin szint normalizálódása kialakult haemochromatosis esetén 25 g-s vasterhelést feltételezve 2-3 évig tartó hetenkénti terápiás vérlebocsátással érhető el. Ekkor a vérlebocsátások közötti időtartam 1-3 hónapra emelhető és ez a teljes életen át folytatható. A vas-kelátor kezelés (desferoxamin) általában csak súlyos, pl. kardiálisan dekompenzált, illetve súlyos anaemiában szenvedő betegeknél szükséges. A hepatomegalia a terápiával párhuzamosan csökken vagy megszűnik. A fibrosis és a cirrhosis viszont irreverzibilis. Az inzulin és a venoszekciós terápia bevezetése óta a HH-ban szenvedő betegek haláloka megváltozott. Jelenleg a májrák tehető felelőssé a betegek körülbelül egyharmadának a haláláért. A hepatocellularis karcinóma kialakulásának valószínűségét a vastelítettség mértéke és fennállásának időtartama 15

Bevezetés befolyásolja. Társuló májkárosító faktorok, pl. alkoholfogyasztás, krónikus hepatitis, növelik a daganat kialakulásának valószínűségét. Ha a diagnózis időpontjában már fibrosis vagy cirrhosis áll fenn, akkor a vasraktárak kiürítése nem akadályozza meg a karcinogenezist. Az ilyen betegeknél ajánlott a rendszeres hasi ultrahang vizsgálat és az α-fetoprotein (AFP) szűrés. A venoszekciós terápia csökkenti a bőrpigmentációt, és a betegek negyven százalékánál az inzulin szükségletet. A krónikus polyarthritist általában nem befolyásolja a kezelés, sőt az gyakran rosszabbodik a terápia mellett is. A kardiális funkció az esetek többségében javul, de annak kezelése így is gyakran nehézségekbe ütközik, mert a haemochromatosisos cardiomyopathia általában rosszul reagál a hagyományos antiarrhytmiás vagy a pozitív inotrop gyógyszerekre. A hypogonadismus általában irreverzibilis. Általánosságban elmondható, hogy a májfibrosis és a diabetes kialakulása előtt megkezdett venoszekciós terápiával a betegek várható élettartama nem különbözik a normál populáció várható élettartamától (58, 59). 1.2.4. A HFE mutációi myelodysplasiás szindrómában A HFE gén azonosítása előtt az átlag populációban nem volt lehetőség a haemochromatosis gén heterozigóta mutációhordozók kimutatására, így a heterozigóták vasparamétereinek tanulmányozása korábban szűkebb családvizsgálatokra korlátozódott. A HLA-tipizálással azonosított heterozigóta egyéneknél progresszív vasfelhalmozódás nem volt megfigyelhető, de vasparamétereik magasabbak voltak a mutációt nem hordozó családtagjaikhoz viszonyítva. Többségüknél a szérum ferritin szint és a transzferrin szaturáció értéke a normál tartományban maradt, 10-20 százalékuknál azonban emelkedett vasparamétereket találtak. (60, 61). Hasonlóképpen egy ikertanulmány (62) is emelkedett vasparamétereket talált a HFE C282Y és H63D heterozigóta ikertestvéreknél a normál genotípusú testvérpárokhoz képest. Mindezek alapján felmerült, hogy a HFE viszonylag gyakran előforduló C282Y és H63D heterozigóta genotípusai befolyásolhatják olyan multifaktoriális betegségek kialakulását, illetve progresszióját, amelyekben a vaslerakódás patogenetikai szerepet játszhat. A myelodysplasiás szindróma (MDS) a haematopoetikus őssejtek klonális betegsége, 16

Bevezetés amelyben kóros, ineffektív erythropoiesis és myelopoiesis figyelhető meg. A betegségre jellemző a leukémiás transzformációra való hajlam. A betegség, attól függően, hogy milyen fokban zavart a vérképzés, különböző klinikai képpel jelentkezhet. Kezdeti panasz gyakran az anaemiával összefüggő gyengeség és fáradékonyság. A trombociták és a fehérvérsejtek funkcionális és számbeli rendellenességének fokától függően vérzés, illetve fertőzéssel összefüggő láz jelentkezhet. A betegség kezelése jelenleg csak szupportív ellátásra irányul. Csontvelő transzplantáció, mint kóroki terápia az idős életkor és a gyakori társuló betegségek miatt általában nem kerül szóba. A sorozatos vérátömlesztések egyre növekvő vérigénnyel járnak, amelyet a szerológiai inkompabilitás kialakulásával magyarázhatunk. A transzfúziós haemosiderosist vaskelátor terápiával kezelik. A MDS-ben kialakuló haemosiderosis hátterében az ismételt transzfúziók mellett számos egyéb szerzett tényező is feltételezhető: az ineffektív erythropoiesissel járó anaemiákban gyakran megfigyelhető fokozott vasfelszívódás. A kórkép hátterében a mitokondriális vasanyagcserét, vas transzportot és ATP szintézist érintő, szerzett mitochondriális DNS mutációkat feltételeznek (63). A HFE gyakori mutációi nem játszanak elsődleges szerepet a szerzett klonális betegség kialakulásában, mégis feltételezhető, hogy jelenlétük, akár heterozigóta állapotban is súlyosbíthatja a vaslerakódás mértékét. A vasterhelés circulus vitiosus-ként pl. szabadgyökök generálásával, mutációk előidézésével az érintett MDS-ért felelős sejtklónban tovább ronthatja az alapbetegség progresszióját. Klinikai megfigyelések szerint az orális vaskelátor kezelés bevezetése már a korai szakban csökkenti a transzfúziók gyakoriságát. 17

Bevezetés 1.3. Haemophilia A - irodalmi háttér 1.3.1. A haemophilia A patogenezise A vérzéscsillapításhoz vaszkuláris, trombocita- és plazmafaktorok kombinált aktivitása szükséges. A plazmafaktorok alkotják az ún. véralvadási kaszkádot, amely pontos lezajlásához 12 alvadási faktor fehérje és sok egyéb tényező összehangolt működésére van szükség (összefoglalásként lásd 64). Ezek közül a VIII. alvadási faktor (FVIII) csökkent aktivitása okozza a haemophilia A-t (HA). A klasszikus véralvadási kaszkád két egymástól független úton aktiválódhat (extrinsic és intrinsic), és a FVIII-t az intrinsic oldalon tüntetik fel, a FIX kofaktoraként. Az extrinsic út faktorai (szöveti faktor és FVII) azonban önmagukban nem képesek elegendő protrombint aktiválni a stabil fibrinháló kialakulásához, ehhez a FIX és FVIII megfelelő aktivitása is szükséges (3. ábra). Mindezek alapján állítható, hogy a FIX és a FVIII is központi szerepet töltenek be a véralvadási folyamatban. 3. ábra: A véralvadás folyamata (65). Az extrinsic út aktiválódásakor az aktivált FVII (FVIIa) a FX mellett kis mennyiségű FIX-t is aktivál. FXa jelenlétében a TFPI (tissue factor pathway inhibitor) gátolja a FXa és a FIXa további keletkezését, így a keletkezett FXa nem elegendő a stabil fibrinháló kialakításához. Az eddig keletkezett trombin azonban aktiválja a FVIII és FIX fehérjéket, így további, már megfelelő mennyiségű FXa keletkezhet. (A római számok a megfelelő alvadási faktorokat, a fekete nyilak az aktiválást, a piros nyilak a gátlást, a zöld nyilak a pozitív visszacsatolásként megjelenő aktiválást szemléltetik.) 18

Bevezetés 1.3.2. A VIII. alvadási faktor génjére és a keletkező fehérjére jellemző sajátosságok Patek és Taylor 1935-ben azonosítottak egy plazma komponenst (az antihaemophiliás globulint), amely az X kromoszómához kötötten öröklődő haemophiliás beteg plazmájának alvadási idejét korrigálta. 1952-ben három különböző csoport is leírta, hogy a klinikailag azonos tünetekkel bíró haemophiliás betegek plazmája egymás alvadási idejét korrigálhatja. Mindezek alapján derült fény arra, hogy a haemophilia hátterében több alvadási faktor (FVIII és FIX) defektusa állhat, és elkülönítették a haemophilia A-t és B-t (66). A FVIII fehérje tisztítására irányuló kísérletek az 1950-es években kezdődtek. Utólag egyszerű belátni, hogy a kezdeti munkákat miért nem koronázta siker. A FVIII tisztán nehezen izolálható, mivel a von Willebrand faktorhoz (vwf) kötődik, önmagában alacsony koncentrációban van jelen és instabil. A FVIII fehérje tiszta előállítása először 1979-ben sikerült. Elegendő mennyiségű FVIII izolálása után részleges fehérje szekvencia meghatározással lehetőség nyílt (funkcionális klónozással) a FVIII génjének azonosítására (66, 67). A FVIII gén az X kromoszóma hosszú karjának disztális végéhez közel, 1 megabázisra a telomertől található (Xq28). 186 kilobázisos méretével (26 exon) az egyik leghosszabb emberi gén. A génről 9 kilobázis méretű mrns készül, amelyről egy 2351 aminosavból álló fehérje szintetizálódik. A FVIII fehérje endoplazmatikus retikulumba kerülésekor az N-terminális 19 aminosav lehasad és az aszparaginok oldalláncaihoz oligoszacharidok kapcsolódnak. A Golgi rendszerben kihasad a B domén egy része, a szerin és a treonin aminosav oldalláncokhoz szénhidrátok kötődnek és a hat tirozin oldallánc szulfatálódik. Alapállapotban a VIII. faktor a plazmában egy 90-200 kda-os nehéz láncból, és egy 80 kda-os könnyű láncból áll, amelyet a vwf stabilizál (66). A súlyos HA betegek (a FVIII aktivitás nem éri el a normál aktivitás 1%-át) mintegy 45%-ánál a FVIII gén egy speciális mutációja, a 22. intron inverziója és mintegy 3-5%- ánál az 1. intron inverziója áll a betegség hátterében. A súlyos esetek további 50%-ában és a középsúlyos illetve enyhe esetekben nem ismerünk más mutációs predilekciós helyet. Eddig több mint 700 mutációt írtak le, amelyek a 26 exonon elszórtan helyezkednek el (68). 19

Bevezetés 1.3.2.1. A FVIII gén inverziói Higuchi és mtsai 1991-ben genomiális DNS-ről történő exon-amplifikálás és szekvenálás segítségével jellemezték a HA betegek mutációit (69). Meglepő módon az enyhe és a középsúlyos esetekben szinte mindig azonosították a mutációt, míg a súlyos eseteknek csak a felében találtak eltérést a kódoló szekvenciában. Naylor és mtsai reverz transzkripciót követő PCR-rel a súlyos HA betegek mintegy 40%-ánál a FVIII mrns 22. és 23. exonja között az átíródás megszakadását észlelték (70). Ennek hátterében később Lakich és mtsai (71) és Naylor és mtsai (72) azonosították a FVIII gén 22. intronját érintő inverziót. Az inverzió gyakori előfordulásának oka a FVIII gén 22. intronjának és a gént környező telomerikus régió szerkezetében rejlik. A FVIII gén legnagyobb, 32 kilobázis (kb) hosszúságú 22. intronja tartalmaz egy CpG szigetet, amely kétirányú promoterként szolgál két másik átíródó gén, az F8A és az F8B (FVIII asszociált A és B gének) számára. Az F8B gén a FVIII génnel megegyező orientációjú, első exonja a 22. intronban található, míg további exonjait a FVIII gén 23-26. exonjai adják. Az F8A egy rövid, intronmentes gén, amely a FVIII génnel ellentétes irányban íródik át és egy 9,5 kb nagyságú, repetitív szekvencia része (int22h-1 vagy A1). Az int22h-1 a 22. exontól mintegy 5 kb távolságra helyezkedik el. A FVIII gén 22. intronján kívül ez a repetitív szakasz még két példányban a génen kívül is megtalálható, attól mintegy 300 és 400 kb-nyira 5' (telomerikus) irányban (proximális és disztális kópiák: int22h-3 és int22h-2, más néven A3 és A2). A három homológ kópia DNSszekvenciáját összehasonlítva gyakorlatilag teljes (99,9%-os) azonosságot találtak (73). Az intronikus és az egyik extragenikus kópia között bekövetkező intrakromoszómális homológ rekombináció eredményeként egy speciális mutáció (inverzió) jön létre, ami a FVIII gént két részre osztja: egy 1-22. exonokat tartalmazó és egy 23-26. exonokat tartalmazó részre, amelyek ellentétes orientációjúak és mintegy 500 kb távolságban találhatóak egymástól az inverziós kromoszómán. A két telomerikus F8A gén bármelyikével létrejöhet az intrakromoszómális rekombináció, ennek alapján elkülöníthetünk disztális (vagy 1-es típusú) illetve proximális (vagy 2-es típusú) inverziót (4/a ábra). Az esetek kis százalékában az inverzió egy FVIII génen kívül található harmadik extragenikus, vagy csonkolt homológ régióval jön létre (74, 75). Az egyes extragenikus régiók duplikációját az irodalom normál polimorfizmusnak tartja. A szám feletti disztális illetve proximális régióval bekövetkező intrakromoszómális 20

Bevezetés rekombináció 3A illetve 3B típusú inverziót eredményez (4/b ábra). Az inverzió által érintett X kromoszómáról teljes hosszúságú FVIII mrns, így FVIII fehérje sem képződhet (76). Férfiaknál az X kromoszóma monoszómiája a gametogenezis során kedvez az intrakromoszómális homológ rekombináció kialakulásának, ezért a 22. intron inverzió szinte mindig (az esetek 98%-ában) a spermatogenezis során alakul ki (77, 78). Egy 1041 bázispár hosszúságú repetitív szekvencia jelenléte az 1. intronban és extragenikusan a géntől telomerikus irányban a 22. intron inverzió keletkezéséhez hasonló mechanizmussal 1. intron inverziót eredményezhet, amelynek gyakorisága a súlyos HA-ban szenvedő betegek között mintegy 3-5% (79, 80, 81). 1.3.2.2. A FVIII gén pontmutációi Az ismert bázis-szubsztitúciók nagy része a missense (aminosav cserével járó) mutációk körébe tartozik. A missense mutációk legtöbbjénél nincs felderítve a struktúra-funkció háttér. Létrehozhatnak vagy kiejthetnek proteolítikus hasítási helyeket, a tirozinokat érintő mutációk gátolhatják a szulfatálódást, illetve túlzott glikozilációt is eredményezhetnek. Számos nonsense, azaz korai stop kodont eredményező, és számos mrns hasítási helyet ( splice-site -ot) érintő mutáció ismert. Ritkán a bázis-szubsztitúció olyan nonsense mutációt eredményez, amely az érintett exon mrns szinten történő kivágódásához vezet az olvasási keret elcsúszása nélkül ( exon skipping ) (82, 83). A FVIII pontmutációk mintegy 35%-a a CpG dinukleotidoknál keletkezik, amelyek ismert mutációs hot spot -ot jelentenek bárhol a genomban. A guanintól 5 irányban található citozin gyökök az emlős sejtekben metilációs helyek. A metiltranszferáz ezeket a citozinokat 5-metilcitozinná metilálja, amelyek spontán, nem-enzimatikus úton deaminálódhatnak timinné. Ilyen esetben a klasszikus nukleotid csere a CG TG vagy a CG CA csere, ha a mutáció az ellentétes (antisense) DNS szálon következik be (66). 21

Bevezetés 4/a ábra: Az 1-es típusú (vagy disztális) és a 2-es típusú (vagy proximális) 22. intron inverzió keletkezési mechanizmusa (66, 74). 4/b ábra: A 3A és a 3B típusú 22. intron inverzió keletkezési mechanizmusa (74). Jelmagyarázat: FVIII: a VIII. alvadási faktor génje; 1-22 és 23-26 felirattal jelölt fehér téglalap: a FVIII gén exonjai; Kék téglalapok: homológ régiók; A1, A2, A3: intronikus, disztális illetve proximális homológ régiók; Vízszintes csíkozású téglalap: a 22. intron homológ régión kívül eső része; Piros színű P, Q, A, B: hosszú PCR primerek; Vékony nyilak: a FVIII gén átíródásának iránya; Vastag nyilak: a homológ régiókban található F8A gének átíródásának iránya; C: centromer; T: telomer; Kb: kilobázis. 22

Bevezetés 1.3.2.3. A FVIII gén deléciói Eddig több, mint száz nagyméretű (2-210 kb) deléciót ismertettek az irodalomban, amelyek a HA hátterében álló mutációk mintegy 5%-át képviselik. A legtöbb nagyméretű deléciónál nincs pontosan azonosítva a töréspontok helyzete. A FVIII gén deléciós betegek jelentős hányadánál a szubsztitúciós terápia során inhibitor képződés figyelhető meg. Számos rövid deléció is ismert, amelyek leggyakrabban korai stop kodont, így súlyos HA-t okoznak, egyes esetekben leírtak csak 1-1 kodont érintő, enyhe HA-t okozó deléciót is. Érdekes annak az enyhe HA-ban szenvedő betegnek a mutációja, akinél a 14. exonban található AAAAAAAATAA -szekvenciában a timin delécióját azonosították. A beteg mutációja az olvasási keret elcsúszásával jár, így súlyos HA-t kellene, hogy eredményezzen. A beteg FVIII mrns-ének vizsgálata során kiderült, hogy transzkripciónál bekövetkező hibák során számos ép olvasási keretű mrns is keletkezik. Mivel a 14. exon a B domént kódolja, amely a FVIII fehérje érése során kivágódik, a mutáns, de ép olvasási keretű mrns-ről aktív FVIII keletkezhet (84). 1.3.2.4. A FVIII gén inszerciói Emberben a transzpozon inszerció patogenetikai szerepét először a FVIII génben írták le (85), bár a transzpozonokat korábban már az élőlények széles skálájában azonosították, beleértve az élesztőt, az ecetmuslicát és az egeret is. Az L1 elemek a humán genom körülbelül 5%-át alkotják. Nem ismert a genomban található aktív, teljes hosszúságú L1 elemek pontos száma. A mintegy 100 000 kópiából 300 teljes hosszúságú potenciálisan ugráló gén (transzpozon) lehet, a legtöbb példány csonkolt. A transzpozonokra jellemző, hogy RNS-re átíródásuk után megszintetizálódik az antisense szál, és duplaszálú DNS-sé alakulva beszúródnak a genom egy más részletébe. Az ismertetett HA beteg esetén egy de novo keletkezett L1 inszerciót találtak, amelynél egy 22. kromoszómán található aktív L1 elem kétharmada szúródott be a FVIII gén 14. exonjába. Azóta a HA-n kívül az L1 elemek retrotranszpozicióját leírták az adenomatosis polyposis coli és a dystrophin génekben is (66). 23

Bevezetés 1.3.3. A haemophilia A klinikai képe, diagnózisa és terápiája 1.3.3.1. Klinikai megjelenés A betegség súlyossága a keringésben található VIII. faktor mennyiségétől, illetve aktivitásától függ. Súlyos esetben, amikor a VIII. faktor aktivitása alacsonyabb, mint a normál aktivitás 1%-a, a kisebb traumát követő, illetve a spontán bekövetkező ízületi és izomközti vérzések kialakulása a legjellemzőbb tünet. 1-5%-os VIII. faktor-szint esetén (középsúlyos eset) a spontán vérzések előfordulása ritkább, kisebb sérülések után lépnek fel elhúzódó vérzések. Enyhe esetekben (VIII. faktor-szint 5-30%) elhúzódó vérzés csak foghúzás, fogászati illetve sebészeti beavatkozás, vagy nagyobb sérülések után fordul elő. A vérzések során leggyakrabban a könyök-, a térd-, a boka- és a csípőizület érintett. Faktorpótlás nélkül az ízületi intrakapszuláris vérzés komoly duzzanatot, fájdalmat és merevséget okoz. A vér irritálja a synoviumot, amely gyulladáshoz, proliferációhoz, degeneratív arthritis kialakulásához vezet. Izomvérzés bárhol előfordulhat, főként a nagy igénybevételnek kitett helyeken (pl. comb, lábikra és farizomzat). A haematuria nem gyakori, de szinte minden súlyos betegnél előfordul egyszer-kétszer az élete során. Központi idegrendszeri vérzés általában csak fejsérüléskor következik be. Korábban ez okozta a legtöbb halálesetet a haemophiliás betegek között. Műtéteknél nemcsak a vérveszteség, hanem a vérzés elhúzódása is gondot okoz (66, 86). Mivel a VIII. faktor fehérje nem jut át a placentán, ezért a vérzékenység már újszülött korban jelentkezhet. Gyakoriak az injekciók utáni haematomák, vagy a circumcisiót követő vérzések. Születéskor cephalhaematoma, illetve hosszantartó köldökvérzés is előfordulhat. Számos érintett újszülöttnek azonban nincsenek klinikai tünetei. Amint a gyermekek járni tanulnak, kiterjedt zúzódások jelentkeznek. Az ajak és a nyelv egyébként kicsiny sérülése, amely órákig vagy napokig is vérzik, vezet el leggyakrabban a diagnózishoz. A betegség súlyos formájában szenvedők 90%-ánál 1 éves korra a vérzékenység klinikailag már nyilvánvalóvá válik (87). 1.3.3.2. A haemophilia A diagnózisa A vérzékenység hátterében a véralvadási kaszkád faktorai, a trombocita és az érfal szerzett, illetve örökletes betegségei egyaránt állhatnak. A koagulopátiákra jellemző, 24

Bevezetés hogy sérülések után a vérzés nem tartós, de újra kezdődik, mivel a plazmafaktorok defektusa miatt nem alakul ki stabil trombus. A felületes sérülések vérzése vagy a purpurák megjelenése nem jellemző, az inkább a trombocita funkció zavarára utal. A laboratóriumi vizsgálatok közül a protrombin idő (PI) vagy az aktivált parciális tromboplasztin idő (apti) megnyúlása utalhat koagulopátia jelenlétére. Izolált PI megnyúlás jellemzi az V. és a VII. faktorok hiányát. Izolált apti megnyúlás a IX. és a VIII. faktorok defektusai esetén fordul elő. Az I., II., X. alvadási faktorok defektusai esetén mind a PI, mind az apti megnyúlik. Ismert faktorhiányos plazmával történő keveréssel állapítható meg, hogy az izolált apti megnyúlás hátterében az FVIII vagy a FIX defektusa áll-e (88). Szerzett koagulopátiát okozhat a májkárosodás, a K-vitamin hiány, az antikoaguláns kezelés, a fokozott faktorfelhasználás (disszeminált intravaszkuláris koagulopátia, [DIC]) és az autoimmun betegségek (inhibitor képződés révén). Az általános laboratóriumi vizsgálatok közül a vérzékenység hátterében meghúzódó betegséget jelezhetnek a vérkép és a májfunkciós vizsgálatok. A haemophilia B (HB) öröklésmenete és klinikai képe megegyezik a HA-val. HB esetén a FIX génjének mutációi okozzák a betegséget (89). A HB a HA-tól csak laboratóriumi módszerrel különíthető el. A HB-ben szenvedő beteg plazmájának aktivált parciális tromboplasztin ideje ismerten VIII. faktor hiányos plazmával történő keverés után normalizálódik, míg ismerten IX. faktor hiányos plazmával történő keverésnél a korrekció elmarad. HA-ban ennek az ellentéte történik. A von Willebrand betegséget a vw faktor (vwf) fehérjét érintő defektusok okozzák. Mivel a vwf a trombociták aktiválásában és a FVIII stabilizálásában is részt vesz, a fehérje különböző régióit érintő mutációk többféle kóros fenotípus kialakulását okozhatják. Trombocita diszfunkcióra, illetve haemophiliára utaló fenotípus egyaránt kialakulhat. A vwf FVIII kötéséért és vérben történő szállításáért felelős régió mutációi a FVIII fél-életidejének csökkenéséhez, akár 10%-os FVIII aktivitáshoz és fenotípusosan enyhe HA-hoz vezet (a von Willebrand kór 2N típusa). A HA-tól az eltérő öröklésmenete (autoszomális recesszív) különítheti el, azonban sporadikus esetekben az öröklésmenet nem ad felvilágosítást. Csak speciális laborvizsgálattal, a vwf és a FVIII kötődésének a vizsgálata különíti el biztonsággal a két kórképet (90). 25