Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei. dr. Klein Izabella 2000.

Átírás

1 Egyes öröklôdô betegségek és rizikófaktorok molekuláris genetikai diagnosztikája Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei dr. Klein Izabella MTA Enzimológiai Intézet, Budapest Semmelweis Egyetem, Budapest, Elméleti és klinikai immunológia program Témavezetô: dr. Sarkadi Balázs és dr. Váradi András Programvezetô: dr. Gergely Péter

2 Ôsszefoglalás A Humán Genom Project befejezésének kapujában jogosan merül fel a tudomány és a gyakorlat közelítésének igénye. Hogy megfeleljünk ennek az elvárásnak (ami egybeesik érdeklôdésünkkel), azt a célt tûztük magunk elé, hogy lehetôvé tegyük Magyarországon különbözô öröklôdô betegségek és rizikófaktorok molekuláris genetikai diagnosztikáját. A következô témákban végeztünk vizsgálatokat: 2. típusú multiplex endocrin neoplázia (MEN2), hemofília A és B, az V. faktor Leiden mutációjának elemzése és öröklôdô hemokromatózis. A MEN2 szindrómák esetében a gyakran mutációt szenvedô kodonokat vizsgáltuk meg a RET protoonkogénben PCR-RFLP-k és DNS szekvenálás kombinációjával a nemzetközi ajánlásoknak megfelelôen. A 65 család közül mind a 14 klinikailag öröklôdônek mutatkozó esetben kimutattunk mutációt, az 51 sporadikus esetben pedig egy alkalommal sem. Megelôzô pajzsmirigyeltávolítással a mutációval rendelkezô, de még tünetmentes páciensek várható élettartama megegyezik az átlagossal, ami aláhúzza a megelôzô orvoslás jelentôségét. Hemofília programunkban célunk olyan stratégia kidolgozása volt, amelyel az érintett magyarországi családok túlnyomó többségének carrier és prenatális diagnózist tudunk biztosítani. Ezt a feladatot a leggyakoribb mutáció direkt kimutatásával, valamint az általunk kiválasztott polimorf markerek vizsgálatával értük el, amelyekkel minden ezt igénylô családnak diagnózist tudtunk nyújtani (85 veszélyeztetett nô az 50 hemofília A családból és 20 veszélyeztetett nô a 7 hemofília B családból). A trombózis egyik rizikófaktorának, az V. faktor Leiden mutációjának, és a hemokromatózisra hajlamosító két, a HFE génben található mutációnak elemzésekor a mutációk allélfrekvenciáját állapítottuk meg a magyar populációban (Leiden mutáció:5,7%, hemokromatózis C282Y: 3,8%, H63D: 12,3%). Ezek összhangban vannak az európai adatokkal. A vizsgálatok egyéni eredményei a prevencióhoz nyújtanak segítséget.

3 Bevezetés Az orvostudományban a legutóbbi tíz év legnagyobb tudományos szenzációit a Humán Genom Project befejezésén kívül egy-egy betegség-gén felfedezése, klónozása jelentette. A gén azonosítása után ez az alapkutatási eredmény három féle úton hasznosítható : a génterápia és a genetikai eredményeken alapuló funkcionális terápia túl van az elsô b ztató eredményeken, mig a DNS diagnosztika nyújtotta lehetôségeket egyre szélesebb körben használják. A DNS-diagnosztikában az a tudományos eredmény, amely a betegség-gén azonosításához vezetett, azonnal hasznosítható. A DNS-diagnosztika célja lehet az, hogy a mutáció - vagyis a genotipus - és a betegség lefolyása, súlyossága - vagyis a fenotipus - közötti összefüggések feltárásával optimális terápiát ill. életmódot lehessen kialkítani. Súlyosabb, csak igen nehezen befolyásolható öröklôdô betegségek esetében az érintett családok gyakran igénylik a prenatális, tehát a magzati korban elvégezhetô diagnosztikát. Rendkivül fontos a mutációt hordozó, de egészséges családtagok azonosítása (carrier diagnosztika), illetve a beteg nem hordozó családtagjainak megszabaditása a betegség lehetôségének fizikai és lelki terheitôl. A DNS diagnosztikának ezt a sokrétûségét jól példázza a MEN2, a hemofilia A és B, a hemokromatózis és az V. faktor Leiden mutációjának alább bemutatott vizsgálata. Ahogy egyre több humángenetikai ismeretre teszünk szert, úgy válik egyre fontosabbá, hogy tudásunk etikai, jogi és szociális hatásait is elemezzük, tisztábban lássuk a benne rejlô lehetôségeket és veszélyeket - és úgy tudjuk kiaknázni az elôbbieket, hogy az utóbbiakat elkerüljük. A dolgozatban tárgyalt kórképek áttekintése 2. típusú multiplex endocrin neoplázia (MEN2) A medullaris pajzsmirigy (thyroid) carcinoma (MTC) a pajzsmirigy kalcitonint termelô parafollikuláris sejtjeit érinti. 75%-ban sporadikusan fordul elõ, 25%-ban azonban a daganatot okozó hibás gén öröklõdése mutatható ki [2,3,4]. Az autoszomális, domináns öröklésmenetet követõ MTC három jól definiált formában (endokrin kórképben, illetve

4 endokrin szindróma részjelenségeként) jelentkezik. Ezek: a MEN2A szindroma (MTC, phaeochromocytoma és hipeplázia vagy adenoma által kiváltott mellékpajzsmirigytúlmûködés), MEN2B szindróma (MTC, phaeochromocytoma és jellegzetes stigmák, mint pl. marfanoid megjelenés, nyálkahártya neuromák az emésztõrendszerben, cornealis ideg megvastagodása, fog- és csontanomáliák) és az egyéb tünetekkel nem kísért familiáris MTC (FMTC). Az öröklõdõ kórformák közül leggyakoribb a MEN2A-, melyet az FMTC és a MEN2B szindróma követ a gyakorisági sorrendben [4]. Az öröklôdô kórformák hátterében a RET protoonkogén mutációi állnak (lásd alább). Az International RET Mutation Consortium (IRMC), - mely 13 nyugat-európai ország 18 centrumát foglalja magában, azokat az eseteket sorolja klinikailag az öröklôdô (MEN2A, FMTC vagy egyéb) kategóriába, ahol a családban legalább két MTC eset elôfordul, vagy egy MTC eset, de szövettanilag bizonyíthatóan az MTC mellett elôfordul phaeochromocytoma és/vagy hiperparatireoidizmus. A többi eset klinikailag sporadikusnak tekinthetô. Az MTC biokémiai diagnózisát a kalcitonin- vizsgálat biztosítja. Megfigyelték azonban, hogy RET mutáció normális kalcitoninszint mellett is elõfordulhat (fals negatív esetek), így a szérum kalcitoninszint meghatározás nem jelent 100%-os biztonságot. A szûrés során fals pozitív eseteket is észleltek tehát kismértékû kalcitoninszint-emelkedés nem jelenti teljes bizonyossággal, hogy a kiszûrt személy hordozója valamely, a betegségre jellemzõ mutációnak. A biokémiai szûréseket az 35 éves korig évenként, azt követôen 3 évenként ajánlják végezni. Ez a gyakoriság nagyon komoly pszichés terhet jelent, különösen a gyermekek számára, továbbá az egészségügy számára is komoly anyagi tehertétel. Az öröklõdõ MTC szindromák mintegy 95%-ában a RET protoonkogén néhány mutációja felelõs a betegségért. A 21 exont tartalmazó RET protoonkogént a 10. kromoszóma pericentromerikus régiójára (10q11.2) lokalizálták. A gén egy tirozin-kináz receptort kódol. MEN2A-s és FMTC-s családokban csak a betegséget hordozó családtagok RET protoonkogénjében található germ-line mutáció. Az esetek túlnyomó többségében öt cisztein egyikének kicserélõdésérõl van szó. Ezek a 10. exonban a 609-es, 611-es, 618- as és 620-as pozícióban, illetve a 11. exonban a 634-es pozícióban találhatók, a fehérje extracellularis, membránhoz közeli régiójában. A MEN2A-s családok 95%-ában és az

5 FMTC-s családok 85%-ában kimutatható volt a fenti mutációk valamelyike. A leggyakoribb a 634-es pozíciójú ciszteint kódoló tripletben (TGC) bekövetkezõ mutáció (a MEN2A-s családok 80%-a, az FMTC-s családok 50%-a). A 634-es kodon bázisainak minden lehetséges kombinációját leírták már betegekben. Ebben az aminosavban bekövetkezõ bármilyen változás egyértelmûen összefüggésbe hozható a MEN2A szindromát kísérõ phaeochromocytoma és hiperparathireoidizmus kialakulásával. Ismeretes a 768-as és a 804-es kodon ritkán elõforduló mutációja is. A RET mutációk egyéb betegségekben is kimutathatók. Ilyen a papilláris pajzsmirigy karcinomák mintegy 40%-a, melyekben a RET gén átrendezôdései mutathatók ki, vagy az autoszomális recesszív Hirshprung betegség (HSCR), melyben a RET mutációk (deléciók, frame shift, ponmutációk) a génben elszórtan találhatók. A HSCR mutációk inaktiváló (loss of function) mutációk, így a fenotípust a csökkent mennyiségû mûködôképes RET géntermék alakítja ki. Ezek az adatok arra mutatnak, hogy a RET génben elôforduló mutációk különbözô folyamatok során kialakuló változatos fenotípusokhoz vezetnek, így az egy gén - több betegség vizsgálatok és genotípus-fenotípus tipus tanulmányok modelljévé válhat. A RET tirozin-kináz receptort kódol, mely a platelet-derived growth factor receptor (PDGF) fehérjecsaládba tartozik. A RET az idegi eredetû sejtek proliferációjában, differenciálódásában és vándorlásában játszik szerepet. Normálisan a ligand megkötése a receptor dimerizációját és aktiválódását eredményezi. Eddig minden MEN 2 mutációról kimutatható volt, hogy a RET ligandtól független, állandó aktiválódását okozza. Ez úgy jöhet létre, hogy az a cisztein, amely normál esetben intramolekuláris diszulfidhidat alakítana ki a mutáció által más aminosavra cserélt ciszteinnel, szabaddá válik, és egy másik RET mulekula szabaddá vált ciszteinjével kapcsolódik, azaz aberráns, intermolekuláris diszulfid hidat hoz létre. Így alakulhat ki a ligand jelenlététôl független homodimerizáció (ami a receptor-ligand kötés imitációja) és ezáltal a RET aktivációja. A MEN2B mutációk viszont a tirozin-kináz szubsztrát specificifitását változtatják meg.

6 A aktíváló RET mutációk sematikus ábrázolása A hemosztázis három öröklôdô kórképe: hemofília A, hemofília B és az V. faktor Leiden mutációja A hemosztázis a vér azon képességét jelenti, hogy egészséges esetben az érpályában megtartja folyékonyságát, abból kikerülve azonban elveszíti azt, ún. véralvadékot képez. Az ezt fenntartó biokémiai reakciók egyensúlyának bármilyen irányú felborulása kóros állapotokhoz vezethet. A csökkent véralvadási képesség vagy az alvadék fokozott oldódása vérzékenységgel járó betegségeket (hemorrágiás kórképek) okozhat, a fokozott alvadékképzôdés vagy az alvadékoldódás gátoltsága trombózishoz vezethet. Az általunk vizsgált kórképek közül a hemofíliák az elôbbi, míg az V. faktor APC rezisztenciát okozó Leiden mutációja az utóbbi csoportba tartozik. Hemofília A A hemofília A (HA) - a VIII. véralvadási faktor szintjének és/vagy aktivitásának csökkenése - a leggyakoribb súlyos öröklôdô véralvadási zavar, amely minden 5000 fiúgyermekbôl egyet érint. A vérzékenység felismerése nem újkeletû, elôször az ôsi zsidó szokásról, a körülmetélésrôl írva Juda rabbi említi a babilóniai Talmudban, az idôszámításunk szerinti második században.

7 A betegséget klinikailag elhúzódó vérzés, izületek, izmok közötti vérzés jellemzi, melynek manifesztációja és súlyossága a beteg maradék VIII. faktor aktivitásától függ. A betegek - a mért VIII. faktor aktivitás alapján - három csoportba sorolhatók (súlyos [<1%], közepes [1-5%], enyhe [6-30%]). A hemofília A betegek kb. 50%-a súlyos hemofíliás, akik 95%-ában nincs VIII. faktor, és csak 5%-ukban van jelen inaktív VIII. faktor. Az oki terápiát (faktorpótlás) a rekombináns VIII. faktor készítmények jelentik. Az ilyen készítmények in vivo féléleideje kb 12 óra. Ez a kezelés általában hatásos, azonban a HA betegek 15%-a elôbb-utóbb antiestet termel a beadott faktor ellen (inhibítort), ami a további kezelést megnehezíti. A hemofíliás betegek faktorpótlásának teljes költsége hazánkban évente meghaladja az egymilliárd forintot. Napjainkban Magyarországon több, mint 800 hemofília A beteget tartanak nyilván. A betegség különbözô mértékben, esetenként jelentôsen csökkenti az élettartamot és rontja az életminôséget. A HA betegség X kromoszómához kötött módon, recesszíven öröklôdik. A VIII. faktor génje - amelynek mutációi a betegséget okozzák - az X kromoszóma hosszú karjának disztális végéhez közel található (Xq28), mérete 186 kb. A génrôl 9 kb-nyi mrns készül, ami egy 2332 aminosav nagyságú fehérjét kódol. A fehérje aminosav szekezete hasonlóságot mutat a cöruloplazmin és az V. faktor szerkezetével. A VIII. faktor génje (F8C) még két átíródó gént tartalmaz a legnagyobb, a 39 kb hosszúságú 22. intronjában; ezek az F8A és F8B. Az F8A, mely ellentétes irányban kódol, mint az F8C, egy rövidebb, intronmentes szakasz, mely egy int22h-1-nek nevezett 9,5 kb nagyságú szakasz része. A VIII. faktor génjének 22. intronján kívül ez a szakasz még két kópiában megtalálható a génen kívül, attól kb. 300 és 400 kb-nyira 5' (telomerikus) irányban (int22h-2 és int22h-3). A három kópia 8 kb-nyi DNSszekvenciáját összehasonlítva az azonosság 99,9%-os. Megállapították, hogy az extragenikus szakaszokat határoló régiók azonosak és különböznek az intragenikus szakaszt határoló régióktól. Az int22h-1 és az egyik extragenikus kópia között bekövetkezô intrakromoszomális homológ rekombináció eredményeként egy speciális mutáció (inverzió) jön létre, ami a VIII. faktor génjét két részre osztja: egy 1-22 exont tartalmazó és egy exont

8 tartalmazó részre, amelyek ellentétes orientációjúak az inverziós kromoszómán. Így arról VIII. faktor fehérje nem képzôdhet. A VIII. faktor gén inverziójának mechanizmusa A súlyos betegek kb. felében az inverziós mutáció található meg Az inverzió kimutatása sokáig kizárólag restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus (RFLP) módszerrel, Southern blot technika segítségével történt. Programunkban dr. Andrikovics Hajnalka (Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet, laboratórium vezetô: dr. Tordai Attila) munkáját dícséri a módszer bevezetése a HA genetikai diagnosztikájába. Újabban az inverzió kimutatására PCR módszert fejlesztettek ki, melyet laboratóriumunkban is használunk. Az inverzió-negatív súlyos esetekben és a nem súlyos esetekben nem találtak ilyen gyakori mutációt. Eddig több, mint 600, a VIII. faktor génjét érintô mutációt fedeztek fel, az ismeretlenek száma azonban ennél valószínûleg sokkal nagyobb. Ezek megkeresése azonban rutinszerûen nehezen kivitelezhetô, ezért a géninverzió, mint leggyakoribb mutáció kimutatása (direkt módszer) mellett szükségessé vált olyan, indirekt módszerek bevezetése, amelyek a mutáció fajtájától függetlenül képesek a gének öröklôdésének nyomonkövetésére. Az indirekt módszerek családvizsgálaton alapulnak, tehát nem elég csak a beteg vizsgálata, a család együttmûködésére is szükség van.

9 Két különbözô típusú indirekt módszert alkalmazunk. Az RFLP elemzésnél a markerként használt polimorfizmus egy restrikciós hasítási hely megléte vagy hiánya, a mikroszatellita elemzésnél pedig egy rövid szekvencia szakasz (repeat) különbözô számú ismétlôdése. Hemofília B A hemofília B (HB), más néven Christmas betegség az öröklôdô vérzékenység egyik formája. A HB elôfordulása 5-ször ritkább a HA-nál, HB-s betegek a vérzékenyek mintegy 15%-át teszik ki, a születési gyakoriság a fiúk között 1: Magyarországon körülbelül 200 beteget tartanak nyilván. Az A és B hemofíliás betegek klinikailag hasonlóak. A betegséget a IX. véralvadási faktor génjének mutációi okozzák. A IX. faktor egy 415 aminosavnyi glikoprotein. A véralvadási kaszkád eszenciális komponense, az extrinzik és intrinzik út közös résztvevôje, szerin proteáz. A IX faktor génje szintén az X kromoszóma hosszú karján található, az Xq27.1 régióban. 33,5 kb nagyságú, 8 exont tartalmaz (jelölésük a - h), ezek mérete 25 és 548 bp között változik. A gén szekvenciája 1985 óta ismert. A hemofília B öröklôdése a hemofília A-hoz hasonlóan nemhez kötött, recesszív. Terápiája a IX. faktor pótlásán alapszik. Eddig több, mint 500, a IX. faktor génjét érintô mutációt fedeztek fel, az ismeretlen mutációk száma azonban ennél valószínûleg sokkal nagyobb. Ezeknek a mutációknak a gyakorisága egyenként nagyon kicsi, így diagnosztikai célra a direkt mutációelemzés mellett (szekvenálás) indirekt módszerek kínálkoznak. Az V. faktor Leiden mutációjának elemzése Az aktívált protein C (APC) olyan szerin proteáz, mely az V-ös és VIII-as véralvadási faktorok inaktiválódásában játszik szerepet. Az APC rezisztencia a kaukázusi eredetû népeknél elôforduló fiatalkori idiopátiás mélyvéna trombozisok csaknem felében kimutatható, és tüdôembólia kialakulásához is vezethet ben vették észre, hogy az akívált protein C rezisztencia hátterében az esetek 90%-ában az V. faktor egy pontmutációja áll. A Leiden mutáció G1961A missense nukleotidcsere, amely arginin -

10 glutamin aminosavcserét eredményez (Arg506Gln). A mutáció az aktívált protein C kapcsolódási pontjánál található. Így az aktívált protein C (APC) nem képes elhasítani az aktívált V. faktort, ami az inaktiválódás zavarát okozza, ezért a keringésben több aktívált V. faktor marad, a véralvadás trombotikus irányba tolódik el. Autoszómán öröklôdik (1q23), az európai populációban elôfordulási gyakorisága heterozigóta formában 6-8%, tehát Magyarországon is ezer embert érint ez a mutáció. Homozigóta formában kb. 1/800 a gyakorisága. A homozigóták mélyvénás trombózisra való kockázata tízszer magasabb, mint a heterozigótáké, és kilencvenszer magasabb, mint a mutációval nem renelkezôké. A trombofíliás betegcsopotban ez a leggyakoribb örökletes tényezô (rizikófaktor). Heterozigóták trombózisra való kockázata kockázata hétszer magasabb a normál populációénál, orális kontraceptívumokat szedve pedig negyvenszer magasabb (tízszer magasabb, mint a mutációval nem rendelkezô, fogamzásgátlót szedô nôké, hiszen az önmagában is négyszeresére emeli a kockázatot). A kezelés hospitalizáció során beállított heparin és orális antikoaguláns (K-vitamin antagonisták) terápián alapul. A vizsgálat potenciális következményeként az orálistól eltérô fogamzásgátló módszer használata javasolt. Öröklôdô hemokromatózis Az öröklôdô hemokromatózis (HH) a jelenleg ismert leggyakoribb genetikai eredetû betegség. Az a nézet alakult ki, hogy a HH ritka klinikai elváltozás, pedig gyakorisága jóval meghaladja a cisztikus fibrózis, phenylketonuria és az izom dystrophiák együttes elôfordulását. Autoszomához kötött reciesszív módon öröklôdik, manifesztációja nemfüggô: férfiakban ötször gyakoribb, mint nôkben ban Feder és mtsai. azonosítottak egy új gént (HFE), amelynek egyik pontmutációját (a 282. cisztein aminosav tirozinra történõ cseréjét, C282Y) az azóta elvégzett vizsgálatok során a hemokromatózisban szenvedõ betegek %-ában homozigóta formában sikerült kimutatni. Az európai populációkban a homozigóta gyakoriság 0,1-0,3 %, a heterozigóta gyakoriság az északeurópai populációban kb. 1/10. A gén egy másik gyakori változatának (hisztidin-aszpartát csere a 63. aminosavban, H63D) kapcsolatát a hemokromatózissal a klinikai tanulmányok nem igazolták egyértelmûen. A H63D mutáció a C282Y heterozigóta,

11 hemokromatózisban szenvedõ betegeknél gyakrabban fordul elõ, mint a normál populációban, de a H63D pontmutációt hordozó és a C282Y/H63D kettõs heterozigóta genotípusú egyének a normál populációban is gyakoriak. Az elsôdleges zavar a vasfelszívódásban keresendô, pontosabban a bélhámsejtek basolaterális felszínérôl a vérbe történô mucosalis vas transzportban. A vasfelszívódás fokozódik, amely szabályozható kiválasztó mechanizmus hiányában nagy mennyiségû vas lerakódásához és következményes szövetkárosodáshoz vezet, fõként a parenchymás szervekben. A C282Y mutációt homozigóta formában hordozókban, - a progresszív vaslerakódás miatt - rendszerint éves koruk körül a hemokromatózis tünetei jelentkeznek (fáradékonyság, asthenia, izületi fájdalom, impotencia, májmegnagyobbodás, bôrpigmentáció, a szénhidrát háztartás felborulása), amelyek hátterében visszafordíthatatlan szervkárosodások állnak (pl. májcirrhosis és/vagy - carcinoma, arthropathia, a pancreas-szigetsejtek diabetes mellitushoz vezetô károsodása, hypogonadotrop hypogonadismus, cardiomyopathia). A HFE gén által kódolt fehérje elsõdleges szerkezete az MHC I. osztályba tartozó fehérjékkel, (azaz a HLA-A, B és C- vel), mutat rokonságot. In vitro kísérletek igazolták, hogy a HFE-fehérje komplexet képez a vasanyagcsere egyik kulcsfontosságú elemével, a transzferrin receptorral, és csökkenti a receptor transzferrin kötõ képességét. A C282Y pontmutáció jelenlétében egy fontos intramolekuláris diszulfid kötés nem jöhet létre, és így a fehérje nem képes a 2-mikroglobulinnal kapcsolódni, nem expresszálódik a sejtfelszínen, ezért természetesen a transzferrin receptorral sem kapcsolódik. A HH betegek átlagos élettartama mintegy 5-7 évvel rövidebb a megfelelô populációra jellemzô átlagnál. Amennyiben a betegség diagnózisára még a tünetek megjelenése, tehát a szervkárosodások elôtt lehetôség nyílik (preszimptomatikus diagnózis), akkor egyszerû terápiával - rendszeres véna sectioval - a hemokromatózis manifesztációja elkerülhetô. Eddig a diagnózis a vérmitából történô szérum vas, ferritin, transferrin szaturáció és teljes vaskötô kapacitás meg nem határozott kombinációján, és ezek kóros értékei esetén végsô soron májbiopszián és hisztokémiai festésen alapult.

12 A humán ABC-transzporter fehérjék felépítése és szerepük különféle öröklôdô betegségekben Az ABC-fehérjék génjei minden eddig vizsgált élôlény genomjában elôfordulnak, és minden esetben az egyik legnagyobb fehérjecsaládot alkotják: pl. az E.coli-ban több mint 80, az C.elegans-ban 58, a D. melanogaster-ben pedig 78 ABC-transzporter gént azonosítottak a genom- szekvenálás eredményeként. Közös molekuláris arhitektura és hasonló mûködés jellemzô a család tagjaira. Két alapvetô szerkezeti elem, a transzmembrán domén (TM) és a katalitikus centrumot hordozó ABC-domén (ATP Binding Cassette) változatos kombinációból épülnek fel. A minimális funkcionális egység két TM- és két ABC-domént tartalmaz, amelyek a prokarióták világában gyakran különbözô gének termékei. Ezek a fehérjék olyan integráns membrán-fehérjék, amelyek az ATP-hidrolízis energiáját használják fel a transzmembrán transzporthoz (aktív transzporterek), illetve néhány reprezentánsuk más funkciót lát el. A család a nevét a mintegy aminosavból álló ABC egységrôl kapta, amely három jellegzetes konzervált peptid-motivumot tartalmaz. A Walker A (más néven P-loop, vagy glicingazdag hurok) és a Walker B a lineáris szekvenciában egymástól távol, általában aminosavnyi távolságban foglalnak helyet. Mindkettô része a katalitikus centrumnak, és ezek a peptid-szakaszok számos más ATP-kötô, ATP-t hidrolízáló fehérjében is megtalálhatóak. A harmadik jellegzetes motivum, az ABC-signature, csak ebben a fehérjecsaládban fordul elô, a Walker A és a Walker B szegmens között helyezkedik el, és jelenléte diagnosztikus a fehérjecsalád tagjaira. A transzmembrán domén (TMD) általában hat transzmembrán helixet tartalmaz, a szekvenciális azonosság foka ezekben a régiókban lényegesen alacsonyabb, mint az ABC-doménekben. Az ABC-fehérjék mûködésének általános jellemzôje, hogy az ATP kötése és hidrolízise jelentôs konformációs változásokat idéz elô a fehérjében. Az ATP hidrolízise az ABCdoménekben elhelyezkedô aktív centrumokban történik, és a konformációváltozás mintegy áttrejed a transzmembrán doménekre. Az esetek többségében ennek a változásnak az eredményeként kerül sor a szubsztrát transzportjára (aktív transzporterek, pl. a multidrog transzporterek), más esetekben ez a konformációs változás a TMD-ek által kialakított csatorna nyítását és zárását szabályozza (kloridion csatorna, CFTR) vagy pedig

13 más csatornák mûködését szabályozza (sulfonylurea receptorok, SUR1 és SUR2, a SUR1 pl. a sejten belüli ATP-koncentrációtól függôen regulálja a hasnyálmirigy -sejtjeinek ATP-függô K-csatornáit). Az evolució során tehát az ABC-fehérje szerkezet, amelyre az ATP-val való kölcsönhatás (a legtöbb esetben hidrolízis) és az azzal együttjáró konformációs változás a jellemzô, különféle molekuláris szintû megoldások révén találta meg változatos élettani funkciójóit. Felkérést kaptunk, hogy egy tanulmányban összefoglaljuk a humán ABC fehérjékrôl addig megismerteket. Ebben a review-ban részletesen feldolgoztuk az ABC fehérjék génjeihez kapcsolódó öröklôdô betegségeket.

14 Célkitûzések 2. típusú multiplex endocrin neoplázia (MEN2) Munkánk célja a magyarországi MTC-s kórképek genetikai hátterének (öröklôdô, illetve sporadikus voltának, a mutáció természetének) felderítése. A probandokban kimutatott mutáció meglétét a családtagokban is megvizsgáljuk. Pozitív eredmény esetén profilaktikus pajzsmirigyeltávolítás javasolt, ismert mutációjú családban negatívnak bizonyuló egyénnél pedig a rendszeres ellenôrzô vizsgálatok elhagyhatók. A betegek és családtagjaik vérmintáiból DNS-bank létrehozását terveztük a diagnosztika és a további kutatások érdekében. Hemofília A és B Olyan diagnosztikai stratégiát kívántunk kidolgozni és bevezetni, amelynek segítségével egyrészt az érintett, és ezt igénylô családokban a tünetmentes, de mutáns VIII. vagy IX. faktor gént hordozókat azonosíthatjuk (carrier-diagnosztika), másrészt ki tudjuk mutatni, hogy a hordozók fiúmagzatai a betegségért felelôs gént tartalmazó X kromoszómát örökölték-e édesanyjuktól (prenatális diagnosztika). Céljaink között szerepel a hemofilia A és B betegek mintáiból álló DNS bank létrehozása, valamint, hogy elérhetôvé tegyük a rutin diagnosztika számára az inverzió egyszerûbb kimutatását lehetôvé tevô PCR módszert, továbbá a IX. faktor gén diagnosztikai célú szekvenálását. Az V. faktor Leiden mutációjának elemzése A Leiden mutáció magyarországi elôfordulási gyakoriságának megismerését tûztük ki célul. Öröklôdô hemokromatózis Munkánk célja egyszerû és rutin körülmények között alkalmazható módszer kidolgozása volt a HFE gén C282Y és H63D pontmutációinak kimutatására. A módszerek segítségével adatokat kívántunk gyûjteni a C282Y és H63D mutációk hazai allélfrekvenciájára vonatkozólag a normál populációban és a májcirrhosisban szenvedõ betegek körében. Ezen túlmenõen a mutáció analízissel bõvíteni kívántuk az öröklõdõ hemokromatózis differenciáldiagnosztikai lehetõségeit.

15 ABC fehérjék A humán ABC fehérjékkel kapcsolatos eddigi ismeretek összefoglalása. Eredmények és megbeszélésük 2. típusú multiplex endocrin neoplázia (MEN2) A vizsgálatot dr. Ésik Olgával (Országos Onkológiai Intézet) együttmûködve végeztük. DNS bank létrehozása A genetikai szûrõvizsgálatokat az elmúlt 30 évben Magyarországon jelentkezett új MTC-s betegekre terjesztettük ki. Az Országos Onkológiai Intézetben jelenleg több, mint 400 személyt (több, mint 150 proband-et és családtagjaikat) tartunk nyilván. Ezen betegeknek teljes kórtörténete és családi kapcsolataik ismertek. A többi beteg felkutatását megkezdtük. MEN2B A lényegesen ritkábban elôforduló MEN2B gyanúja esetén a 918. kodont ellenôriztük szekvenálással. Módszerünk ellenôrzéseképpen egy MEN2B-s proband vizsgálatát végeztük el. Megelôzô külföldi diagnózisból ismert volt a betegségre jellemzô mutációja (Met918Thr), mely általunk is igazolódott. MEN2A/FMTC MEN2A/FMTC gyanúja esetén az általunk felállított vizsgálati rend alapján - tekintettel a kodon mutációinak gyakoriságára - elõször a 634-es kodont elemeztük genomiális DNSmintából polimeráz láncreakció segitségével végzett restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus (PCR-RFLP) módszerrel és a családra jellemzõ mutáció DNSszekvenálással történõ kimutatásával. Abban az esetben, ha a 634. kodonban nem

16 találtunk mutációt, a 10. exon négy kérdéses ciszteint kódoló tripletjét vizsgáltuk meg szekvenálás segítségével. A klinikailag MTC-n kívül más, MEN2A-ra, illetve FMTC-re utaló jellelrendelkezô családokban a 13 exonban található 768. illetve a 14-es exonban található 804. kodont is megvizsgáltuk szekvenálással. A 634-es ciszteint kódoló tripletben elõforduló összes lehetséges pontmutáció kimutatható 4 PCR-RFLP kombinatív használatával. A munka elsô fázisában 65 medulláris pajzsmirgy carcinomában szenvedô, egymással rokoni kapcsolatban nem álló proband vizsgálatát végeztük el, akiknek MEN2B-re utaló tüneteik nem voltak. 14 probandban mutattunk ki mutációt (21,5%), ami megfelel annak az irodalmi adatnak, mely szerint az MTC-k 25%-a öröklôdô forma. A második lépésben a 14 - valamely RET mutációra nézve pozitív - proband családtagjait vizsgáltuk meg arra nézve, hogy rendelkezik-e a proband mutációjával. Az érintett probandok rokonai között 25 pozitív esetet találtunk, az ismert mutációjú családokban mutációtól mentesnek bizonyult 18 családtag. Eddig 7 különbözô mutációt azonosítottunk, 5-t a 634-es kodonban, 1-1 -t a 609. és a 804. kodonban. A 65 megvizsgált proband családjából 14 bizonyult az IRMC által meghatározott kritériumok alapján klinikailag familiáris (MEN2A, FMTC vagy egyéb) esetnek, azaz ebben a csoportban legalább két MTC fordult elô, vagy legalább egy MTC és szövettanilag bizonyíthatóan pheo vagy HPT. Mind a 14 családban kimutatható volt a betegséget okozó mutáció a RET protoonkogénben (100%). Az 51 klinikailag sporadikus esetben a fenti kodonokban nem volt mutáció. A TGC609TCC mutáció eddig nem szerepelt a RET mutációk adatbázisában, mi irtuk le elôször. Laboratóriumunkban lehetôvé tettük az öröklôdô pajzsmirigyrák genetikai diagnosztikáját. A diagnosztika PCR-RFLP-ken és exonamplifikációt követô DNSszekvenálás kombinációján alapszik. A pozitív eredménnyel zárult vizsgálatok alapján a betegek és családtagjaik számára genetikai diagnózist nyújtottunk, ami lehetôvé tette preventív pajzsmirigymûtétek végzését, illetve a csak normál alléllel rendelkezô családtagokban a további ellenôrzések

17 elhagyását. A RET protoonkogén mutáns allélját hordozókban az MTC kialakulását megelôzôen végzett mûtét után a várható túlélés az átlagnépességhez hasonló. Eredményeink szerint mutáció a Ret protoonkogén vizsgált kodonjaiban szinte kizárólag azokban a családokban fordul elô, melyek klinikai tünetei szigorúan megfelelnek az IRMC által felállított kategóriáknak, azaz legalább 2 MTC vagy MTC és szövettani vizsgálattal igazolt pheo és/vagy HPT fordul elô a családban. Várható az is, hogy kevésbé kiterjesztett endokrin mûtéteket lehet alkalmazni a genetikai diagnózissal azonosított betegeken. A konzervatívabb mûtétek a radikálisabb beavatkozásokhoz képest a betegek életminôségét elônyösen befolyásolják. A genetikai és onkológiai szempontból teljesen kivizsgált, örölôdô MTC-s családokban a betegséget okozó mutációk megismerését követôen a klinikai tünetek (fenotípus) és a genetikai eltérések (genotípus) összehasonlító elemzésére is sor kerülhet. Az ismert RET mutációt mutató családok tagjaiban a genetikai vizsgálat elvégzése negatív eredmény esetén is óriási jelentôségû, mert a családtagok a genetikai szûréssel megszabadulnak a fenyegetettség és a rendszeres onkológiai ellenırzés lelki terheitôl. Az egészségügy számára is nagyságrenddel kisebb tehertétel a genetikai vizsgálat elvégzése, mint az egyébként évenként szükséges laboratóriumi és idôszakos képalkotó diagnosztikai vizsgálatok. Továbbá a DNS-bankunk létrehozása többek között azt a célt is szolgálja, hogy a jelenleg negatívnak bizonyult eseteket késôbb, az esetleges újabb germinális pontmutációk azonosítása után újra meg lehessen vizsgálni. A magyarországi örölôdô MTC-s esetek genetikai feltérképezése módot ad más országok népességében észlelt hasonló, örölôdô kórképekkel való komparatív analízisre. Hemofília A és hemofília B A vizsgálatokat az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézetben dr. Nemes Lászlóval és dr. Tordai Attila laboratóriumával együttmûködve végeztük. DNS bank létrehozása Eddig 50 nyilvántartott magyar HA családból származó 257 genomiális DNS mintát (34 súlyos, 15 középsúlyos és 1 enyhe) és 7 HB családot elemeztünk, miután a kellô tájékoztatás után a vizsgálatba aláírásukkal igazolhatóan beleegyeztek. A betegeket

18 Magyarország egész területérôl küldték az Országos Haemophilia Központba. Lehetôség szerint az összes magyarországi hemofíliás család mintájából álló DNS bankot hozunk létre. Hemofília A Súlyos hemofília A Középsúlyos hemofília A A géninverzió kimutatása Nem BclI PCR-RFLP Souther blot technikával INFORMATÍV? INFORMATÍV? Nem IVS13CA marker Igen Igen INFORMATÍV? Igen Nem Carrier- és prenatális Igen P39CA marker diagnózis INFORMATÍV? Programunk felépítése Stratégiánk szerint a HA súlyos eseteiben elsô lépésként direkt mutációelemzést végzünk Southern blot módszerrel, hogy igazoljuk vagy kizárjuk az inverziót. Amennyiben ez negatívnak bizonyul, vagy nem alkalmazható, mert a betegség középsúlyos illetve enyhe, indirekt módszereket használunk. Az indirekt elemzések közül elôször a BclI PCR-RFLP vizsgálatát végezzük el, amely könnyen kivitelezhetô, viszonlag olcsó teszt. A BclI polimorfizmus a HA gén 18. intronjában található pontmutáció. Kétféle allélje lehetséges, az egyik tartalmazza a BclI restrikciós enzim hasítási helyet, a másik nem. Ezt követi az intragenikus IVS13(CA)n mikroszatellita elemzése, mely munka- és pénzigényesebb. Ez a mikroszatellita a gén 13. intronjában található dinukleotid repeat.

19 A vizsgált polimorfizmusok elhelyezkedése a VIII. faktor génjéhez viszonyítva Ellentétben a direkt mutációkimutatással, amely egyértelmû diagnózishoz vezet, az indirekt elemzéssel kapható információ mindig valószínûség jellegû, hiszen az addig egy kromoszómán öröklôdô marker és mutáció rekombináció útján különbözô kromoszómára kerülhetnek. Ez az esély azonban a két VIII. faktoron belüli markernél a teljes genomra számolt átlagos crossing over gyakoriságot figyelembe kevesebb, mint 0,2%. Bár a leginformatívabb marker a P39(CA)n (8 alléljébôl 5 allélfrekvenciája 21% és 12% között van, tehát egyenletes az eloszlása, és a heterozigóta arány a mi vizsgálati adatainkban 81% - lásd VII. táblázat), mégis ezt a polimorfizmust utoljára elemezzük, mert a VIII. faktoron kívül található, attól fél millió bázispárnyira 3' irányban, így a rekombináció a marker és a mutáció között nagyobb, ámbár még mindig kevesebb, mint 0,7%. Ahol a direkt mutációelemzés negatív volt, vagy nem alkalmazható, az indirekt markereket addig elemeztük, míg vagy mind a három használatára sor került, vagy legalább két informatív markert találtunk. Minden esetben a különbözô markerekkel végzett vizsgálatok alátámasztották egymást. Az elemzett családokban a markerek között rekombinációt nem detektáltunk. Programunk során minden potenciális esetben a hordozó vagy nem hordozó állapot megállapítható volt. Az összes hordozónak diagnosztizált esetben biztosítani tudtunk egy vagy több informatív diagnosztikai lehetôséget, vagyis vagy az inverzió kimutatható volt a családban, vagy egy vagy több polimorf marker informatívnak bizonyult.

20 Prenatális diagnózist csak fiúmagzatok esetén végeztünk. A Dr. Nemes László (Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet) által végzett genetikai tanácsadást erre a valószínûségi információra alapoztuk. Az inverzió kimutatása jelenleg túlnyomórészt BclI emésztés után Southern blot technikával történik. 34 nem rokon súlyos hemofília A családot elemeztünk. 5 családból csak az obligát carrier mintája állt rendelkezésre a beteg halála miatt. Abnormális mintázatot észleltünk 20 esetben (59%), ebbôl 16 disztális (az inverziósok 80%-a) és 3 proximális (az inverziósok 15%-a) inverzió volt, egy esetben pedig egy még nem elemzett mintázatot kaptunk. Az így nyerhetô erdmény az inverzió detektálására alkalmas, azonban a technika izotóp használatát igényli, hosszú ideig tart, és kivitelezése nehézkes, költséges, ezért vezettük be az inverzió PCR-en alapuló diagnosztikáját is. Normál esetben a 12 kb és 10 kb nagyságú, inverziós férfi esetében 11 kb és 10 kb, hordozó nô esetében pedig 12, 11 és 10 kb-nyi terméket kapunk. Így az inverzió típusa (proximális vagy disztális) nem különböztethetô meg, de ez a diagnózis szempontjából nem is lényeges. Eredményeink összhangban vannak a nemzetközi adatokkal: a BclI marker a mi tanulmányunkban 42,3%-ban volt informatív, (irodalmi adat 42%), ami az IVS13(CA)n polimorfizmusra nézve 62,5% (71%), és a P39(CA)n polimorfizmusra nézve 80,6% (84%). Összességében a 85 veszélyeztetett nôbôl 71-et vizsgáltunk meg indirekt módszerekkel. 20 veszélyeztetett nô inverziót hozdozónak, vagy inverziós családban nemhordozónak bizonyult és további vizsgálatuk nem volt szükséges. Néhányukon azonban az indirekt elemzéseket is elvégeztük, hogy a módszerek megbízhatósága ezúton is megerôsítést nyerjen. A direkt és indirekt módszerekkel kapott eremények mindig alátámasztották egymást. Hemofília B A hemofília B esetén nem fordul elô olyan mutáció, amely jelentôsen gyakoribb volna a többinél, így az egész gén megszekvenálásán kívül direkt mutációkimutatási módszert nem érdemes alkalmazni. Ezért carrier és prenatális diagnosztikai célra programunkban

21 négy polimorfizmus (HhaI, TaqI, DdeI, XmnI) vizsgálatát végeztük el a HB-s családokban. Kimutatásukat PCR segítségével végezzük. Taq Hha Dde Xm 5 a b c d e f g h A vizsgált polimorfizmusok elhelyezkedése a IX. faktor génjéhez viszonyítva A heterozigóták aránya a polimorfizmusokra nézve a következô: 73% HhaI-re, 36% TaqIre, 23% XmnI-re és 21% DdeI-re. Az irodalom szerint az ezt a négy lókuszt felhasználó elemzés a családok 84%-ában informatívnak bizonyul. Ahol lehetséges volt, a diagnózis legalább két marker információin alapult. A markerekkel nyert eredmények minden esetben alátámasztották egymást. A 7 elemzett család mind a 20 veszélyeztetett nôtagjának hordozó illetve nemhordozó státuszát meg tudtuk állapítani. Egy esetben azonban további (prenatális) diagnózisra alkalmas markert nem találtunk, tehát a prediktív tesztek szempontjából a program eredményessége 95%. Prenatális diagnózis egy esetben vált szükségessé. Csak a HhaI marker volt informatív, a fiú magzat betegnek bizonyult. Programunk alapján egy gyakori mutáció (inverzió) és három polimorfizmus elemzésével (BclI, IVS13(CA)n, P39(CA)n) genetikai diagnózist és a további prenatális diagnosztika lehetôségét nyújtottunk minden ezt igénylô HA családnak. HB esetén minden veszélyeztetett nônek genetikai diagnózist tudtunk nyújtani, a négy marker prenatális diagnózisra 95%-ban volt alkalmas. Laboratóriumunk megalapozta egy igen informatív

22 megbízható és költségkímélô carrier és prenatális diagnosztikai módszer rutinszerû használatát, ami a genetikai tanácsadás szilárd alapjául szolgálhat. Direkt mutációelemzés: a IX. faktor génjének szekvenálása A elôfordulhat, hogy egy család nem informatív az általunk vizsgált markerek egyikére sem, így számukra az eddig leírt módszerekkel diagnózis nem adható. A sporadikus családokban az anya hordozó státusza kérdéses, ami korlátozza a diagnózis lehetôségeit. Az analízis elvégezhetetlen, ha valamilyen okból a proband kulcsfontosságú reokonaitól nem rendelkezünk DNS mintával, mivel indirekt módszerekkel családok vizsgálhatók. Ezeket az akadályokat hidalja át a betegséget okozó genetikai hiba direkt megkeresése, a szekvenálás. A direkt és indirekt módszerek kombinációjával reményeink szerint az összes magyar hemofília B-s család számára diagnózist tudunk biztosítani. Szerencsére a IX. faktor génje nem túl nagy, (33,5 kb), mindössze 8 exont tartalmaz, melyek mindegyike egy PCR reakcióval amplifikálható, sôt a a b és c exon megsokszorozása egy reakcióban is elvégezhetô. 7 PCR-t követô szekvenálással tehát a kódoló régió szekvenciája megismerhetô. Az V. faktor Leiden mutációjának elemzése Az V. faktor aktivált protein C rezisztenciát okozó Leiden mutációjának (Arg506Gln) magyarországi allélfrekvenciájának megismeréséhez 132 rokoni kapcsolatban nem álló egyént vizsgáltunk meg. Ezek véletlenszerûen kiválasztott egyének, családi kapcsolatban nem állnak, intézeti dolgozók és HLA haplotípus meghatározásra érkezô nem rokon egyének. Sem a személyes egészségi állapot, sem a családban elôforduló betegségek kórtörténetét nem vettük figyelembe a kiválasztásnál. A projektet a dr. Tordai Attila vezette laboratórium hangolta össze (Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet). A HindIII PCR-RFLP módszerrel végzett molekuláris genetikai elemzéssel 13 heterozigótát (9,8%) és egy homozigótát (0,75%) azonosítottunk, amibôl az allélfrekvencia Magyarországon 5,7%-nak adódik. A következô vizsgálati csoportokban javasolt a Leiden mutáció szûrése: pozitív családi anamnézis esetén, ha a kórelôzményben trombózis szerepel, nagyobb mûtét elôtt (pl.

23 csípôprotézis beültetés), orális fogamzásgátló szedése elôtt, ösztrogén tartalmú hormonpótló kezelés megkezdése elôtt, Leiden mutációt hordozók családtagjainál. Öröklôdô hemokromatózis Vizsgálataink a betegségben szerepet játszó genetikai változások magyarországi allélfrekvenciájának megismerésére, továbbá betegcsoportok vizsgálatára irányultak. A munkát az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézetben dr. Tordai Attila vezetésével dr. Andrikovics Hajnalka fogta össze. A vizsgálati csoportok a következôk voltak: Kontroll csoport: 1271 véletlenszerûen kiválasztott, egymással rokoni kapcsolatban nem álló, egészséges, magyar egyén (994 véradó, [692 budapesti, 302 szegedi véradó]) és 277 az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézetben HLA-tipizáláson, ill. különbözô DNS vizsgálatokon részt vevô egyének: intézeti dolgozók, csontvelô donorok, apasági vizsgálat részvevôi, az ország egész területérôl). A C282Y mutációanalízist mind az 1271, míg a H63D vizsgálatát csak a 277 fôs csoportban végeztük el a normál allélfrekvenciák megállapítása céljából. Megvizsgáltuk a C282Y mutáció elôfordulási gyakoriságát 58 cirrhosis hepatis miatt vizsgált betegnél (15 nô, 43 férfi; átlagéletkor 56 év; az ALT, az AST vagy a GGT májenzimek közül legalább az egyik emelkedett volt valamennyi betegnél, diabetest 8 esetben lehetett igazolni). 45 betegnél az alkoholos eredet az anamnesztikus adatok alapján feltételezhetô volt. A hemokromatózis klinikai gyanúja ill. családvizsgálat céljából eddig 191 egyénnél (64 nô, 127 férfi, átlagéletkor 44 év) alkalmaztuk a mutációanalízist. A vizsgálat során a kérdéses génszakaszt polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáltuk. A C282Y mutációra nézve a kontroll csoportban (n=1271) 95 heterozigóta (7,5%) és 1 homozigóta egyént (0,1%) találtunk. A C282Y pontmutáció allélfrekvenciája 3,8 % ± 0,8 95% CI, amely a közép-európai értéknek megfelelõ, és beleillik a C282Y allélgyakoriság nyugatról kelet felé csökkenõ tendenciájába. A H63D pontmutációra nézve a kontroll csoportban (n=277) 58 heterozigóta (21%) és 5 homozigóta egyént (1,8%) azonosítottunk. A H63D allélfrekvenciája 12,3 % ± 2,8 95% CI, amely az európai átlagnak szintén megfelel. 277 egészséges egyén között 5 kettõs heterozigóta genotípusú

24 egyént találtunk, a C282Y heterozigóta egészséges egyének 16,6%-a (5/30) volt egyben H63D hordozó is. A cirrhosis hepatisban szenvedõ betegek közt (n=58) 2 C282Y heterozigóta (3,5%) egyént találtunk. A C282Y mutáció allélfrekvenciája 1,7% 2,4 95% CI, ezen belül az alkoholos eredetû májkárosodásban szenvedõknél 2,2 % 3,1 95% CI (n=45) volt. A cirrhosis hepatisben szenvedõ betegek csoportjában talált C282Y allélfrekvencia alacsonyabb a kontroll csoport allélfrekvenciájánál, de ez a különbség nem szignifikáns (p>0,05). A 191 hemokromatózis-gyanú ill. családszûrés miatt vizsgált egyén csoportjában 15 esetben találtunk C282Y homozigóta, 25 esetben heterozigóta genotípust. A 25 heterozigóta egyén közül 5 (20%) hordozta a H63D mutációt is. A C282Y homozigóta, ill. heterozigóta egyének családtagjainak vizsgálata során 1 homozigóta és 8 heterozigóta egyént azonosítottunk. Korai stádiumban az irreverzibilis szervi károsodások a kóros vasraktárak kiürítésére irányuló rendszeres terápiás vérlebocsátással megelõzhetõek, és megfelelõ kezelés esetén a homozigóta egyének várható élettartama normális lesz. A kontroll csoportunkban talált C282Y allélfrekvencia alapján Magyarországon körülbelül minden hétszázadik ( ) egyén homozigóta a C282Y mutációra nézve, azaz hajlamos a vasfelhalmozásra. Összefoglalásul megállapítható, hogy a HFE gén C282Y pontmutációjának analízise rutin laboratóriumban kivitelezhetõ, nem invazív módszer, amely nagymértékben segíti az öröklõdõ hemokromatózis diagnosztikáját, illetve differenciáldiagnosztikáját. Pozitív genetikai lelet esetén a kórisme nem kétséges, és az invazív májbiopszia is elkerülhetõ. Humán ABC fehérjék és öröklôdô kórképek Jelenleg 41 olyan humán ABC-fehérjérôl tudunk, amelynek teljes aminosav-szekvenciája megtalálható a megfelelô adatbázisokban (2001. májusi adat). Ezen kivül számos részszekvencia ismert Expressed Sequence Tag formájában, valamint néhány olyan gén, amely a humán genom szekvenálása során vált ismertté, de még végleges annotációja várat magára. Összesen 51 humán ABC fehérje ismert, melynek mintegy felét az elmúlt

25 két évben azonosították. Számos humán ABC-fehérje génjében elôforduló mutáció öröklôdô betegséget okoz. An inventory of the human ABC proteins cimmel review-t állítottunk össze (Klein et al., 1999), amely részletesen tárgyalja az 1999 májusáig megismert humán ABCfehérjéket, valamint a hozzájuk társuló genetikai kórképeket.

26 Köszönetnyilvánítás A hemofília A programot az OMFB támogatta, a MEN2 tanulmány az OTKA pályázati támogatásával készült. A hemokromatózis vizsgálatok részben a Népjóléti Minisztérium és az OMFB pályázati támogatásával készültek. Köszönöm témavezetômnek, Sarkadi Balázsnak a munka feletti kritikus ôrködést. Munkatársaimnak tanácsaikat, a segítô és vidám légkört. Vermes Györgyinek, Homolya Verának és Szeri Flórának a gondos munkát. Kollegáimnak, Ésik Olgának (Országos Onkológiai Intézet), Tordai Attilának, Nemes Lászlónak, Andrikovics Hajnalkának, Bors Andrásnak (Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet) és Jermendy Györgynek (Bajcsy-Zsilinszky Kórház, III. Belgyógyászat) az együttmüködést. Családomnak a gondoskodást és bátorítást. A laboratórium vezetôjének, Váradi Andrásnak a munka közvetlen irányítását, és azt, hogy megismertetett velem egy új világot, a molekuláris genetikai diagnosztikát.

27 Saját közlemények jegyzéke I. Tordai Attila, Klein Izabella, Rajczy Katalin, Pénzes M, Sarkadi Balázs, Váradi András: Prevalence of Factor V Leiden (Arg506Gln) in Hungary. British J. of Haematology. 1997; 99: II. Bakos Éva, Klein Izabella, Welker Ervin, Szabó Katalin, Müller Marianna, Sarkadi Balázs, Váradi Anedrás: Characterization of the human multidrug resistance protein containing mutations in the ATP-binding casette signature region. Biochem. J. 1997; 323: III. Klein Izabella, Tordai Attila, Nemes László, Sas Géza és Váradi András: Indirekt módszerek a hemofília A genetikai diagnosztikájában. Orvosi Hetilap. 1998; 139: IV. Tordai Attila, Andrikovics Hajnalka, Rajczy Katalin, Klein Izabella, Pénzes M, Sarkadi Balázs, Váradi András: High frequency of the haemochromatosis C282Y mutation in Hungary can argue against the Celtic origin of the mutation. J. Med. Genet. 1998; 35: V. Klein Izabella, Homolya Vera, Váradi András, Ésik Olga: A medulláris pajzsmirigyrák molekuláis genetikai vizsgálata. Orvosi Hetilap 1999; 140: VI. Andrikovics Hajnalka, Klein Izabella, Kalmár Lajos, Bors András, Jermendy György, Petri Ildikó, Kalász László, Váradi András, Tordai Attila: Új, molekuláris genetikai módszer az öröklôdô hemokromatózis differencáldiagnosztikájában Orvosi Hetilap 1999;140: VII. Klein, Izabella; Sarkadi, Balázs; Váradi, András: An inventory of the human ABC proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1999; 1461: VIII. Klein, Izabella; Andrikovics, Hajnalka; Bors, András; Nemes, László; Tordai, Attila; Váradi, András: Haemophilia A and B molecular genetic diagnostic program in Hungary: a highly informative and cost effective strategy. Haemophilia közlésre elfogadva

28 Abstract On the treshhold of the completion of the Human Genom Project, there is great demand to bring the knowledge of science closer to practice. To fulfill this task (and satisfy our interest) we aimed to make molecular genetic diagnosis of different inherited diseases and risk factors available for patients in Hungary. These are the inherited forms of medullary thyroid carcinoma, haemophilia A and B, a risk factor of trombosis, the Leiden mutation of factor V and haemochromatosis. In case of inherited medullary thyroid carcinoma syndromes (MEN2A, FMTC and MEN2B) we examined the most frequent mutation sites by a combination of PCR-RFLPs and sequencing in 65 MTC families in accordance with international recommendations. Mutations of the RET protooncogene was detected in all 14 clinically familiar cases and in none of the 51 families of clinically sporadic probands. Profilactic thyroidectomy in positive cases provides the patient a life expecancy similar to the normal population and underlines the importance of the possibility of presymptomatic diagnosis and preventive medicine. In our haemophilia program, our aim was to set up a protocol to be able to provide carrier and prenatal diagnosis to the Hungarian haemophilia A an B patients and their relatives. We could meet the expectations as by a combination of direct and indirect methods selected by us, diagnosis were provided to all being at risk (85 women from 50 haemophilia A families and 20 women from 7 haemophilia B families). The allele frequencies of the trombotic risk factor mutation, Leiden in factor V, andtwo mutations predisposing for haemochromatosis are established by our screening program (Leiden mutation: 5,7%, haemochromatosis C282Y: 3,8%, H63D:12,3%) and the patients are informed of their status making prevention possible.