Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei A HAEMOCHROMATOSIS ÉS A HAEMOPHILIA A MOLEKULÁRIS GENETIKAI DIAGNOSZTIKÁJA. dr. Andrikovics Hajnalka

Átírás

1 Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei A HAEMOCHROMATOSIS ÉS A HAEMOPHILIA A MOLEKULÁRIS GENETIKAI DIAGNOSZTIKÁJA dr. Andrikovics Hajnalka Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola, Pathobiokémia Program Programvezető: Dr. Mandl József Országos Gyógyintézeti Központ, Haematológiai és Immunológiai Intézet Témavezetők: Dr. Tordai Attila és Dr. Sarkadi Balázs Budapest, BEVEZETÉS A molekuláris genetika az orvostudomány, ezen belül a laboratóriumi diagnosztika egyre gyorsabban fejlődő területe, amely segítséget nyújthat a diagnózis felállításában, annak pontosításában, a genotípus-fenotípus összefüggések vizsgálatában, egyes rizikófaktorok azonosításában, valamint a súlyos, monogénes öröklésmenetű betegségek esetében a prenatális és a hordozó (carrier) diagnosztikában. A molekuláris genetikai diagnosztika mindezen feladatait két öröklődő haematológiai betegség, a haemochromatosis és a haemophilia A példáján mutatom be Az öröklődő haemochromatosis (HH) genetikai háttere A HH a vasanyagcsere autoszómális, recesszív módon öröklődő betegsége. A kórkép lényege az intesztinális vasfelszívódás fokozódása, amely nagy mennyiségű vas lerakódásához és következményes szövetkárosodáshoz vezet. A kórkép leggyakoribb szervi manifesztációi a májcirrhosis, a diabetes mellitus, a cardiomyopathia és az izületi panaszok, amelyek általában éves kor körül okoznak panaszokat. Korai diagnózis esetén azonban egy egyszerű terápiával (rendszeres vérlebocsátással) a betegség kialakulása megelőzhető. A HH hátterében az esetek %-ában a HFE gén homozigóta C282Y (c.845g>a, Cys282Tyr) pontmutációja áll. A HFE gén egy másik pontmutációja, a H63D (c.187c>g, His63Asp) szintén hajlamosít haemochromatosis kialakulására, de penetranciája a C282Y mutációhoz képest jóval alacsonyabb. A HFE C282Y és H63D mutációira negatív HH esetek kis százalékában a HFE gén egyéb mutációi, vagy más újabban azonosított gének (TFR2, ferroportin1) mutációi mutathatók ki vagy korábban fel nem derített szekunder vasfelhalmozódáshoz vezető faktorok jelenléte igazolható. A normál európai populációkban a HFE gén C282Y homozigóta egyének gyakorisága 0,1-0,3%, a heterozigóták gyakorisága 2-10%. A normál populációból kiszűrt, panaszmentes C282Y homozigóta egyéneknél a vasfelhalmozódás gyakran laborvizsgálatokkal már kimutatható. Korábban a vasparaméterek (szérum ferritin koncentráció és transzferrin szaturáció) mérésén alapuló szűrővizsgálatok a HH előfordulási gyakoriságát, a homozigóta C282Y prevalenciához hasonlóan, szintén 0,05-0,5 % közé tették. Mai ismereteink szerint az európai eredetű népeknél a HH az egyik leggyakoribb öröklődő megbetegedés. 2

2 1.2. A haemophilia A (HA) genetikai háttere A HA a VIII. alvadási faktor (FVIII) csökkent aktivitása következtében kialakuló vérzékenység, amely X kromoszómához kötött, recesszív öröklésmenetű, és mintegy fiúgyermek közül érint egyet. A betegek mintegy 50%-a súlyos HA-ban (FVIII aktivitás <1%) szenved, amelyre a spontán izületi- és izomvérzések kialakulása a jellemző. Középsúlyos HA-ban (FVIII aktivitás: 1-5%) kisebb sérülések, míg enyhe HA-ban (FVIII aktivitás: 6-30%) csak nagyobb traumák, műtétek esetén alakul ki elhúzódó vérzés. Az oki terápia, a hiányzó FVIII pótlása, az esetek többségében hatásos, azonban a betegek mintegy 5-7%-a esetében a kezelés során antitest (inhibitor) termelés alakul ki a beadott faktor fehérje ellen, ami nehezíti a további kezelést. A betegség súlyosságától függően különböző mértékben, esetenként jelentősen csökken az élettartam és romlik az életminőség. A betegek családjában gyakran igényt tartanak a tünetmentes hordozók azonosítására és a prenatális (születés előtti) vizsgálatra. A FVIII gén 186 kilobázisos méretével az egyik leghosszabb emberi gén. A súlyos HA betegek mintegy 45%-ánál az FVIII gén egy speciális mutációja, a 22. intron inverziója áll a betegség hátterében. Az inverzió kialakulásáért az FVIII gén 22. intronjában található intronikus és a géntől telomerikus irányban 300 és 400 kb távolságra elhelyezkedő, extragenikus proximális vagy disztális homológ régiók között bekövetkező intrakromoszómális homológ rekombináció felelős. A súlyos esetek mintegy 5%-ában az 1. intron inverzió áll a betegség hátterében. A súlyos esetek további 50%-ában és a középsúlyos illetve enyhe esetekben nem ismerünk más mutációs predilekciós helyet. Eddig több mint 700 mutációt írtak le, amelyek a FVIII gén 26 különböző exonján elszórtan helyezkednek el. A direkt mutáció azonosítás (szekvenálás) a FVIII gén mérete miatt igen nagy idő- és költségráfordítással jár, amelynek rutinszerű alkalmazása jelenleg még Magyarországon nem megoldott. Így a géninverzió, mint leggyakoribb mutáció direkt kimutatása mellett szükségessé vált olyan, indirekt módszerek bevezetése, amelyek a mutáció fajtájától függetlenül képesek a betegséget hordozó FVIII gén öröklődésének nyomon követésére. Az indirekt módszerek családvizsgálaton alapulnak, általában nem elég a beteg és a vizsgálandó személy (proband) vizsgálata, hanem több családtag mintájára is szükség lehet. Polimorf markerként vizsgálhatóak a FVIII génen belül, ill. közvetlen szomszédságában extragenikusan található szekvencia-eltérések (RFLP technikával), illetve dinukleotid CA ismétlődések (repeatek). 2. CÉLKITŰZÉSEK 2.1. Öröklődő haemochromatosis Magyarországon eddig nem voltak ismertek a HH-ra vonatkozó epidemiológiai adatok. Munkánk első célkitűzése a HH kialakulásáért az esetek mintegy 80%-ában felelős HFE gén C282Y és H63D pontmutációinak kimutatására szolgáló, molekuláris biológiai módszerek beállítása volt. További célkitűzések: a) Adatgyűjtés a két pontmutáció hazai allél-frekvenciájára vonatkozóan az egészséges populációban. b) Közel ezer véradó C282Y mutáció-szűrése során összefüggések keresése a korábbi véradások száma és a C282Y allél-frekvencia között, valamint a vasanyagcsere paraméterek összehasonlítása különböző C282Y genotípusú egyéneknél. c) A HH magyarországi differenciál diagnosztikai lehetőségeinek bővítése. d) A C282Y és a H63D allél-frekvenciák megállapítása a legtöbbször emelkedett vasparaméterekkel járó myelodysplasiás szindrómában Haemophilia A A HA molekuláris genetikai diagnosztikai program célja a hordozó és a prenatális molekuláris diagnosztika bevezetése és igény esetén rutinszerű elérhetőségének biztosítása az érintett családok számára. A teljes program célkitűzései: a) Olyan diagnosztikai stratégia bevezetése, amely kombinálja a könnyen kivitelezhető direkt (22. és 1. intron inverzió kimutatás) és indirekt módszereket (BclI-RFLP, IVS13CA, p39ca), illetve amellyel a hordozók több, mint 95%-ánál azonosíthatjuk a betegséget hordozó X kromoszómát. b) A direkt mutáció elemzések során a 22. és az 1. intron inverzió gyakoriságának meghatározása a magyar, súlyos HA-ban szenvedő betegek csoportjában, valamint négy, a FVIII gén 22. intronját érintő, atípusos génátrendeződéssel járó család esetében a háttérben álló molekuláris mechanizmus(ok) felderítése. c) Az indirekt módszerek bevezetése során a FVIII génnel kapcsolt markerek heterozigótasági arányainak és kapcsoltsági viszonyainak meghatározása a magyar populációban. 3 4

3 3. MÓDSZEREK 3.1.Vizsgált személyek A HH mintegy 80%-áért felelős HFE C282Y és H63D pontmutációi kimutatásának céljából 277 véletlenszerűen kiválasztott, egymással rokoni kapcsolatban nem álló, egészséges, magyar egyént (kontroll csoport), 996 önkéntes véradót, 464 haemochromatosis klinikai gyanúja miatt vizsgált beteget és 50 myelodysplasiában szenvedő beteget vizsgáltunk. A HA genetikai program keretében 137 egymással rokoni kapcsolatban nem álló HA-ban szenvedő beteg (110 súlyos, 20 középsúlyos és 7 enyhe), illetve családtagjai (összesen 475 fő) vizsgálatát végeztük el Alkalmazott laboratóriumi módszerek DNS izolálás: alvadásgátolt perifériás vérmintából, prenatális vizsgálatnál chorion-boholy (CVS) mintából kisózásos módszerrel vagy Puregene (Gentra) kittel. Pontmutáció kimutatás PCR-RFLP módszerrel: a HFE gén C282Y és H63D pontmutációinak, és a FVIII gén 18. intron (IVS18) BclI polimorfizmusának kimutatására. Pontmutáció kimutatás LightCycler készülékkel fluoreszcens jelölésű illetve jelöletlen szintetikus oligonukleotidok (hibridizációs szondák ill. PCR-primerek) alkalmazásával: a HFE gén C282Y és H63D genotípus meghatározásra. Mikroszatellita elemzés a FVIII gén IVS13CA és p39ca repeat-szám meghatározására: a radioaktívan jelölt primerrel végzett PCR amplifikációt követően a kapott termékek nagy felbontású akrilamid gélelektroforézise és autoradiográfiás megjelenítése. A kapott PCR termékek nagyságának összehasonlítása az egyes családtagoknál. Southern blot technika: a FVIII gén 22. intron inverzió kimutatására. Hosszú PCR ( long-distance PCR) a FVIII gén 22. intron inverzió kimutatására és a 22. intront érintő génátrendeződések vizsgálatára. PCR technika: az 1. intron inverzió vizsgálatára, és a FVIII gén 14., 16., 22., 23. és 26. exonjait érintő delécióinak kizárására. A vasanyagcsere klinikai paramétereinek mérése: a szérum vas és a latens vaskötő kapacitás meghatározás standard kolorimetriás módszerrel és a szérum ferritin meghatározás immunradiometriás módszerrel. A transzferrin szaturációt a szérum vas és a latens vaskötő kapacitás értékeiből számoltuk EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS Az öröklődő haemochromatosis molekuláris genetikai vizsgálata A HFE gén C282Y és H63D pontmutációinak magyarországi, normál allél-frekvenciáinak megállapítása céljából két egészséges populációban végeztünk szűrővizsgálatot: egy főként intézeti dolgozókból álló önkéntes csoportban (kontroll csoport) és egy véradókból álló csoportban. A C282Y mutáció allél-frekvenciája (%±95%CI) a kontroll csoportban (n=277) 5,6± 2,0%, a véradó csoportban (n=996) 3,4±0,8% volt. A H63D mutáció allélfrekvenciája a kontroll csoportban (n=277) 12,3±2,8%, a véradó csoportban (n=240) pedig 14,4±3,2% volt. Irodalmi adatok szerint a C282Y mutáció allél-frekvenciája Európában nyugatról kelet felé, valamint északról dél felé csökkenő tendenciát mutat. A kontroll csoport C282Y allél-frekvenciája meglepően magas (5,6±2,0%), a német és az osztrák allél-frekvenciákhoz áll közel. A teljes véradó csoport allélfrekvenciája (3,4±0,8%) beleillik a C282Y mutáció keletről nyugatra növekvő értékeket mutató tendenciájába. A kontroll és a véradó csoportokban talált H63D allél-frekvenciák megfelelnek az európai átlagnak. A HFE pontmutációk a véradások során esetleg fellépő vashiánnyal szemben is védő szerepet játszhatnak, így felmerült, hogy a sokszoros véradók között talált C282Y illetve H63D allél-frekvenciák esetleg nem reprezentatívak a magyar átlagpopulációra. Ennek vizsgálatára összefüggéseket kerestünk a véradó csoportban a korábbi véradások száma és a C282Y és a H63D allél-frekvenciák között. A többszörös véradók körében nem találtunk szignifikáns C282Y és H63D allél-frekvencia emelkedést. A női véradók körében azonban megfigyelhető volt egy C282Y allél-frekvencia emelkedési tendencia a korábbi véradások számának növekedésével párhuzamosan (2,2±1,5% a 0-8-szoros női véradók között és 4,8±2,3% a több mint 8-szoros női véradók között; p=0,06). Azoknál az elemzéseknél a továbbiakban, ahol a C282Y és a H63D együttes előfordulására voltunk kíváncsiak, a 80 fős első véradó csoportunk adataihoz (C282Y allél-frekvencia 3,7±3,0%, H63D allélfrekvencia 14,4±5,0%) viszonyítottunk, mivel ennek a csoportnak a kiválasztásakor feltehetően nem érvényesültek szelekciós tényezők és C282Y allél-frekvenciája illeszkedik a várt európai kelet felé csökkenő tendenciába. Vizsgálataink során nem találtunk különbséget a heterozigóta és a normál C282Y genotípusú első illetve többszörös véradók szérum vas, szérum ferritin szint illetve transzferrin szaturáció értékei között. (A többszörös véradók csoportjában a vizsgált normál genotípusú egyéneket nemben, korban és korábbi véradási számban egyeztettük a heterozigóta 6

4 7 egyénekkel.) Az azonosított C282Y homozigóta, első véradónál emelkedett szérum vas, szérum ferritin szintet és transzferrin szaturációt észleltünk. A C282Y allél-frekvencia vizsgálataink a többszörös véradók körében, valamint a vasparaméterek elemzése különböző C282Y genotípusú véradóknál azt sugallják, hogy a C282Y heterozigóta genotípus vasanyagcserére gyakorolt hatása kisebb mértékű, mint az egyéb genetikai és környezeti tényezők összesített hatása. 464 haemochromatosis klinikai gyanúja miatt vizsgált egyén közül 28 C282Y homozigóta (6,0%) és 21 C282Y/H63D kettős heterozigóta (4,5%) egyént azonosítottunk. Klinikai adatok 18 homozigóta és 11 kettős heterozigóta egyénnél álltak rendelkezésünkre. A C282Y homozigóta betegek szérum vas szintje az esetek 80%-ában, szérum ferritin szintje a betegek 70%-ánál, transzferrin szaturációja pedig a betegek 88%-ánál volt kórosan emelkedett. A szérum vas szint a kettős heterozigóta betegcsoport 40%-ánál, a szérum ferritin szint 36%-ánál és a transzferrin szaturáció 18%-ánál volt emelkedett. Jól megfigyelhető a kettős heterozigóta egyének enyhébb érintettsége a C282Y homozigótákhoz képest. Vizsgált betegeink nagy részénél feltehetően ismert, vagy még felderítetlen szekunder faktorok, míg kisebb részüknél egyéb genetikai faktorok állhattak az emelkedett vasparaméterek és a vasfelhalmozódás hátterében. A HFE gén C282Y illetve H63D heterozigóta genotípusa hajlamosíthat különböző, gyakran emelkedett vasparaméterekkel járó, de a HH-tól eltérő klinikai kórképek (pl. porphyria cutanea tarda, nem-alkoholos steatohepatitis) kialakulására is. A myelodysplasiás szindrómában (MDS) szenvedő betegek csoportjában (n=50) a C282Y allél-frekvenciája 5,0±4,4%, a H63D allél-frekvenciája 23,0±8,4% volt. A C282Y és a H63D mutációk együttes előfordulási aránya az MDS-ben szenvedő betegek csoportjában 52%, míg az első véradók csoportjában 31% (p=0,04; OR: 2,3 [1,1-4,7]). Mindez arra utal, hogy a HFE gén mutációi akár heterozigóta formában is hozzájárulhatnak az MDS kialakulásához, illetve progressziójához A haemophilia A molekuláris genetikai vizsgálata Irodalmi adatok szerint a súlyos HA-ban szenvedő betegek 40-50%- ánál a 22. intron inverzió, és 3-5%-ánál az 1. intron inverzió áll a betegség hátterében. E mutációk gyakorisága miatt a 22. és az 1. intron inverziók direkt kimutatása a súlyos HA-családokban az első választandó vizsgálat. A mindkét inverzióra nézve negatív, súlyos HA-családokban, valamint a középsúlyos és az enyhe HA-családokban három polimorf marker (IVS18 PCR-BclI-RFLP, IVS13CA és p39ca mikroszatelliták) segítségével követtük a betegséget hordozó X kromoszóma öröklésmenetét. 104, súlyos HA-val érintett, egymással rokoni kapcsolatban nem álló családból 58 esetben (56%) találtunk Southern blot technikával 22. intront érintő, nagyméretű génátrendeződést: 43 esetben disztális és 11 esetben proximális inverziót, valamint 4 esetben atípusos génátrendeződést. A disztális és a proximális 22. inverzió gyakorisága és egymáshoz viszonyított arányuk (80% és 20%) megfelelt az irodalmi adatoknak. A 22. intron inverzióra pozitív családok közül 32 esetben volt igény hordozó vagy prenatális diagnosztikára: 10 potenciális hordozónál igazoltuk és 22- nél kizártuk a hordozói státuszt, a 10 diagnosztizált hordozó mellett további 16 obligát és 12 sporadikus hordozónál is kimutattunk az inverziót. Az 1. intron inverziót a 22. intron inverzió negatív, súlyos HAban szenvedő 43 betegnél vizsgáltuk. Nem találtunk 1. intron inverziót hordozó beteget. Az atípusos 22. intront érintő, nagy méretű génátrendeződések hátterében álló molekuláris eltérések felderítéséhez az érintett 4 betegnél további vizsgálatokat (hosszú PCR, a FVIII gén 14., 16., 22., 23. és 26. exonjaira specifikus PCR) végeztünk. Két betegnél a FVIII gén 22. intron homológ régióját érintő, nagyméretű deléció jelenlétét igazoltuk. Az egyik esetben a deléció a exonokat és a 22. intront, a másik esetben a deléció a 22. intront és a exonokat érintette. További két betegnél a Southern blot vizsgálat a normál, három homológ régió helyett négy homológ régió jelenlétét igazolta a genomban. A hosszú PCR technika mindkét betegnél az inverzióban résztvevő két homológ régió közül csak az egyik jelenlétét igazolta ép intronikus homológ régió mellett. Egy ép és egy inverzióban érintett intronikus homológ régió együttes jelenléte ugyanazon az X kromoszómán egy olyan rekombináció bekövetkezése esetén képzelhető el, amelyben egy normál X kromoszóma intronikus és egy disztális inverziós kromoszóma ép proximális homológ régiója vesz részt, és a rekombináció a homológ régió közelében, de azon kívül történik. Az indirekt marker analízisek során a BclI marker szempontjából 73 családból 278 személyt vizsgáltunk. Az emésztett allél gyakorisága a

5 vizsgált csoportban 71,9% volt, az emésztetlené pedig 28,1%. A vizsgált 111 obligát, diagnosztizált és sporadikus hordozó közül 45 (42%) bizonyult heterozigótának, azaz a marker ezekben az esetekben volt informatív. IVS13CA marker szempontjából 36 családból 145 személyt, p39ca marker szempontjából 27 családból 119 személyt vizsgáltunk. A vizsgált 51 hordozó közül 30 esetben (59%) volt az IVS13CA marker informatív. A p39ca-repeat 38 vizsgált hordozó közül 29-nél (76%) volt informatív. Az egyes indirekt markerek heterozigótasági arányai megfelelnek más európai országokból leírt informativitási arányoknak. Diagnosztikai stratégiánkkal (a direkt és az indirekt módszerek kombinációjával) 88 család molekuláris genetikai vizsgálata során 54 potenciálisan hordozó nőnél zártuk ki a hordozói státusz lehetőségét, és 28 nőnél erősítettük meg a hordozói státuszt (diagnosztizált hordozók). 129 hordozó esetében azonosítottuk a FVIII géninverzió jelenlétét vagy találtunk legalább egy informatív markert, amellyel terhesség esetén prenatális diagnosztika végezhető vagy az idősebb hordozók lányainál eldönthető, hogy hordozzák-e a betegségért felelős X kromoszómát. Egy hordozónál mindhárom marker homozigóta formában fordult elő, így az alkalmazott diagnosztikai stratégia 129/130 hordozónál (99,2 %) bizonyult informatívnak. A különböző markerekkel végzett vizsgálatok minden esetben alátámasztották egymást. Az elemzett családokban a markerek között nem észleltünk rekombinációt. A három marker elméletileg kiszámított kombinált informativitási aránya 94,3% az inverzió negatív családokban, amely az inverzió kimutatás alkalmazásával 97,3%-ra emelkedik a súlyos HA betegek családjaiban. Vizsgálataink során a teljes mértékben rendelkezésre álló családok körében a kombinált informativitási arány 99,2% volt. Ez arra utal, hogy a kiválasztott három marker (BclI polimorfizmus, IVS13CA és p39ca mikroszatelliták) nem öröklődnek kapcsoltan a magyar populációban. Prenatális diagnózist 13 fiú magzatnál adtunk. A beállított módszerek lehetővé tették, hogy egy korábban nem vizsgált család esetében is (prenatális diagnosztika esetén) néhány héten belül eredményt adjunk. 5. KÖVETKEZTETÉSEK 5.1. Öröklődő haemochromatosis a) Magyarországon elsőként határoztuk meg a HFE gén két, a haemochromatosis kialakulásának szempontjából fontos pontmutációjának (C282Y és H63D) allél-frekvenciáját. A magyar, átlag populációban talált HFE allél-frekvencia értékek (C282Y: 3,8±0,8% [n=1273] és H63D: 13,2±2,1% [n=517]) azt mutatják, hogy Magyarországon a többi európai országhoz hasonlóan magas öröklődő haemochromatosis gyakorisággal kell számolnunk. A kapott allélfrekvenciák alapján körülbelül minden hétszázadik ( ) személy C282Y homozigóta Magyarországon, azaz fogékony a vasfelhalmozódásra. b) A többszörös véradók körében szignifikáns C282Y és H63D allélfrekvencia emelkedést nem igazoltunk. A heterozigóta és a normál C282Y genotípusú első illetve többszörös véradók szérum vas, szérum ferritin szintjei illetve transzferrin szaturáció értékei nem különböztek. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy egészséges egyéneknél a C282Y és a H63D heterozigóta genotípus vasanyagcserére gyakorolt hatása kisebb mértékű, mint az egyéb genetikai és környezeti tényezők összesített hatása. c) Magyarországon először vizsgáltunk a HFE C282Y és H63D pontmutációit haemochromatosis klinikai tüneteit mutató betegeknél. 464 haemochromatosis klinikai gyanúja miatt vizsgált személy közül 28 C282Y homozigóta (6,0%) és 21 C282Y/H63D kettős heterozigóta (4,5%) egyént azonosítottunk. Az emelkedett vasparaméterek miatt vizsgált betegeknél a C282Y és a H63D mutációk kimutatása egy nem invazív módszer, amely segíti a haemochromatosis differenciál diagnosztikáját. d) Myelodysplasiában szenvedő betegek között a C282Y vagy a H63D mutációk előfordulása (52%) szignifikánsan magasabb volt, mint az egészséges egyének csoportjában (31%). Vizsgálataink szerint a HFE gén C282Y és H63D mutációi bizonyos kórállapotban, pl. myelodysplasiában is, akár heterozigóta formában is hozzájárulhatnak a betegség kialakulásához vagy progressziójához. 9 10

6 5.2. Haemophilia A a) A laboratóriumunkban kidolgozott kivizsgálási algoritmus (a direkt FVIII gén 22. és 1. inverzió kimutatás és a három indirekt marker [a FVIII gén IVS18 PCR-BclI-RFLP, IVS13CA és az extragenikus p39ca] kombinációja) az esetek mintegy 99%-ában informatív, megbízható és költségkímélő eljárás a HA hordozó és prenatális diagnosztikájában. A fenti direkt és indirekt módszerekkel jelentős számú hordozó és prenatális vizsgálat történt: 54 potenciálisan hordozó nőnél kizártuk, 28 nőnél megerősítettük a hordozói státuszt; 129 hordozó esetében azonosítottuk a FVIII géninverzió jelenlétét vagy találtunk legalább egy informatív markert; 13 fiúmagzatnál történt prenatális vizsgálat. b) A FVIII gén 22. intronját érintő, nagyméretű génátrendeződések a magyar, súlyos HA-ban szenvedő betegek között gyakoriak (53%). Az atípusos, 22. intront érintő génátrendeződést mutató betegeknél végzett vizsgálataink alátámasztják, hogy a FVIII gén intronikus és extragenikus homológ régiói nemcsak a géninverzió, hanem más deléciók és duplikációk kialakulását is elősegítik. A 22. intron homológ régió duplikációjával járó ritka génátrendeződések molekuláris mechanizmusára vonatkozólag felállítottunk egy új modellt. A FVIII gén 1. intron inverzió előfordulási gyakoriságát a súlyos HA betegek csoportjában Magyarországon először vizsgáltuk (gyakorisága Magyarországon feltehetően nem haladja meg az 1%-ot). c) Az indirekt marker elemzések során meghatároztuk a három vizsgált, polimorf marker heterozigótasági arányát a hazai populációban (IVS18 PCR-BclI-RFLP: 42%, IVS13CA: 59%; p39ca: 76%). Megállapítottuk, hogy a vizsgált markerek nem öröklődnek kapcsoltan a magyar populációban. 6. ÖSSZEFOGLALÁS A molekuláris genetika a laboratóriumi diagnosztika egyre gyorsabban fejlődő ága. Alkalmazási területeit két örökletes haematológiai betegség, az örökletes haemochromatosis (HH) és a haemophilia A (HA) példáján mutatom be. A HH a vasanyagcsere autoszómális, recesszív módon öröklődő betegsége. Az esetek mintegy %-ában a HFE gén homozigóta C282Y, ritkábban C282Y/H63D kettős heterozigóta mutációja áll a kórkép hátterében. Munkánk célja e két pontmutáció magyarországi allélgyakoriságának meghatározása volt. Az egészséges egyének csoportjában a C282Y allél-frekvencia 3,8±0,8% (1273 fő), a H63D allél-frekvencia pedig 13,2±2,1% (517 fő) volt. Myelodysplasiában szenvedő betegek között a C282Y vagy a H63D mutációk előfordulása (52%) szignifikánsan magasabb volt, mint az egészséges egyének csoportjában (31%). A normál hazai populációban megfigyelt C282Y és H63D allél-frekvenciák jelzik, hogy a HH Magyarországon is igen gyakori. A mutáció elemzés új, a klinikai gyakorlatba egyre inkább beépülő, nem-invazív módszer a HH diagnosztikájában. A HA a VIII. alvadási faktor (FVIII) csökkent aktivitása következtében kialakuló, X-hez kötött, recesszív módon öröklődő vérzékenység. A súlyos HA betegek mintegy 45%-ánál az FVIII gén a 22. intron, 5%-ánál az 1. intron inverziója áll a betegség hátterében. A súlyos esetek további 50%- ában és a középsúlyos illetve enyhe esetekben a kóroki mutációk a FVIII gén 26 exonján elszórtan helyezkednek el. A könnyen kivitelezhető direkt (22. és 1. intron inverzió kimutatás) és indirekt módszerekkel (BclI-RFLP; IVS13CA és p39ca mikroszatellita elemzések) 54 potenciálisan hordozó nőnél kizártuk, és 28 nőnél megerősítettük a hordozói státuszt. 129 hordozó esetében azonosítottuk a FVIII géninverzió jelenlétét vagy találtunk legalább egy informatív markert, amellyel terhesség esetén prenatális diagnosztika végezhető. Az alkalmazott diagnosztikai stratégia 129/130 hordozónál (99,2%) bizonyult informatívnak. Prenatális diagnózist 13 fiú magzatnál adtunk. A laboratóriumunkban kidolgozott genetikai vizsgálati algoritmus az esetek mintegy 99%-ában informatív, megbízható és költségkímélő eljárás a HA hordozó és prenatális diagnosztikájában

7 7. SUMMARY Molecular genetics is a rapidly advancing field of laboratory medicine. In the current work, I illustrate the application fields of molecular genetics in laboratory medicine by using two examples of hematological diseases: hereditary haemochromatosis (HH) and haemophilia A (HA). HH is a disease of the iron metabolism with an autosomal recessive inheritance. In 64 to 100% of the cases, the disease is caused by homozygous C282Y, less frequently C282Y/H63D compound heterozygous mutation of the HFE gene. The aim of our work was to define the Hungarian allele frequency data for the two point mutations of the HFE gene. By testing a healthy control population, we found an allele frequency of 3.8±0.8% (n=1273) for the C282Y point mutation, and 13.2±2.1% (n=517) for the H63D mutation. In a group of myelodysplastic patients (n=50), the combined frequency (52%) of the C282Y and H63D mutations was significantly higher than in the control group (31%). The allele frequency data for the normal Hungarian population indicate that, HH is a frequent disease in Hungary. The mutation detection represents a new, non-invasive technique that becomes integral in HH-diagnostics. HA with an X-linked, recessive mode of inheritance is a bleeding disorder caused by the deficiency of the factor VIII (FVIII) coagulation protein. Approximately 50% of severe HA-cases are caused by the inversions of intron 22 and 1 of FVIII gene. The remaining 50% of severe HA-cases, as well as all moderate and mild HA-cases are caused by mutations randomly located on all 26 exons of the FVIII gene. By using the easily executable direct techniques (detection of inversions of introns 22 and 1) and indirect techniques (BclI-RFLP; IVS13CA and p39ca), the carrier state was excluded in cases of 54 potential carriers while this status was confirmed in cases of 28 women. We identified the presence of gene inversion or the existence of at least one informative indirect marker in cases of 129 carrier women. Our diagnostic strategy proved to be informative in 129/130 (99.2%) carriers. Prenatal diagnoses were completed in 13 male fetuses. The genetic diagnostic strategy introduced in our laboratory proved to be informative, reliable and cost effective for the carrier and prenatal diagnostics of HA SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 8.1. A dolgozat alapjául szolgáló saját közlemények 1. Tordai, A, Klein, I, Andrikovics, H, Kalmár, L, Rajczy, K, Pénzes, M, Sarkadi, B, Váradi, A: High frequency of the haemochromatosis C282Y mutation in Hungary could argue against a Celtic origin of the mutation. J Med Genet 1998; 35: Andrikovics, H, Klein, I, Kalmár, L, Bors, A, Jermendy, Gy, Petri, I, Kalász, L, Váradi, A, Tordai, A: Új, molekuláris genetikai módszer az öröklődő haemochromatosis differenciáldiagnosztikájában. Orvosi Hetilap 1999; 140: Várkonyi, J, Kaltwasser, JP, Seidl, C, Kollai, G, Andrikovics, H, Tordai, A: A case of non-hfe juvenile haemochromatosis presenting with adrenocortical insufficiency. Br J Haematol 2000; 109: Várkonyi, J, Kaltwasser, JP, Seidl, C, Tordai, A, Andrikovics, H, Kollai, G, Müzes, Gy, Tulassay, Zs, Romics, L: A mellékvesekéreg csökkent működésében manifesztálódó juvenilis haemochromatosis. Lege Artis Medicinae 2000; 10: Andrikovics, H, Kalmár, L, Bors, A, Petri, I, Kalász, L, Tordai, A: Az öröklődő haemochromatosis genetikai háttere. Transzfúzió 2000; 33: Andrikovics, H, Kalmár, L, Bors, A, Petri, I, Kalász, L, Tordai, A: Az öröklődő haemochromatosis molekuláris genetikai szűrése véradók között. Transzfúzió 2000; 33: Andrikovics, H, Kalmár, L, Bors, A, Fandl, B, Petri, I, Kalász, L, Tordai, A: Genotype screening for hereditary hemochromatosis among voluntary blood donors in Hungary. Blood Cells Mol Dis 2001; 27: Klein, I, Andrikovics, H, Bors, A, Nemes, L, Tordai, A, Váradi, A: Haemophilia A and B molecular genetic diagnostic program in Hungary: a highly informative and cost effective strategy. Haemophilia 2001; 7: Várkonyi, J, Tarkovács, G, Karádi, I, Andrikovics, H, Varga, F, Varga, F, Demeter, J, Tordai, A: High incidence of hemochromatosis gene mutations in the myelodysplastic syndrome: The Budapest Study on 50 patients. Acta Haematologica 2003; 109: Andrikovics, H, Klein, I, Bors, A, Nemes, L, Marosi, A, Váradi, A, 14

8 Tordai, A: Analysis of large structural changes of the factor VIII gene, involving intron 1 and 22, in severe haemophilia A. Haematologica 2003; 88: Egyéb saját közlemények 1. Varga, I, Rácz, K, Tóth, M, Kiss, R, Fütő, L, Jakab, Cs, Andrikovics, H, Gláz, E: Cortisol és 6-beta-hydroxycortisol nyál és plazma szintek klinikai diagnosztikai jelentősége a mellékvese működésének vizsgálatában. Magyar Belorvosi Archivum 1997; 50: Pongrácz, E, Tordai, A, Andrikovics, H, Szén, L, Nagy, Z. A protrombin gén G20210A polimorfizmusának vizsgálata fiatalkori ishemiás stroke-os betegeknél. Agyérbetegségek 2001; 2: Lapicka-Bodzioch, K, Bodzioch, M, Krüll, M, Kielar, D, Probst, M, Kiec, B, Andrikovics, H, Böttcher, A, Hubacek, J, Aslanidis, C, Suttorp, N, Schmitz, G: Homogeneous assay based on 52 primer sets to scan for mutations of the ABCA1 gene and its application in genetic analysis of a new patient with familial high-density lipoprotein deficiency syndrome. Biochim Biophys Acta 2001; 1537: