01/2011:2090 javított 8.4 DANAPAROIDUM NATRICUM Danaparoid-nátrium Kondroitin-szulfát család Heparán-szulfát-család DEFINÍCIÓ A danaparoid-nátrium a sertésszövetekben előforduló szulfatált glükózaminoglikánok keverékének nátriumsóit tartalmazza. Fő összetevői: heparán-szulfát és dermatán-szulfát. Teljes hidrolízise során D- glükózamin, D-galaktózamin, D-glükuronsav, L-iduronsav, ecetsav és kénsav szabadul fel. Jellemző tulajdonsága, hogy növeli az antitrombinnak az aktivált X. faktorra (Xa faktorra) gyakorolt inaktiváló hatását. Az antitrombin trombinra gyakorolt inaktiválási sebességére elhanyagolható hatása van. Hatóérték: 11,0-17,0 anti-xa-faktor egység/milligramm (szárított anyagra). ELŐÁLLÍTÁS A danaparoid-nátriumot sertés bélnyálkahártyából állítják elő. Olyan eljárást alkalmaznak, amely biztosítja az aktív szulfatált glükózaminoglikánok relatív arányának állandóságát. A gyártási módszereket úgy alakítják ki, hogy endotoxinok, valamint vérnyomáscsökkentő anyagok a lehető legkisebb mennyiségben vagy egyáltalán ne legyenek jelen.
SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, nedvszívó por. Oldékonyság: vízben bőségesen oldódik. AZONOSÍTÁS A. Az anti-xa-faktor aktivitásának a Tartalmi meghatározás és a megfelelő vizsgálat szerint meghatározott aránya az anti-iia-faktor aktivitásához legalább 22. B. Az anyag megfelel a Molekulatömeg-megoszlás vizsgálat követelményének (lásd Vizsgálatok): az átlagos relatív molekulatömeg a 4000 7000 tartományban van. VIZSGÁLATOK ph (2.2.3): 5,5 7,0. 0,5 g szárított vizsgálandó anyagot R szén-dioxid-mentes vízzel 50 ml-re oldunk. Anti-IIa-faktor aktivitás: legfeljebb 0,5 egység/mg (szárított anyagra). Vizsgálati oldatok. A vizsgálandó anyagból R foszfát-tompítóoldattal (ph 6,5) mértani haladvány szerint két, egymástól független hígítási sort készítünk, a 0,0005-0,005 anti-iia-faktor-aktivitás Összehasonlító oldatok. CRS danaparoid-nátriumból R foszfát-tompítóoldattal (ph 6,5) mértani haladvány szerint két, egymástól független hígítási sort készítünk a 0,0005 0,005 anti-iia-faktoraktivitás Egy 96-helyes mikrotiter lemez mélyedéseibe minden egyes oldatból 50 µl-t mérünk. Valamennyihez 50 µl R3 antitrombin-iii oldatot és 50 µl R1 humán trombin oldatot adunk. A mikrotiter lemez rázogatásával összekeverjük az oldatokat, ügyelve arra, hogy eközben ne képződjenek buborékok. A lemezeket 75 percen át inkubáljuk. Valamennyi mélyedésbe 50 µl R4 kromogén szubsztrátumot mérünk. A mikrotiter lemez rázogatásával összekeverjük az oldatokat. Pontosan négy perccel a kromogén szubsztrátum hozzáadása után, 405 nm-en megfelelő készülékkel mérjük az oldatok abszorbanciáját (2.2.25). A reakciót R tömény ecetsav 20 %V/V-os oldatának 75 µl-ével állíthatjuk le. Azonos módon egy vakpróbán is elvégezzük az amidolitikus aktivitás meghatározását, vak oldatként R foszfát-tompítóoldatot (ph 6,5) használva (egy mikrotiter lemezre legalább tíz vakmintát viszünk fel). A vizsgálandó anyag aktivitását megfelelő statisztikai módszerrel, pl. a párhuzamos egyenesek módszerével számítjuk ki, és anti-iia-faktor-aktivitás egység/mg-ban fejezzük ki. Kondroitin-szulfát és dermatán-szulfát. Kondroitin-szulfát: legfeljebb 8,5% (szárított anyagra); dermatán-szulfát: 8,0-16,0% (szárított anyagra). Meghatározás szelektív enzimatikus lebontással. Vizsgálati oldatok. A vizsgálandó anyagot 3 órán át 60 C-on, kb. 670 Pa nyomáson, R foszfor(v)-oxid felett szárítjuk. A szárított anyag 0,200 g-ját 10,0 ml R vízben oldjuk. Az oldatot R vízzel megfelelően hígítva 3 vizsgálati oldatot készítünk, amelyek 20 mg/ml, 10 mg/ml, ill. 5 mg/ml szárított vizsgálandó anyagot tartalmaznak. Kondroitin-szulfát összehasonlító oldatok. CRS nátrium-kondroitin-szulfátot 16 órán át, szobahőmérsékleten, kb. 670 Pa nyomáson, R foszfor(v)-oxid felett szárítunk. A szárított CRS nátrium-kondroitin-szulfátból R vízzel 1 mg/ml, 2 mg/ml és 3 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Dermatán-szulfát összehasonlító oldatok. CRS dermatán-szulfátot 16 órán át, szobahőmérsékleten, kb. 670 Pa nyomáson, R foszfor(v)-oxid felett szárítunk. A szárított CRS dermatán-szulfátból R vízzel 1 mg/ml, 2 mg/ml és 3 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Kondroitináz-ABC oldat. R kondroitináz ABC-ből R trometamol nátrium-acetát nátrium-klorid tompítóoldattal (ph 8,0) ml-enként 0,5-1,0 aktivitás egységgel rendelkező oldatot készítünk.
Kondroitináz-AC oldat. R kondroitináz AC-ből R trometamol nátrium-acetát nátrium-klorid tompítóoldattal (ph 7,4) ml-enként 1,0-2,0 aktivitás egységgel rendelkező oldatot készítünk. Vizsgálat: Lebontás kondroitináz ABC-vel: megjelölünk két, egyenként tíz kémcsőből álló sorozatot, valamennyiből három párhuzamos mérésre számítva: T1, T2 és T3 a vizsgálati oldatok jele; SD1, SD2 és SD3 a dermatán-szulfát összehasonlító oldatok jele; SC1, SC2 és SC3 a kondroitin-szulfát összehasonlító oldatok jele; B a vakpróba (R víz) jele. Valamennyi kémcsőbe 1,25 ml R trometamol nátrium-acetát nátrium-klorid tompítóoldatot (ph 8,0) töltünk, és a vizsgálati oldatokból, a dermatán-szulfát összehasonlító oldatokból, a kondroitin-szulfát összehasonlító oldatokból, ill. R vízből 150 150 µl-t adunk hozzá. Az egyik sorozat valamennyi kémcsövének tartalmához 75 µl kondroitináz-abc oldatot mérünk. A vak válasz megállapítására a másik sorozat valamennyi kémcsövébe 75 µl R trometamol nátrium-acetát nátrium-klorid tompítóoldatot (ph 8,0) töltünk. A kémcsövek tartalmát vortex-keverővel összekeverjük, majd a megfelelően lezárt kémcsöveket legalább 24 órán át 37 C-on inkubáljuk. Lebontás kondroitináz AC-vel: megjelölünk egy hét kémcsőből álló sorozatot, valamennyiből három párhuzamos mérésre számítva: T1, T2 és T3 a vizsgálati oldatok jele; SC1, SC2 és SC3 a kondroitin-szulfát összehasonlító oldatok jele; B a vakpróba (R víz) jele. Valamennyi kémcsőbe 1,25 ml R trometamol nátrium-acetát nátrium-klorid tompítóoldatot (ph 7,4) töltünk, és a vizsgálati oldatokból, a kondroitin-szulfát összehasonlító oldatokból, ill. R vízből 150 150 µl-t adunk hozzá. Valamennyi kémcsőbe 75 µl kondroitináz-ac oldatot mérünk. A kémcsövek tartalmát vortex-keverővel összekeverjük, majd a megfelelően lezárt kémcsöveket legalább 24 órán át 37 C-on inkubáljuk. Az inkubálás után a kémcsövek tartalmát vortex-keverővel összekeverjük, majd R vízzel 12-szeresére hígítjuk. A hígított oldatok abszorbanciáját 234 nm-en megfelelő spektrofotométerrel mérjük (2.2.25), kompenzáló folyadékként R vizet használva. Számítás: kiszámoljuk az összehasonlító oldatok átlagos vak abszorbanciáját, azaz azon összehasonlító oldatok abszorbanciáinak átlagát, amelyekhez nem adtunk kondroitináz ABC-t. Az átlagos vak abszorbancia-értéket levonjuk az egyes összehasonlító oldatok egyedi abszorbanciaértékeiből. A vakpróbával korrigált abszorpció koncentráció értékpárok alapján felvesszük a két kondroitin-szulfát összehasonlító oldat és a dermatán-szulfát összehasonlító oldat lineáris regresszióval számított kalibrációs görbéit. Az alábbi összefüggés alapján minden egyes vizsgált koncentrációjú vizsgálati oldatra kiszámoljuk a százalékos dermatán-szulfát-koncentráció átlagértékét:, ahol A1 = a vizsgálati oldat vak abszorbanciája, A2 = a vizsgálati oldat + kondroitináz ABC elegy abszorbanciája, A3 = a vizsgálati oldat + kondroitináz AC elegy abszorbanciája, B1 = a kondroitin-szulfát összehasonlító oldatok + kondroitináz AC elegyekkel kapott görbe meredeksége, B2 = a kondroitin-szulfát összehasonlító oldatok + kondroitináz ABC elegyekkel kapott görbe meredeksége, B3 = a dermatán-szulfát összehasonlító oldatok + kondroitináz ABC elegyekkel kapott görbe meredeksége, C = a vizsgálati oldat koncentrációja mg/ml-ben, I1 = a kondroitin-szulfát összehasonlító oldatok + kondroitináz AC elegyekkel kapott görbe metszéspontja az y-tengelyen,
I2 = a kondroitin-szulfát összehasonlító oldatok + kondroitináz ABC elegyekkel kapott görbe metszéspontja az y-tengelyen, I3 = a dermatán-szulfát összehasonlító oldatok + kondroitináz ABC elegyekkel kapott görbe metszéspontja az y-tengelyen. Az alábbi összefüggés alapján minden egyes vizsgált koncentrációjú vizsgálati oldatra kiszámoljuk a százalékos kondroitin-szulfát-koncentráció átlagértékét: Molekulatömeg-eloszlás. Méretkizárásos kromatográfia (2.2.30). Vizsgálati oldat. 10 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázis 2 ml-ében oldunk. Összehasonlító oldat. 10 mg CRS danaparoid-nátriumot a mozgófázis 2 ml-ében oldunk. Oszlop: méretei: l = 0,60 m, = 7,5 mm; állófázis: R kromatográfiás célra szánt hidrofil szilikagél (10 μm), a kb. 5000 100 000 relatív molekulatömeg-tartományba tartozó fehérjék frakcionálására, hőmérséklet: 30 C. Mozgófázis: R vízmentes nátrium-szulfát R hígított kénsavval ph 5,0-re beállított, 28,4 g/l töménységű oldata. Áramlási sebesség: 0,9 ml/perc±2%. Detektálás: spektrofotométerrel, 210 nm-en. Injektálás: 100 μl. Kromatografálási idő: a minta és az oldószer csúcsainak teljes elúcióját biztosító időtartam (kb. 40 perc). Rendszeralkalmasság: az összehasonlító oldatot kétszer injektáljuk. A csúcsmaximumokhoz tartozó retenciós idők közötti eltérés legfeljebb 5 másodperc lehet. Kalibrálás: kalibrálásra az összehasonlító oldat kromatogramjának releváns szakaszát használjuk fel, azaz a kromatogram végén lévő éles csúcsot figyelmen kívül hagyjuk, és a vizsgálati oldat kromatogramját összevetjük az összehasonlító oldattal kapott kalibrációs táblázattal. Az így nyert kalibrációs görbéből meghatározzuk a minta molekulatömeg-megoszlását. A kalibrációs táblázatot a CRS danaparoid-nátriumhoz mellékelik. Követelmények: 2000-nél kisebb relatív molekulatömegű láncok: legfeljebb 13%; 4000-nél kisebb relatív molekulatömegű láncok: legfeljebb 39%; 4000 és 8000 közti relatív molekulatömegű láncok: legalább 50%; 8000-nél nagyobb relatív molekulatömegű láncok: legfeljebb 19%; 10 000-nél nagyobb relatív molekulatömegű láncok: legfeljebb 11%. Nitrogén (2.5.9): 2,4 3,0% (szárított anyagra). Nukleinsavak: legfeljebb 0,5% (szárított anyagra). Vizsgálati oldat. Centrifugacsőbe mért kb. 50 mg szárított vizsgálandó anyagot 200 µl R vízben oldunk.
Összehasonlító oldat. Kb. 50 mg CRS ribonukleinsavat 5 ml 0,1 M nátrium-hidroxid oldatban oldunk, és az oldatot R vízzel 20,0 ml-re hígítjuk. Az oldat 200 µl-ét centrifugacsőbe mérjük. Mindegyik oldathoz R triklórecetsav 50 g/l-es oldatából 4,0 ml-t elegyítünk. A centrifugacsöveket 30 percre forrásban lévő vízbe helyezzük. A szobahőmérsékletre lehűlt oldatokhoz R triklórecetsav 50 g/l-es oldatából ismét 4,0 ml-t elegyítünk. Ha bármelyik vizsgálati oldat nem tiszta, az összes centrifugacsövet 10 percre ultrahangos fürdőbe tesszük, ezután 15 percen át 1500 g-vel centrifugáljuk. A tiszta felülúszó 1,0 ml-ét R vízzel 4,0 ml-re hígítjuk. A hígított vizsgálati oldatok és összehasonlító oldatok abszorbanciáját 265 nm-en mérjük (2.2.25). Kompenzáló folyadékként azonos módon készült vak oldatot alkalmazunk. Kiszámoljuk a minta százalékos nukleinsavtartalmát. Összes fehérje (2.5.33, 2. módszer): legfeljebb 0,5%. A vizsgálandó anyagot R vízben oldjuk. Referenciaanyagként R szarvasmarha albumint használunk. Nátrium: 9,0 11,0% (szárított anyagra). Atomabszorpciós spektrometria (2.2.23, I. módszer). Vizsgálati oldat. 0,125 g vizsgálandó anyagot R cézium-klorid 0,1 M sósavval készült, 1,27 mg/ml töménységű oldatának 100,0 ml-ében oldunk. Összehasonlító oldatok. R nátrium mértékoldat (1000 ppm Na) hígításával 50, 100 és 150 ppm Na-ot tartalmazó összehasonlító oldatokat készítünk. A hígításokat R cézium-klorid 0,1 M sósavval készült, 1,27 mg/ml töménységű oldatának végezzük. Fényforrás: nátrium vájtkatód-lámpa. Hullámhossz: 330,3 nm. Láng: levegő-acetilén. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 5,0%. Az anyag 0,500 g-ját szárítószekrényben 3 órán át 60 C-on 670 Pa nyomáson, R foszfor(v)-oxid felett szárítjuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 0,02 NE/anti-Xa-faktor-aktivitás egység. A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására megfelelő eljárást feleljen meg e vizsgálat követelményének is. HATÓÉRTÉK-MEGHATÁROZÁS A danaparoid-nátrium alvadásgátló aktivitását in vitro határozzuk meg. Az eljárás az antitrombin IIInak Xa faktorra kifejtett gátló hatásának gyorsítását méri (anti-xa-faktor eljárás). Vizsgálati oldatok A vizsgálandó anyagból R trometamol-edta tompítóoldattal (ph 8,4) mértani haladvány szerint két, egymástól független hígítási sort készítünk 0,1-0,32 anti-xa-faktor-aktivitás Összehasonlító oldatok. CRS danaparoid-nátriumból R trometamol-edta-tompítóoldattal (ph 8,4) mértani haladvány szerint két, egymástól független hígítási sort készítünk a 0,08-0,35 anti-xa-faktoraktivitás Az oldatok 40 40 µl-ét 96-helyes mikrotiter lemez mélyedéseibe mérjük. Mindegyikhez 40 µl R4 antitrombin III oldatot mérünk. A mikrotiter lemez rázogatásával összekeverjük az oldatokat, ügyelve arra, hogy eközben ne képződjenek buborékok. Ezután valamennyi oldathoz 40 µl R1 szarvasmarha Xa véralvadási faktor oldatot elegyítünk. Pontosan két perccel a Xa véralvadási faktor oldat hozzáadása után, 80 µl R5 kromogén szubsztrátumot mérünk az oldatokhoz, és pontosan 4 perccel az Xa véralvadási faktor oldat hozzáadása után, 405 nm-en, megfelelő leolvasó eszközzel mérjük az oldatok abszorbanciáját (2.2.25). A reakciót R tömény ecetsav 20 %V/V-os oldatának 75 µl-ével állíthatjuk le. Azonos módon, a vakpróba amidolitikus aktivitását is meghatározzuk, vak oldatként R trometamol- EDTA tompítóoldatot (ph 8,4) használva (egy mikrotiter lemezen legalább nyolc vak oldattal). A
vizsgálandó anyag hatóértékét megfelelő statisztikai módszerrel, pl. a párhuzamos egyenesek módszerével számítjuk ki, és anti-xa-faktor-aktivitás egység/mg-ban fejezzük ki. ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban. Ha az anyag steril, akkor steril, légmentesen záró, garanciazáras tartályban. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni az anti-xa-faktor-aktivitás egységek számát mg-onként.