!HU000007309T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 309 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 07 80146 (22) A bejelentés napja: 07. 07. 30. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 07080146 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1988909 A2 08. 01. 31. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1988909 B1 09.. 21. (1) Int. Cl.: A61K 31/76 (06.01) A61P 17/02 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 080127 PCT/EP 07/006714 (30) Elsõbbségi adatok: 06016 06. 07. 28. GB (72) Feltalálók: VAN DEN PLAS, Dave, B- Deurne (BE); DE SMET, Kris, B-2400 Mol (BE); SOLLIE, Philippe, B-2980 Zoersel (BE) (73) Jogosult: Flen Pharma N. V., Kontich (BE) (74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Polietilénglikol alkalmazása gyulladással kapcsolatos helyi rendellenességekben vagy betegségekben és sebgyógyulásban (7) Kivonat A találmány tárgyát készítmények és azok sebek helyi kezelésére szolgáló, vagy gyulladáscsökkentõ, vagy gyulladáscsökkentést elõsegítõ, a sérült bõr, nyálkahártya és/vagy sebek gyógyulását elõsegítõ, és/vagy a gyulladással kapcsolatos tünetek helyi enyhítésére szolgáló kozmetikai termékként, élelmiszerként, gyógyszerként vagy gyógyászati eszközként történõ alkalmazása képezi. A találmány tárgyát közelebbrõl polietilénglikol (PEG) egy vagy több 00 alatti molekulatömegû alakjának egyedüli gyulladásellenes összetevõként bõr- vagy nyálkahártya-gyulladás kezelésére szolgáló, polietilénglikol (PEG) egy vagy több találmány szerinti formáját 0, és tömeg% közötti koncentrációban tartalmazó, hidrogél vagy vizes oldat formájú gyógyszer elõállítására történõ alkalmazása képezi. HU 007 309 T2 A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 7 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
A találmány tárgyköre A találmány tárgyát készítmények és azok sebek helyi kezelésére szolgáló, vagy gyulladáscsökkentõ, vagy gyulladáscsökkentést elõsegítõ, a sérült bõr, nyálkahártya és/vagy sebek gyógyulását elõsegítõ, és/vagy a gyulladással kapcsolatos tünetek helyi enyhítésére szolgáló kozmetikai termékként, élelmiszerként, gyógyszerként vagy gyógyászati eszközként történõ alkalmazása képezi. 2 30 3 40 4 0 60 A találmány háttere A polietilénglikol (PEG) gyógyászati kiszerelések alapjául szolgáló, vagy kenõcsök és kozmetikumok viszkozitásának módosítására alkalmazott összetevõként közismert. Bõrpenetrációt fokozó anyagként, valamint hidrofób anyagok diszpergálódását elõsegítõ nedvesítõágensként alkalmazzák. A PEG¹et oldhatóságuk, stabilitásuk és keringési idejük fokozása és/vagy immunogenitásuk csökkentése érdekében terápiás proteinek derivatizálására is igénybe vették. A tenzióaktív tulajdonságokkal bíró PEG-alapú polimereket emulgeálószerként, oldószerként és nedvesítõágensként alkalmazzák dermatológiai és kozmetikai készítményekben, piperecikkekben, parfümökben, valamint ipari alkalmazásokban. A PEG-kapcsolt poliaminok igazoltan fokozzák a helyi terápiás drogok transzdermális bejutását. A PEG neuroprotektív tulajdonsággal is rendelkezik, aminek alapját részben az szolgáltatja, hogy a plazmamembránok kijavításával képes neuronok és axonjaik megmentésére. E vegyület dermatológiai alkalmazásokban mutatott potenciális gyógyászati aktivitását általában figyelmen kívül hagyják. A dermatológiai kiszerelésekben általában változatos PEG-koncentrációkat alkalmaznak. Bár ezen kiszerelések egy részének sebgyógyításra történõ igénybevételét javasolták [Chapvil és mtsai., (1991) J. Surg. Res. 1, 24 22], a PEG¹et nem aktív hatóanyagként kezelik, mivel a PEG saját közvetlen hatását még nem bizonyították. Beszámoltak a PEG gyulladást elõsegítõ aktivitásán alapuló PEG-tartalmú antimikrobiális készítményekrõl [Ambrose és mtsai. (1991) Antimicrobial agents and chemotherapy 3, 1799 1803]. A PEG feltételezett gyulladást elõsegítõ hatásának eléréséhez % feletti PEG-koncentrációra van szükség. Gyulladáscsökkentõ aktív hatóanyagok mellett PEG¹et tartalmazó további készítményeket is leírtak már. Ezekben a készítményekben a PEG vivõanyag szerepet tölt be. Az US031299 számú szabadalmi irat loratidin H1 antihisztamin ágenst, 3% Macrogolt (PEG Mr400), 0,8% Carbopolt és vizet tartalmazó vizes alapú gélkészítményeket ismertet. A PEG¹en kívül egyéb nedvesítõszert a készítmény nem tartalmaz. A készítményt gyulladásos bõrelváltozások, például csalánkiütés, allergiás bõrreakciók, viszketõ kivörösödött leégés és rovarcsípések esetében alkalmazzák. Az US019237 számú szabadalmi irat prosztaglandin D receptor szelektív antagonistát és % Macrogol 400¹at tartalmazó aeroszolos vizes oldatot mutatott be. A bejelentés megvalósítási módjai olyan készítmények alkalmazására vonatkoznak, amelyekben a PEG¹en kívül nincs jelen egyéb nedvesítõszer. A készítményeket viszketéssel járó tünetek helyi kezelésére, közelebbrõl viszketés és a hozzá kapcsolódó bõrés nyálkahártya-gyulladás eseteiben alkalmazzák, mint amilyenek a rühösség, a csalánkiütés, az ekcéma, a xerosa és az atópiás dermatitis. A WO06134279 számú szabadalmi irat dermatológiai állapotok, például rosacea kezelésére szolgáló, metronidazol mellett % PEG 400¹at is tartalmazó vizes alapú oldott gél vagy krém (lotion) készítményeket ismertet. Mindezek mellett a PEG például sebkötések elõállítására szolgáló köztes készítmények összetevõjeként is ismert. Például a WO0304293 számú szabadalmi irat alginátot, térhálósító anyagot, katalizátort és polietilénglikolt, például PEG 600¹at tartalmazó vizes oldattal impregnált gyapotból készített sebkötést mutat be. Ez a vizes oldat elõnyösen 1,2% PEG¹et tartalmaz. A gyulladás az immunrendszer fertõzésre vagy irritációra adott elsõ válaszreakciója, amelyet veleszületett kaszkádnak is nevezhetünk. A gyulladást a következõ öt tünet jellemzi: kipirulás (rubor), melegség (calor), duzzanat (tumor), fájdalom (dolor) és az érintett szervek mûködészavara (functio laesa). A gyulladás két fõ, sejtes és exudatív összetevõvel rendelkezik. Az exudatív összetevõ rendszerint számos fontos proteint, például fibrint és immunglobulinokat (ellenanyagokat) tartalmazó folyadék mozgását foglalja magában. A vérerek a gyulladásos terület elõtt kitágulnak (ez az oka a kipirulásnak és a felmelegedésnek), míg utána összehúzódnak, ugyanakkor az érintett szövetben a kapillárisok áteresztõképessége fokozódik, ami összességében a vérplazma egy részének szövetbeli felhalmozódásához vezet, ez az oka a megfigyelhetõ ödémának vagy duzzanatnak. A duzzanat kifeszíti a szöveteket, összenyomja az idegvégzõdéseket, ezáltal fájdalmat okoz. A sejtes összetevõ fehérvérsejteknek vérerekbõl a gyulladásos szövetbe történõ vándorlását foglalja magában. A fehérvérsejtek vagy leukociták jelentõs szerepet játszanak a gyulladásban; a kapillárisokból a szövetekbe lépnek (extravasatio), ahol fagocitaként mûködve baktériumokat és sejttörmeléket vesznek fel. A gyulladást elhatárolva megakadályozhatják annak terjedését is. Ha az érintett terület gyulladása hosszabb ideig fennáll, a kibocsátott IL 1- és TNF-citokinek endotélsejteket aktiválnak a különbözõ immunsejteken található VCAM 1, ICAM 1, E¹selectin és L¹selectin receptorok serkentése érdekében. A receptorok mûködésének serkentése fokozza a neutrofil granulociták, monociták, aktivált helper- és citotoxikus T¹sejtek, T és B memóriasejtek kapillárisokból a fertõzés helyére történõ kilépését. A neutrofil granulociták jelenléte a gyulladás korai szakaszára jellemzõ, ezek a sejtek jelennek meg elsõként a fertõzött területen, friss (néhány napon belüli) gyulladással érintett szövetek mikroszkópos vizsgálatával tömegesen figyelhetõk meg. Ezek a lebenyezett magjukról és szemecskézett citoplazmájukról könnyen azonosítható sejtek számos fontos funkciót töltenek 2
be, ilyenek például a fagocitózis és az extracelluláris kémiai hírvivõ (messenger) anyagok kibocsátása. A neutrofilok csupán néhány napig maradnak életben ezeken a szövetközi területeken, így ha a gyulladás hosszabb ideig fennáll, akkor helyüket fokozatosan átveszik a hosszabb élettartamú monociták. A gyulladás megindításában és fenntartásában különféle leukociták vesznek részt. Ezek a sejtek a gyulladás fenntartása érdekében limfociták, T¹ és B¹sejtek, valamint ellenanyagok adaptív kaszkádján keresztül tovább stimulálhatók. Ilyen gyulladásos sejtek a hízósejtek, amelyek feszítési (stretch) receptorok aktiválódására adott válaszként hisztamint és prosztaglandint bocsátanak ki, valamint a makrofágok, amelyek a toll-like receptorok aktiválódására válaszul TNF- ¹t és IL 1¹et választanak ki. Egy adott helyzetben a gyulladás kimenetelét a sérülés által érintett szövet típusa, valamint az azt okozó ágens határozza meg. A gyulladásnak négy lehetséges kimenetele van: regeneráció, kötõszövetes hegesedés, tályogképzõdés, valamint folyamatos vagy idült gyulladás. A regeneráció, más néven a sérült szövetek tökéletes helyreállítása általában nem következik be. A gyulladás ennél gyakrabban kötõszövetes hegesedést eredményez. Seb esetében körülbelül 24 órával a gyulladásos folyamat megindulását követõen elkezdõdik a sebgyógyulás. Ezen válaszreakció magában foglalja a sérülés által elõidézett anyaghiányt áthidaló kötõszövet képzõdését, valamint az újonnan képzõdõ szövetek tápanyagellátását biztosító új vérerek kialakulását, az angiogenezis folyamatát. A gyógyulás gyakran nem lehet teljes és hegképzõdéssel jár; például szakított bõrsebnél kötõszövetes heg képzõdik, amely nem tartalmaz semmilyen specializált struktúrát, például szõrszálakat vagy verejtékmirigyeket. Ha a gyulladáshoz gennykeltõ baktériumok okozta fertõzés társul tályogképzõdés következhet be. Végezetül a sérülést okozó ágens folyamatos jelenléte idült gyulladáshoz vezet. Ez a folyamat, melyet sok napig, hónapokig, vagy akár évekig tartó gyulladás jellemez, idült seb kialakulásához vezethet. Az idült gyulladásra a sérült szövetekben a makrofágok túlsúlya jellemzõ, amelyek a fentiekben megegyezõ módon jutnak ki a vérpályából (ICAM 1, VCAM 1). Ezek a sejtek a szervezet hatékony védekezõ ágensei, de az általuk kibocsátott toxinok (köztük a reaktív oxigéngyökök) egyaránt károsítják a szervezet saját szöveteit és a behatoló ágenseket. Ez az oka annak, hogy az idült gyulladás szinte mindig szövetkárosodással jár. Idült gyulladás során tályog vagy gennygyülem is kialakulhat. Bõrgyulladást a sebzéseken túl irritáló faktorként ható egyéb ágensek is elõidézhetnek. Gyakori gyulladásos bõrbetegségek például az atópiás dermatitis, az akne, a cserszömörce okozta kontakt dermatitis, a rosacea és a csalánkiütés. Az atópiás dermatitist sok esetben ekcémának nevezik, ami számos különféle bõrgyulladás közös elnevezése. Az ekcéma számos típusa, így például a kontakt ekcéma (például a foglalkozási dermatitis legtöbb formája), az allergiás kontakt 2 30 3 40 4 0 60 ekcéma, a seborrhoeás ekcéma, a gyermekkori ekcéma, a neurodermatitis, a stasis dermatitis és a dyshidroticus ekcéma közül a leggyakoribb az atópiás dermatitis. Az atópiás dermatitis férfiakban és nõkben egyenlõ arányban fordul elõ és a dermatológiai szakvizsgálatra küldött páciensek %¹át érinti. Becslések szerint a csecsemõk és kisgyerekek körülbelül %¹a szenved a betegség tüneteitõl. Ezen csecsemõk durván 60%¹a felnõtt korában is az atópiás dermatitis egy vagy több tünetét mutatja. Eszerint az amerikai Egyesült Államokban több, mint millió embert érintenek a betegség tünetei. A psoriasis vulgaris idült gyulladásos bõrbetegség, amelynek kaukázusi populáción belüli elõfordulási aránya 2 3%. A psoriasis vulgaris a legtöbb esetben sporadikus elõfordulású. A sporadikus esetek jellemzõje az epidermisz sejtjeinek hiperproliferációja és a keratinociták rendellenes differenciálódása (pl. keratinocita hiperproliferáció) által kiváltott gyulladás, az aktivált T¹helper sejtek és monociták infiltrációja, valamint a gyulladást elõsegítõ citokinek kibocsátása. Az acne vulgaris gyulladásos bõrbetegség, amit az úgynevezett pilosebaceous egységek (a szõrtüszõkbõl és a csatlakozó faggyúmirigyekbõl álló bõr szerkezeti egységek) elváltozásai idéznek elõ. Az elváltozás kamaszkorban a leggyakoribb, a tizenévesek több, mint 8%¹át érinti, de gyakran felnõttkorban is fennmarad. Továbbra is igény mutatkozik bõrre juttatva alkalmazott készítmények iránt, melyek mérséklik a gyulladás és sebgyógyulás tüneteit és/vagy elõsegítik a sebregenerációt. A találmány szerinti megoldás összefoglalása A találmány tárgyát egy szempontból polietilénglikol (PEG) egy vagy több 00 Mr alatti alakjának egyedüli gyulladásellenes összetevõként bõr- vagy nyálkahártya-gyulladás kezelésére szolgáló, polietilénglikol (PEG) egy vagy több találmány szerinti formáját 0, és tömeg% közötti koncentrációban tartalmazó, hidrogél vagy vizes oldat formájú gyógyszer elõállítására történõ alkalmazása képezi. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban a polietilénglikol (PEG) egy vagy több alakjának koncentrációja 0, és 3 tömeg% közötti, vagy 1 és 2, tömeg% közötti. A találmány további meghatározott megvalósítási módjaiban a gyógyszer a PEG¹en kívül nem tartalmaz további nedvesítõszert. A találmány még további meghatározott megvalósítási módjaiban a polietilénglikol (PEG) egy vagy több alakjának Mr¹értéke kb. 0 és 700 közötti. A találmány további meghatározott megvalósítási módjaiban a hidrogél 0,0 % közötti koncentrációjú poliakrilát-hidrokolloid. A találmány szerinti megoldással összhangban kezelt gyulladás seb, bõrgyulladás vagy nyálkahártya-betegség része lehet. A találmány szerinti megoldás alkalmazásával összhangban a gyulladás kezelése a hegképzõdés megelõzését vagy a sérült bõr vagy nyálkahártya helyreállítását szolgálja. 3
A találmány tárgyát képezi továbbá bõr vagy nyálkahártya gyulladásának csökkentésére szolgáló, egyedüli gyulladáscsökkentõ összetevõként 0, és tömeg% közötti koncentrációjú, 00 alatti Mr¹értékkel rendelkezõ egy vagy több PEG-alakot tartalmazó hidrogél vagy vizes oldat. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban a polietilénglikol (PEG) egy vagy több alakjának koncentrációja 0, és 3 tömeg% közötti, vagy 1 és 2, tömeg% közötti. A találmány egyes megvalósítási módjainak megfelelõen gyulladásos bõrbetegségben a bõr vagy nyálkahártya gyulladásának csökkentése elõsegíti a sebgyógyulást, közelebbrõl az idült seb gyógyulását és/vagy megelõzi a sarjszövetképzõdést és/vagy fokozza a bõr helyreállítását. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban a hidrogélt tartalmazó készítmény vagy vizes oldat PEG¹en kívül nem tartalmaz nedvesítõszert. A találmány további meghatározott megvalósítási módjaiban a hidrogél 0,0 és % közötti koncentrációjú poliakrilát-hidrokolloid. Ábrafeliratok Az 1. ábra a találmány meghatározott megvalósítási módjainak megfelelõen a PEG400 különbözõ koncentrációinak tenyésztett sejtekre gyakorolt toxicitását mutatja be (A: keratinociták; B: makrofágok; C: fibroblasztok). A 2. ábra a találmány meghatározott megvalósítási módjainak megfelelõen a PEG400 különbözõ koncentrációinak tenyésztett sejtek metalloproteináz expressziójára gyakorolt hatását mutatja be. A 3. ábra a találmány meghatározott megvalósítási módjainak megfelelõen a PEG400 különbözõ koncentrációinak tenyésztett sejtek VEGF expressziójára gyakorolt hatását mutatja be. A 4. ábra a találmány meghatározott megvalósítási módjainak megfelelõen PEG-származékok tenyésztett sejtek proteinexpressziójára gyakorolt hatását mutatja be (A: fibroblasztok VEGF expressziója, B: makrofágok ProMMP9 expressziója; C: makrofágok IL 6 expressziója; D: makrofágok TGF-béta1 expressziója). Az. ábra a találmány meghatározott megvalósítási módjainak megfelelõen PEG-származékok tenyésztett sejtek (PBMC¹k) proteinexpressziójára gyakorolt hatását mutatja be (A: TNF-alfa-expresszió, B: TGF-béta1-expresszió). A 6. ábra a találmány meghatározott megvalósítási módjainak megfelelõen alginát hidrogél kiszerelésû PEG400 tenyésztett sejtek proteinexpressziójára gyakorolt hatását mutatja be (A: fibroblasztok, B: makrofágok). 2 30 3 40 4 0 60 A 7. ábra a találmány meghatározott megvalósítási módjainak megfelelõen poliakrilát hidrogél kiszerelésû PEG400 tenyésztett sejtek proteinexpressziójára gyakorolt hatását mutatja be. A 8. ábra a találmány meghatározott megvalósítási módjainak megfelelõen karboxi-metilcellulóz hidrogél kiszerelésû PEG tenyésztett sejtek proteinexpressziójára gyakorolt hatását mutatja be. A 9. ábra a találmány meghatározott megvalósítási módjainak megfelelõen PEG400 endotélsejtek (SVEC) és fibroblasztsejtek (3T3) VEGF-expressziójára gyakorolt hatását mutatja be. A. ábra PEG400 és egy további nedvesítõszer propilénglikol kombinációjának endotélsejtek (SVEC) VEGF-expressziójára gyakorolt hatását mutatja be. A 11. ábra PEG400 és egy további nedvesítõszer kombinációjának fibroblasztsejtek (3T3) kollagén III expressziójára gyakorolt hatását mutatja be. A találmány szerinti megoldás részletes bemutatása Definíciók A polietilénglikol (PEG, Macrogol) megnevezés etilén-oxid (Mr 62) és víz kondenzációs polimerére utal, amelynek általános képlete HO (CH 2 CH 2 O) n H. Az n=2 és n=4 összetételû alacsony molekulatömegû tagok a dietilénglikol (Mr 6), a trietilénglikol (Mr 0), valamint a tetraetilénglikol (Mr 194), amelyeket tiszta vegyület formájában állítanak elõ. Megfelelõ esetben a PEG rövidítés a PEG átlagos molekulatömegét jelzõ számtoldalékkal egészül ki. Molekulatömegük alapján különféle PEG¹ek azonosíthatók (alacsony: 0 00; magas: >00). Alternatív módon a PEG¹ek viszkozitásuk alapján is osztályozhatók, ami szerint a PEG 0 700 viszkózus folyadékokat jelent. A PEG 00 jelzés félkemény, zsíros tapintatú anyagot jelöl. A PEG >00 szilárd anyag viaszos vagy paraffinszerû megjelenéssel. A folyékony és félkemény PEG-készítmények higroszkóposak (nedvesítõszerek), míg a viaszszerû készítmények sokkal kevésbé nedvszívók (Cooper & Gunn s Dispensing for Pharmaceutical Students, 12. kiadás, Szerk.: SJ Carter; Pitman Medical Publishing Co. Ltd.; Martindale, The extra Pharmacopoeia, 28. kiadás, szerk.: J.E.F. Reynolds, Pharmaceutical Press, London). Egy PEG-alak vagy PEG-fajta meghatározott átlagos molekulatömegû PEG vagy PEG-származék. A PEG-származék kifejezés egy vagy több egyenes láncú vagy elágazódó C1 C6 alkilcsoport hozzáadásával módosított PEG¹et jelöl. Egy funkcionalizált PEG vagy PEG-származék az alábbiak közül egy vagy több csoporttal (tovább) szubsztituált PEG vagy PEGszármazék: sav (karbonsav, szulfonsav), aldehid, CN, OH, OR, SH, SR, NH 2 vagy NHR csoport, ahol R=C 1 C 4 lánc. 4
Az alginátok kifejezés gyógyászati szempontból elfogadható alginátokat, például algininsavat és kationos alginátokat, például kalcium¹, nátrium¹, kálium és ammónium-alginátokat jelöl. A helyi kifejezés a találmány szerinti beadási módokkal és készítményekkel összefüggésben egy testrész felületére, közelebbrõl bõrre, körömre vagy hajra, vagy nyálkahártyákra, például fül¹, orr¹, hüvely¹, végbél¹, toroknyálkahártyára vagy szemre (pl. retinára), ideértve mindezek sérült részeit is, történõ juttatást (vagy arra való alkalmasságot) jelöl. A dermális kifejezés beadási módokkal vagy készítményekkel összefüggésben bõrre történõ juttatást jelöl. A hidrogél vízben kolloidálisan diszpergált egy vagy több természetes vagy szintetikus polimert jelölõ általános megnevezés [Martin és mtsai., in Physical Pharmacy, 2. kiadás (1960), Lea & Febiger, Philadelphia]. A gyulladás kifejezés alatt általánosságban folyadék, plazma, proteinek, valamint fehérvérsejtek fizikai sérülés, fertõzés vagy helyi immunválasz által kiváltott helyi felhalmozódását értjük. Mindez gyulladásos válaszreakcióként is ismert. A heveny gyulladás kifejezést a korai és gyakran átmeneti reakció leírására alkalmazzuk, az idült gyulladás pedig a fertõzés perzisztálása vagy autoimmun válaszreakció esetén fordul elõ. Különbözõ megbetegedések esetén a gyulladás számos alakja figyelhetõ meg. A gyulladásos válaszreakciók során a szöveteket beszûrõ sejteket gyakran gyulladásos sejteknek vagy gyulladásos infiltrátumnak nevezzük [ImmunoBiology, the immune system in health and disease, Janeway & Travers, 3. kiadás (1997), Churchill-Livingstone/Current Biology Limited/Garland Publishing Inc.]. A gyulladást jellemzõen gyulladáskeltõ citokinek, pl. TNF, IL 1, MMP stb. termelése kíséri. A gyulladásos bõrbetegség kifejezés alatt irritáló anyagra adott gyulladásos reakciót értünk a bõrben, amelyet a szövetekben gyakran folyadék, plazmaproteinek, valamint fehérvérsejtek felhalmozódása, a bõr felszínén pedig bõrpír, megvastagodás és melegedés jellemez. Gyulladásos bõrrendellenességek például az ekcéma, az akne, a rosacea, valamint számos egyéb kórkép, így pl. a psoriasis, a csalánkiütés, a kontakt dermatitis (pl. a foglalkozási dermatitis), valamint a cserszömörce-mérgezés. A sebgyógyulás kifejezés alatt felületes (csak a stratum corneumra és/vagy az epidermisre kiterjedõ; pl. leégés okozta) sebek, részleges vastagságú (csak az epidermisre és a felületes dermisre kiterjedõ, vérérkárosodás nélküli), vagy teljes vastagságú (a dermis elvesztésével, a dermalis vérerek érintettségével járó), valamint belsõ sebek méretének és/vagy súlyosságának csökkenését értjük. Az oldat megnevezés alatt homogén molekuláris diszperziót, vagyis egyfázisú rendszert alkotó, két vagy több összetevõbõl álló keveréket értünk (Martin és mtsai. in Physical Pharmacy, 2. kiadás, 144. oldal Lea & Febiger Philadelphia). 2 30 3 40 4 0 60 A nedvesítõszer kifejezés alatt nedvszívó anyagot értünk. Ilyenek például a glicerin, a propilénglikol és a gliceril-triacetát. Más típusú nedvesítõszerek a poliolok, mint például a szorbitol, a xilitol és a maltitol, valamint a polimer poliolok, mint például a polidextróz, továbbá a természetes kivonatok, mint például a quillaia (szappanfakivonat), a tejsav és a karbamid. Idetartozik a PEG, amely nedvszívó tulajdonságainak köszönhetõen nedvesítõszernek számít. A találmány tárgyát egyedüli gyulladáscsökkentõ összetevõként PEG egy vagy több formáját alacsony koncentrációban tartalmazó, terápiás és/vagy elõnyös hatással rendelkezõ, közelebbrõl gyulladás csökkentésére és/vagy kezelésére szolgáló készítmények képezik. Közelebbrõl, a találmány tárgyát helyi kezelésre szolgáló készítmények képzik, amelyekben az egyedüli gyulladáscsökkentõ összetevõ PEG jelenléte alacsony koncentrációban csökkenti a gyulladást vagy elõsegíti a gyulladás csökkentését és/vagy támogatja a bõr gyógyulását és megelõzi és/vagy csökkenti a hegképzõdést, és/vagy fokozza a sebgyógyulást és/vagy támogatja a sebhelyreállítást. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban a találmány tárgyát gyulladáscsökkentõ vagy gyulladáscsökkentést elõsegítõ és/vagy a bõr helyreállítását támogató és a hegképzõdést megelõzõ és/vagy csökkentõ és/vagy sebkezelésre és/vagy sebhelyreállítás elõsegítésére szolgáló, egyetlen gyógyászatilag aktív összetevõként közvetlen gyulladáscsökkentõ hatással bíró PEG¹et tartalmazó készítmények képezik. A találmány tárgyát képezõ készítmények jellemzõje, hogy az egyedüli gyulladáscsökkentõ vegyületként bennük foglalt alacsony koncentrációjú PEG gyulladáscsökkentõ hatást gyakorol a bõrre vagy nyálkahártyára. Az említett készítmények tartalmazhatnak továbbá egyéb aktív összetevõket, pl. napozókrémet (pl. benzoesavalapú UV¹elnyelõ vegyületeket, antranilsavalapú UV¹elnyelõ vegyületeket, szalicilsavalapú UV¹elnyelõ vegyületeket, fahéjsavalapú UV¹elnyelõ vegyületeket, benzofenon-alapú UV¹elnyelõ vegyületeket). A találmány egyes megvalósítási módjaiban az alkalmazott készítmény tartalmazhat melegítõ ágenseket (pl. kapszaicint vagy mentolt), vagy antimikrobiális összetevõket (antibiotikumokat, gomba- vagy vírusellenes ágenseket). A találmány tárgyát képezõ készítményekben a PEG az egyetlen gyulladáscsökkentõ összetevõ (a készítmények tartalmazhatnak növekedésgátló antimikrobiális ágenseket is). A találmány további, alternatív megvalósítási módjaiban, a PEG a készítményben jelen lévõ egyetlen aktív összetevõ, közelebbrõl a készítmény nem tartalmaz melegítõágenseket és/vagy egyéb aktív összetevõket. A PEG gyulladás (helyi) kezelésében vagy sebgyógyulásban mutatott terápiás hatásáról, különösen alacsony koncentrációban történõ alkalmazása esetén, korábban nem számoltak be. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát egyedüli gyulladáscsökkentõ összetevõként alacsony PEG-koncentrációt tartalmazó készítmények korábban elõre nem látott felhasználási módokban, közelebbrõl gyulladás csökkentésére vagy
gyulladáscsökkentés elõsegítésére, és/vagy bõrgyógyulás elõsegítésére és hegképzõdés csökkentésére, és/vagy sebek kezelésére, pl. sebgyógyításra történõ alkalmazása képezi. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott, gyulladás helyi kezelésére és/vagy sebgyógyulásra szolgáló, egyedüli gyulladáscsökkentõ összetevõként PEG¹et tartalmazó készítmények adott esetben tartalmazhatnak továbbá a gyulladást vagy sebgyógyulást közvetlenül nem befolyásoló aktív összetevõket is. Mindezeken túl, vagy alternatív módon a készítmények tartalmazhatnak továbbá adalék anyagokat, például puffereket, sókat, tartósítószereket, illatanyagokat, síkosítószereket vagy kozmetikumok és kenõcsök elõállításában alkalmazott egyéb vegyületeket is. Bebizonyítottuk, hogy PEG¹en kívül egyéb gyulladáscsökkentõ összetevõt nem tartalmazó készítmények igénybe vehetõk gyulladás csökkentésére és sebgyógyulás elõsegítésére. Mindezeknek megfelelõen a találmány meghatározott megvalósítási módjaiban gyulladásos bõr- és/vagy nyálkahártya-megbetegedések és sebek kezelésére olyan készítmények alkalmazására kerül sor, amelyek PEG¹en kívül csak gyulladáscsökkentõ vagy sebgyógyulást elõidézõ hatással nem rendelkezõ [vagy gyulladáscsökkentõ vagy sebgyógyulást elõidézõ hatás eléréséhez túlságosan alacsony (vagy magas) koncentrációban jelen lévõ] vegyületeket vagy adalék anyagokat tartalmaznak. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban a találmány szerinti egy vagy több PEG vagy PEGszármazék molekulatömege (Mr) a 0 és 00 közötti tartományba esik, ilyenek pl. a PEG 0, 300, 400, 600, 800, 00 és 00. Alkalmazásukat megkönnyítõ fizikokémiai jellemzõik miatt alacsony molekulatömegû PEG¹ek alkalmazására számítunk. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban a 0 700 közötti molekulatömeg-tartományba tartozó egy vagy több PEG-alak alkalmazására kerül sor. A találmány szerint alkalmazott készítményekben lévõ PEG homogén (vagyis csak egyfajta PEG¹et tartalmazó), vagy egy vagy több PEG-alak változó arányú keveréke lehet. A találmány szerinti alkalmazásnak megfelelõen a PEG összes különbözõ alakjának készítménybeli koncentrációja jellemzõen 0, tömeg% közötti. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott PEG-koncentrációk elõreláthatóan az 1 tömeg% közötti tartományba, közelebbrõl az 1 3 tömeg% közötti tartományba esnek. A találmány szerinti (összes) PEG-koncentráció 1, 2, 3, 4 vagy tömeg%. Közelebbrõl, a találmány szerinti megoldásokban alkalmazott hidrogélek várható PEG-koncentrációja alacsonyabb, mint a PEG¹et nedvesítõszerként tartalmazó PEG-hidrogélekben alkalmazott PEG-koncentráció. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott PEG¹ek közé tartoznak a fentiekben bemutatott HO (CH 2 CH 2 O) n H általános képlettel leírható, módosítatlan PEG-alakok. Mindezeken túl, vagy alternatív módon, a találmány szerinti megoldásban alkalmazott egy vagy több PEG-alak egy vagy több PEG-származék, közelebbrõl egy vagy több pozícióban egy vagy 2 30 3 40 4 0 60 több alkilszubsztituenssel és/vagy funkcionális szubsztituenssel módosított szubsztituált PEG-alak is lehet. Ilyenek például a PEG 600 diacid, a PEG monoetiléter (MME) és a PEG 30 dimetil-éter (DME). A találmány szerinti, 0, tömeg% közötti, közelebbrõl 1 3 tömeg% közötti PEG-koncentrációjú gyógyászati készítmények kiszerelése vizes oldat, hidrogél vagy hidrogélt tartalmazó készítmény lehet. Ezek a készítmények különösen alkalmasak helyi beadásra. Szakember számára ismertek helyi beadásra szánt megfelelõ hidrogél készítmények. Amint a fentiekben ismertettük, a hidrogélek jellemzõen vízben diszpergált természetes vagy szintetikus polimerláncok hálózatát tartalmazzák. A hidrogéleket általában nedvesség vagy víz visszatartására vagy felszívására alkalmazzák. A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen alkalmas hidrogélek elõállítására hidrokolloidokat, például alginátokat, karbomereket (poliakrilsavakat) (pl. karbopolt), cellulózt és származékait pl. karboximetil-cellulózt (CMC¹t) alkalmaznak. További alkalmas hidrokolloidok az alumínium-oxid, a bentonit, a keményítõ, a glikogén, a zselatin, a pektin, a kitozán, a kitin, a gumiarábikum, a szentjánoskenyér gyanta, a Karaya-gumi, a tragakant, a Ghatti-gumi, az agar-agar, a karragének, a karobgyanta, a guargyanta, a xantángumi, a gliceril-polimetakrilát, a povidon, a poloxamer (IUPAC:2-metil-oxirán; oxirán); a szilícium-dioxid/[alumínium-magnézium] szilikátok. A találmány szerinti megoldásban várhatóan alkalmazott készítményekben lévõ hidrogél viszkozitása a bõrön történõ alkalmazásnak megfelelõ. Kimutattuk azt is, hogy a hidrokolloid hidrogélbeli koncentrációja is hatással van terápiás sebgyógyító aktivitására. Egy hidrogél viszkozitása az alkalmazott kolloid típusának függvényében jelentõsen változik. A találmány szerinti megoldásban történõ alkalmazásra különösen megfelelõ hidrogélek viszkozitása 4 és 4 000 000 mpa s között változik (víz=1 mpa s). A várható viszkozitás jellemzõen kisebb, mint 40 000 mpa s. A találmány egy meghatározott megvalósítási módjában 00 és 300 000 mpa s közötti viszkozitású hidrogélek alkalmazására kerül sor. Az alkalmazástól és a hidrokolloid természetétõl függõen eltérõ viszkozitású hidrogélek alkalmazására is sor kerülhet. Például spray-kben 00 6000 közötti, közelebbrõl 3000 és 00 közötti viszkozitású hidrogél alkalmazható, míg pl. a carbopol hidrokolloidalapú, manuális alkalmazásra szánt gélek esetében jellemzõen 000 és 0 000 közötti viszkozitású hidrogél alkalmazására kerül sor. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban a találmány szerinti megoldásban alkalmazott hidrogélben található hidrokolloidok legalább részlegesen keresztkötöttek, például pentaerythritol allil-étereivel (Carbopol 974P NF vagy Carbopol 980 NF). A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban a hidrogélben a hidrokolloidok nem keresztkötöttek egymással vagy egy mátrixszal (pl. cellulózzal vagy gyapottal). A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban várhatóan egy vagy több PEG-alakot, közelebbrõl alacsony Mr értékû PEG¹et 0, tömeg% koncentrá- 6
cióban, közelebbrõl 0,3 és 6% közötti koncentrációban tartalmazó vizes oldat alapú készítmények alkalmazására kerül sor. A vizes oldatok elõreláthatóan adott esetben puffert tartalmazó fiziológiás oldatok. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott PEG-tartalmú hidrogél vagy vizes készítmény tubusba, üvegbe vagy eldobható tárolóedénybe csomagolható. Alternatív módon a vizes oldatok vagy hidrogélkészítmények várhatóan gézen vagy textilen, vagy mindezek belsejében, vagy hengeres edényben, vagy a hidrogél vagy vizes oldat bõrre permetezésére szolgáló szóróflakonban biztosíthatók. A példák fejezetben bebizonyítjuk, hogy alacsony, pl. 00 vagy az alatti Mr¹értékû készítmény, vagy közelebbrõl 700 vagy alacsonyabb Mr¹értékû készítmény alacsony, vagyis jellemzõen tömeg% alatti, különösen 1 és 3 tömeg% közötti koncentrációban hatással van a gyulladás csökkentése és a sebgyógyulás szempontjából elõnyös egyes proteinek expressziójára. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát PEG gyulladáscsökkentésre vagy gyulladáscsökkentés elõsegítésére és/vagy hegesedés csökkentésére vagy megelõzésére szolgáló helyi kezelésre szánt készítmény egyedüli gyulladáscsökkentõ összetevõjeként történõ alkalmazása képezi. Közelebbrõl, a találmány tárgyát PEG gyulladás kezelésére és/vagy sebgyógyításra szolgáló helyi kezelésre szánt gyógyszer elõállításában egyedüli gyulladáscsökkentõ összetevõként történõ alkalmazása képezi. Mindezeknek megfelelõen a találmány tárgyát egy vagy többféle 0 700 közötti MW értékû PEG-nek megfelelõ, 0, tömeg%, közelebbrõl 0,3 6 tömeg%, még közelebbrõl 1 és 3 tömeg% közötti mennyiségû PEG¹et tartalmazó készítmények képezik, amelyek különösen alkalmasak gyulladásos bõr- és nyálkahártya-rendellenességek kezelésére. A találmány meghatározott megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti megoldásban alkalmazott készítmények helyileg gyulladás által érintett bõrre vagy nyálkahártyára (ideértve az orr és fül nyálkahártyáját) juttatandók. Az említett szövetek gyulladását a következõ öt tulajdonság jellemzi: kipirulás (rubor), melegség (calor), duzzanat (tumor), fájdalom (dolor) és adott esetben az érintett szervek mûködészavara (functio laesa). A találmány szerinti megoldással összefüggésben említhetõ jellemzõ gyulladásos bõr rendellenességek az ekcéma, az akne, a rosacea és számos egyéb kórkép, így a psoriasis, csalánkiütés, kontakt dermatitis (amilyen pl. a foglalkozási dermatitis) és a cserszömörce-mérgezés. Az atópiás dermatitisként is ismert ekcéma hatására a bõr kiszárad, viszketõ és gyulladt lesz. A nyálkahártyák gyulladásos megbetegedései közé tartoznak az orr és melléköbleinek gyulladásai, az idült gyulladásos fülbetegségek, mint például az idült középfülgyulladás. Amint azt fentebb részleteztük, a találmány meghatározott megvalósítási módjaiban PEG és egyéb aktív összetevõk, például napozókrémek vagy melegítõágensek kombinációjának alkalmazására kerül sor. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban 2 30 3 40 4 0 60 ugyanakkor a találmány szerinti megoldásban alkalmazott készítmények nem tartalmaznak irritáló ágenseket, mint például a helyi kezelésre szánt gyógyszerekben jellemzõen elõforduló melegítõanyagokat (pl. kapszaicint vagy mentolt) és/vagy napozókrémeket (pl. benzoesavalapú UV¹elnyelõ vegyületeket, antranilsavalapú UV¹elnyelõ vegyületeket, szalicilsavalapú UV¹elnyelõ vegyületeket, fahéjsavalapú UV¹elnyelõ vegyületeket, benzofenon-alapú UV¹elnyelõ vegyületeket). A találmány ezen megvalósítási módja szerinti készítmények nem irritáljak a bõrt a gyógyulás alatt. A találmány meghatározott megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti megoldásban alkalmazott készítmények helyi sebkezelésére szolgálnak. A találmány szerinti megoldás szerint kezelt sebek jellemzõen nyílt és fedett sebek, ideértve az idült sebeket, amilyenek például az idült lábszárfekélyek, a cukorbetegséghez társuló fekélyek, a felfekvések, valamint frisskeletû sebek (horzsolások, kés okozta vágások), amelyek számára elõnyös a sebgyógyulás elõsegítése, nehezen gyógyuló sebek, mint például a fertõzött sebek, különbözõ fokozatú égési sebek, ideértve a napsugárzás okozta leégést, posztoperatív sebek, bõr transzplantátumok és traumás sebek. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott készítmények 0, tömeg%, közelebbrõl 0,3 6 tömeg%, még közelebbrõl 0, 3 tömeg% közötti, ennél is közelebbrõl 0, 2 tömeg% közötti mennyiségû PEG¹et tartalmaznak, ezek különösen alkalmasak a sebgyógyulás kezdeti fázisában történõ igénybevételre, ahol a mátrix metalloproteinázok (MMP¹k) aktivitásának csökkentése megelõzheti a sebekben a frissen képzõdött mátrix megszakadását. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott gyógyászati készítmények hegek kezelésére is alkalmasak, ekkor a készítmény alkalmazására a sebgyógyulás késõi szakaszában kerül sor. Amint azt a fentiekben részleteztük, a találmány szerinti készítmények várhatóan különféle gyulladásos bõr- vagy nyálkahártya-rendellenességek és sebek kezelésére vehetõk igénybe. A sebek jellemzõen lehetnek száraz, elhalásos sebek, lágy fibrines (nedvedzõ) sebek és granulációs/hámosodó sebek. A seb alapjától (vagyis a váladék mennyiségétõl, a bakteriális szennyezõdéstõl) függõen a találmány szerinti készítmények alkalmazásának gyakorisága változhat. Hasonlóképpen, a bõr vagy nyálkahártya gyulladásos állapotának jellegétõl és súlyosságától függõen a találmány szerinti készítmények alkalmazásának gyakorisága változhat. A találmány szerinti megoldásban szükség esetén a találmány szerinti készítmények ismételt alkalmazására kerülhet sor, ami történhet például ötnaponta egyszer, de leginkább 24 óránként egyszer és 72 óránként egyszer között. Alternatív módon, a beadásra 12 óránként egyszer, négy óránként egyszer, vagy két óránként egyszer is sor kerülhet. Alternatív módon, a találmány szerinti készítmények egyszeri alkalmazása is elképzelhetõ. A találmány szerinti készítmények egyszeri alkalmazásra szánt g¹os tubusokban, vagy többszöri alkalmazásra szánt pl. 30 00 g¹os tubusok- 7
ban, vagy egyszeri vagy többszöri használatra szánt szóróflakonokban is kiszerelhetõk. Mindezektõl függetlenül különféle csomagolások képzelhetõk el, ilyenek a tubusok, a (száj¹, bõr- vagy fül¹) aeroszolok, az üvegek, a golyós eszközök, a pálcák, a végbélkúpok vagy a vaginális eszközök, a fülcseppek, a szemcseppek stb. Mindezek mellett, vagy alternatív módon a találmány szerinti készítményeknek a seb és/vagy a gyulladás területére történõ juttatására kerül sor, megelõzve vagy csökkentve ezáltal a hegképzõdés esélyét. A találmány szerinti készítmények alkalmazása jellemzõen sebkötésként, legfõképpen hidrogélként vagy vizes oldatként történik. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott hidrogélek vagy hidrogéltartalmú készítmények a sebgyógyulás tekintetében a következõ elõnyökkel rendelkeznek: nedves környezetet biztosítanak a sebnek, nem ragadnak a sebhez, könnyen eltávolíthatók, tisztítóhatásuk van (az autolitikus sebtisztulás elõsegítésén keresztül), a hidrogélbeli víz hûtõhatásának köszönhetõen nyugtató hatásúak, nedvszívó hatásúak (a gél duzzadásának köszönhetõen, ami megakadályozza az egészséges sebszélek kiázás miatti ellágyulását. A nedvesen tartott sebek jobban gyógyulnak. A gyógyulási folyamatért felelõs bõrsejtek jobban növekednek és csökken a hegesedés mértéke is. Egyes bõrsebek esetében a bõr olyan száraz, hogy a seb gyógyulása stagnál vagy megáll. Ennek eredményeként a seb nagyobbá és/vagy mélyebbé válhat. A külvilágból érkezõ nedvesség hatására a bõrsejtek visszanyerik gyógyítóaktivitásukat. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott készítmények adott esetben gézzel bevonva vagy impregnált géz formájában állnak rendelkezésre. A találmány szerinti hidrogélek vagy vizes oldatok jelenléte csökkenti a szükségessé váló gézcsere gyakoriságát, felhasználóbarát, ami megkönnyíti a seb vagy bõr ellátását. A könnyebb gyógyulás elõsegíti a bõr és/vagy a seb helyreállítását. A találmány szerinti, PEG-tartalmú készítmények alkalmasak továbbá mesterségesbõr-preparátumok in vitro vagy in vivo kezelésére is. A PEG VEGF-expresszióra, kollagénre és gyulladásos citokinekre gyakorolt hatásának ismeretében a készítmények alkalmasak a mesterséges bõr elõállítására és/vagy in vitro fenntartására, valamint a bõrgraftok in vivo gondozására. A találmány szerinti megoldást a következõ példákkal illusztráljuk. Példák 2 30 3 40 4 0 60 1. példa: PEG tenyésztett sejtekre vonatkozó toxicitása A sejteket DMEM (3T3 fibroblasztok és HaCat keratinociták) vagy RPMI 1640 (J774 makrofágok) tápközegben tenyésztettük. Mindkét tápközeget % hõvel inaktivált magzati borjúsavóval (Sigma), 2 mm L¹glutaminnal (Sigma) és antibiotikumokkal (Sigma) egészítettük ki. A sejteket szubkonfluens állapotban 96 üregû tálcákra juttattuk és kb. 16 órán keresztül tápközegben oldott vizsgált PEG-vegyületekkel inkubáltuk (mennyiségüket tömeg% végkoncentrációban adtuk meg). A sejtek túlélését az oldható tetrazoliumsó oldhatatlan rózsaszín formazánná történõ átalakítása alapján értékeltük (az abszorpciót 70 nm¹en mértük). Az European Pharmacopoeia vagy USP-tisztaságú PEG beszerzési forrása a Sigma volt. A sejteket egy éjszakán át PEG 400 különbözõ (0,31 tömeg%) koncentrációival inkubáltuk. %¹tól felfelé a PEG citotoxikus hatást gyakorolt az in vitro tenyésztett sejtekre, különösen a keratinocitákra (1A. ábra) és a makrofágokra (1B. ábra), valamint kisebb mértékben a fibroblasztokra (1C. ábra). Az % alatti koncentrációk egyik vizsgált sejttípusra sem bizonyultak káros hatásúnak. 2. példa: A PEG MMP-expresszióra gyakorolt hatása Makrofág sejteket 30 percig PEG 400 különbözõ (0,31 tömeg%) koncentrációival elõkondicionáltunk, majd hõvel inaktivált E. coli baktériumokkal provokáltunk. Ezután a sejteket egy éjszakán át tovább inkubáltuk. A sejttenyészetek felülúszóját prommp 9 jelenlétére a gyártó utasításinak megfelelõen vizsgáltuk (R&D systems, Abingdon, UK). A 2. ábrán látható, hogy a J774 makrofág sejtvonal prommp9 szekréciója a PEG 400 durván kb. 1 tömeg%¹os koncentrációjától kezdve lényeges mértékben csökkent. Az MMPk (mátrix metalloproteinázok) a kollagéneket lebontó extracellularis proteinázok. Bár a sebgyógyulás végsõ szakaszában szükséges a jelenlétük, idült sebeknél vagy a sebgyógyulás kezdeti szakaszaiban jelenlétük káros, mivel felbontják a frissen elõállított mátrixot. Ennek megfelelõen az MMP-expresszió módosítására elsõsorban idült sebgyógyulás esetén van igény. 3. példa: A PEG VEGF-expresszióra gyakorolt hatása Fibroblaszt sejteket egy éjszakán át PEG 400 különbözõ (0,31 tömeg%) koncentrációival inkubáltunk. A VEGF-expressziót ELISA-val vizsgáltuk (R&D systems, Abingdon, UK). A 3. ábrán látható, hogy a VEGF-expresszió a PEG 400 2 és tömeg%¹os koncentrációi között fokozódott, maximumát tömeg%-nál érte el. A VEGF a sebgyógyulás kezdeti fázisában az angiogenezis stimulálásán keresztül lényeges szerepet játszó citokin. VEGF-stimuláció hatására a sebek könnyebben képeznek granulációs szövetet. Ennek megfelelõen a sebgyógyulás szempontjából kívánatos a VEGF-termelés serkentése. 4. példa: PEG-származékok hatása citokinek expressziójára Sejteket egy éjszakán át egy PEG-származék különbözõ koncentrációival inkubáltunk. A 4A. ábrán lát- 8
ható, hogy a nem gyulladásos 3T3 fibroblasztsejtek VEGF-expresszióját a PEG 600 diacid növekvõ mennyiségei (0,078 0,62 tömeg%) befolyásolták. A 4B. ábrán látható, hogy a PEG 600 diaciddal vagy PEG DME-vel történt inkubálás hatására csökkent a (30 perces elõinkubálást követõen hõvel inaktivált E. coli baktériumokkal provokált) J774 sejtek pro-mmp9 expressziója. Amint az ábrán látható, mindkét PEG-származék csökkentette a pro-mmp9 gyulladáskeltõ protein expresszióját. A 4C. ábrán tüntettük fel a PEG-származékok hõvel inaktivált E. coli baktériumszuszpenzióval stimulált J774 makrofág sejtek gyulladáskeltõ IL 6-citokin expressziójára gyakorolt hatását. A sejteket PEG (PEG 600 diacid) jelenlétében vagy annak hiányában inkubáltuk. A PEG jelenléte kb. 30%-kal csökkentette az IL 6 expresszióját. A 4D. ábra PEG-származékok (PEG 600 diacid, PEG30 MME és PEG DME) TGF-béta1 gyulladáscsökkentõ citokin expressziójára gyakorolt hatását mutatja be. A PEG-származékok koncentrációfüggõ módon, kismértékben fokozták a J774 makrofág sejtek TGF-béta1 expresszióját. A hatás mérsékelt ugyan, de bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a PEG-származékok nem csökkentik mindegyik citokin expresszióját a makrofágokban. A korábbi kísérletekben megfigyelt pro- MMP9 expresszió csökkenés nem írható a PEG hozzáadását követõen kialakuló általános proteinexpresszió csökkenés számlájára.. példa: A PEG-molekulatömeg és a PEGszármazékok emberi PBMC-kre (perifériás vér eredetû mononuclearis sejtekre) gyakorolt hatása PBMC-ket buffy coat -ból Ficoll Paque-centrifugálással, a gyártó (Sigma) elõírásai szerint izoláltunk. Ezután a vérlemezkék eltávolítása érdekében a sejteket két alkalommal PBS/1 mm EDTA alkalmazásával mostuk. Egy éjszakán át 37 C¹on, % CO 2 mellett történt inkubálást követõen a nem adherens sejteket eltávolítottuk, majd a sejteket további 21 napig tápközegben tenyésztettük ( DMEM high glucose, % FCS, 4 mm L¹glutamin, antibiotikumok). Ennél a pontnál a sejtek az üregek aljára tapadnak és megkülönböztetõ morfológiai jegyekkel bírnak. PEG¹et és PEG-származékokat meghatározott koncentrációkban (w/w) tápközegben oldottunk. A sejteket 30 percig PEG-tartalmú tápközegben tenyésztettük (elõkondicionálás), majd 0 ng/ml LPS¹t (lipopoliszacharidot) adtunk hozzájuk. A sejteket további 16 órán át inkubáltuk. Ezek után begyûjtöttük a felülúszót és azt a meghatározott citokinek jelenléte szempontjából vizsgáltuk (R&D Systems, Abingdon, UK). Az eredmények két független kísérlet átlagai és a kontrollhoz viszonyított százalékot jelentik. A különbözõ típusú (molekulatömegû és származék) PEG¹ek 2,% mennyiségének alkalmazása csökkentette az LPS-stimuláción átesett PBMC¹k gyulladáskeltõ TNF-alfa-szekrécióját (A. ábra). A gyulladáscsökkentõ TGF-béta1 expresszióját a PEG¹ek és a PEG-származékok egyértelmûen fokozták. 2 30 3 40 4 0 60 6. példa: PEG 400 proteinexpresszióra gyakorolt hatása gyógyászati vivõanyagok jelenlétében. J774 makrofágokat 30 percig elõkondicionáltunk a gélekkel, majd 0 ng/ml LPS-sel provokáltunk. A 3T3 sejteket nem provokáltuk baktériumokkal. Ezután az egér eredetû J774 makrofág és egéreredetû 3T3 fibroblasztsejteket 16 órán át 37 C¹on % CO 2 jelenlétében a gélekkel inkubáltuk. Ezután begyûjtöttük a tápközeget, percig 14000 rpm mellett centrifugáltuk a szilárd részecskék eltávolítása érdekében majd a megadott szekretált proteinek jelenlétére vizsgáltuk. Az eredmények két független kísérlet átlagai és a kontroll kísérlethez viszonyított százalékot jelentik. A: Na + Ca ++ alginát gél 2 g Kelset (Na + Ca ++ alginát) és g PEG 400 alkalmazásával 0 ml végtérfogatú tápközegben ( DMEM high glucose, % FCS, 4 mm L¹glutamin, antibiotikumok) hidrogélt állítottunk elõ. A keveréket az oldatok viszkozitásának csökkentése érdekében további 0 ml tápközeg hozzáadásával tovább hígítottuk. A PEG 400 végkoncentrációja 2,% volt. Kontrollként hasonló oldatot használtunk PEG 400 nélkül. A 6A. ábrán látható, hogy a 3T3 sejtek IL 6 expressziója csökkent, míg a VEGF növekedési faktor expressziója kismértékben fokozódott a 2,% PEG 400-tartalmú hidrogén hatására. A 6B. ábrán látható, hogy mindkét gyulladáskeltõ citokin, az IL 6 és a pro-mmp9 J774 sejtekben mutatott szekrécióját csökkentette a PEG. B: Poliakrilátgél 1 g Carbopol (poliakrilát), g PEG 400, 2,1 g arginin és 3 g PCL (cetaril oktanoát) alkalmazásával 0 ml teljes végtérfogatú tápközegben [DMEM (high glucose), % FCS, 4 mm L¹glutamin, antibiotikumok] hidrogélt állítottunk elõ. A keveréket az oldatok viszkozitásának csökkentése érdekében további 0 ml tápközeg hozzáadásával tovább hígítottuk. Egéreredetû J774 makrofág tenyészetet vizsgáltunk. A PEG 400- sejtekkel érintkezõ végkoncentrációja 2,% volt. Kontrollként hasonló oldatot használtunk PEG 400 nélkül. A 7. ábrán látható, hogy mindkét gyulladáskeltõ citokin, az IL 6 és a pro-mmp9 expresszióját csökkentette a sejtek PEG-tartalmú hidrogéllel történt érintkezése. C: Karboxi-metil-cellulóz-gél 3 g CMC (Na + -karboxi-metil-cellulóz) és gpeg 400 alkalmazásával 0 ml teljes végtérfogatú tápközegben [DMEM (high glucose), % FCS, 4 mm L¹glutamin, antibiotikumok] hidrogélt állítottunk elõ. Ezt a keveréket az oldatok viszkozitásának csökkentése érdekében további 0 ml tápközeg hozzáadásával tovább hígítottuk. Egéreredetû J774 makrofág tenyészetet vizsgáltunk. A PEG 400 végkoncentrációja 2,% volt. Kontrollként hasonló oldatot használtunk PEG 400 nélkül. A 8. ábrán látható, hogy az IL 6-citokin expresszióját egyértelmûen csökkentette a sejtek 0 ng/ml LPS- 9
sel történt provokálása, míg a pro-mmp9 expressziója kisebb mértékben csökkent a sejtek PEG-tartalmú hidrogéllel történt érintkezésének hatására. A B és C eredményeinek összehasonlításával kiderült, hogy a vivõanyag (karbopol vagy CMC) szintén hatást gyakorolt a J774 sejtek által szekretált (expresszált) proteinekre. A PEG 400 minden körülmény között csökkentette a gyulladáskeltõ proteinek expresszióját. A fenti példák azt illusztrálták, hogy a PEG 400 a sebgyógyulásban szerepet játszó számos protein (elsõsorban MMP¹k, gyulladáskeltõ citokinek) expresszióját módosítja. Idült sebekben a mátrix metalloproteinázok mennyiségének csökkentése visszaállítja a kollagénlerakódást és csökkenti a kollagéndestrukciót. Mindezek optimális granulációs szövet alap kialakítását segítik elõ. A VEGF mennyiségének növelése a seb alapjában stimulálja az endotélsejteket és fokozza az angiogenezist, ami a sérülés helyére irányuló véráramlás megnövekedéséhez vezet. Bár a PEG 400 kb. tömeg% koncentrációtól citotoxikus hatású, létezik egy úgynevezett terápiás ablak (kb. 0,3 és 6 tömeg% PEG, közelebbrõl 1 és 3 tömeg% PEG 400 között), ahol a PEG 400 jótékony hatása érzékelhetõ. 7. példa: PEG 400 hatása a VEGF és kollagén III proteinek expressziójára VEGF A PEG és/vagy egyéb nedvesítõszerek hatására kialakuló VEGF-expressziót vascularis endotélsejtek (SVEC) és fibroblasztsejtek (3T3) esetében vizsgáltuk. A VEGF ischaemiás sebek gyógyulásában mutatott jótékony hatásáról Corrall és mtsai. számoltak be [Arch. Surg. 134, 0., (1999)]. Az említett sejtek 4% PEG 400-zal, 4% propilénglikollal és 4% glicerinnel történt kezelése alapján megállapítottuk, hogy a VEGF expressziója PEG esetében volt a legnagyobb mértékû, valamint az endotélsejtek és a fibroblasztok VEGF-expressziójában megfigyelhetõ különbség a PEG 400 esetében volt a legkifejezettebb (9. ábra). A. ábrán látható, hogy a PEG 400 propilénglikollal készített kombinált kiszerelései kisebb mértékben hatottak a VEGF-expresszióra, mint a csak PEG 400¹at tartalmazó készítmények. Kollagén A III. típusú kollagén expressziója a sebgyógyulás kezdeti szakaszában a granulációs szövetben fokozott mértékû [Haukiporo és mtsai. (1987) Ann. Surg. 6, 72 76]. Az idült sebek jellemzõje a magas kollagenázaktivitás és a következményes kollagén lebomlás. A kollagénképzõdést elõidézõ vegyületek alkalmazása ennek megfelelõen elõnyös mind a sebgyógyulás kezdeti szakaszában, mind az idült sebek kezelésében. Mindezek mellett a granulációs szövet összetevõinek gyarapítása elõnyös a seb gyorsabb gyógyulása szempontjából, ami csökkenti a hegképzõdésben megnyilvánuló komplikációk veszélyét. A 3T3 sejtek 4% PEG 400-zal, 4% propilénglikollal és 4% glicerinnel történt kezelése eredményeinek 2 30 3 40 4 0 60 összehasonlítása alapján megállapítottuk, hogy a kollagén expressziója PEG 400 esetében volt a legnagyobb mértékû (11. ábra). A III. típusú kollagén expressziójának ez a fokozódása a kontrollhoz képest szignifikáns mértékû volt. 8. példa: PEG-készítmények in vivo sebeken történõ alkalmazása egér sebgyógyulás modellben A PEG-tartalmú készítmények sebgyógyulást elõsegítõ hatását egér sebgyógyulás modellben értékeltük. A vizsgálatot vad típusú és leptin receptor mutációt hordozó egereken vizsgáltuk (BKS, Cg¹m +/+ Leps) (Jackson Laboratory, Maine, USA). Az említett egerek cukorbetegek és gátolt a sebgyógyulásuk. Eljárás: Az egerek hátán lenyírtuk a szõrt, elaltattuk õket és punch típusú bõrbioptátum vevõeszközzel a bõr teljes vastagságára kiterjedõ sebeket ejtettünk rajtuk. Állatonként hat-hat sebet készítettünk. A beavatkozást követõen Carbopolt, alkalizáló arginint és 1% PEG¹et tartalmazó hidrogél készítményt helyeztünk a sebre. A PEG- vagy a kontrollkészítménnyel végzett sebkezelést követõ 0., 7., 14. és 21. napokon egereket irtottunk ki, majd a bõrt szabad szemmel és immunhisztokémiai eljárásokkal vizsgáltuk. 9. példa: PEG-tartalmú helyi kezelésre szánt készítmény in vivo alkalmazása emberi bõrön A) Egy kétéves fiú elesett az utcán és a lábán horzsolásokat szenvedett. A sebet naponta kétszer 1% PEG 400¹at tartalmazó carbopol hidrogéllel kezeltük. Másodlagos kötést nem tudtunk alkalmazni, mivel azt a fiú folyton letépte. A seb a hasonló balesetekben gyakran megfigyelhetõ duzzanat vagy egyéb gyulladásos komplikáció jelei nélkül három napon belül szépen gyógyult. B) Egy 28 éves profi focista száraz focipályán történt becsúszást követõen viszonylag nagy horzsolást szenvedett. A sebet váladék és szennyezõdés borította. Rövid öblítést követõen 1% PEG 400-tartalmú carbopol hidrogélt juttattunk a sebre, majd azt másodlagos kötéssel fedtük. A gélt naponta egy alkalommal alkalmaztuk. A játékos gyulladásos komplikációk nélküli, három napon belül történt gyógyulásról számolt be, míg tapasztalatai szerint korábbi beavatkozások esetében ez a folyamat 4 6 napot vett igénybe. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Polietilénglikol (PEG) egy vagy több, 00 alatti molekulatömegû (Mr) alakjának egyedüli gyulladáscsökkentõ komponensként történõ alkalmazása hidrogél vagy vizes oldat formájú, az egy vagy több polietilénglikolt (PEG¹et) 0, tömeg% közötti koncentrációban tartalmazó, bõr vagy nyálkahártya gyulladásának kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszerben a polietilénglikol (PEG) egy vagy több alakjának koncentrációja 0, és 3 tömeg% közötti.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszerben a polietilénglikol egy vagy több alakjának koncentrációja 1 és 2, tömeg% közötti. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer a PEG¹en kívül nem tartalmaz egyéb nedvesítõszert.. Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a PEG egy vagy több alakjának molekulatömege (Mr) 0 és 700 közötti. 6. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a hidrogél 0,0 % közötti koncentrációjú poliakrilát hidrokolloid. 7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyulladás sebben vagy gyulladásos bõr- vagy nyálkahártya-betegségben alakult ki. 8. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyulladás kezelésének célja a hegképzõdés megelõzése vagy a sérült bõr vagy nyálkahártya helyreállítása. 9. Hidrogél vagy vizes oldat bõr vagy nyálkahártya gyulladásának csökkentésére történõ alkalmazásra, amely egyedüli gyulladáscsökkentõ összetevõként 0, tömeg% közötti koncentrációban egy vagy több 00 alatti molekulatömegû (Mr) PEG-alakot tartalmaz.. Hidrogél vagy vizes oldat, a 9. igénypont szerinti alkalmazásra, ahol a polietilénglikol (PEG) egy vagy több alakjának koncentrációja 0, és 3 tömeg% közötti. 11. Hidrogél vagy vizes oldat, a 9. vagy. igénypont szerinti alkalmazásra, ahol a polietilénglikol (PEG) egy vagy több alakjának koncentrációja 1 és 2, tömeg% közötti. 12. Hidrogél vagy vizes oldat, a 9 11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazásra, ahol a bõr vagy nyálkahártya gyulladásának csökkentése elõsegíti egy seb gyógyulását és/vagy megelõzi a hegszövet kialakulását és/vagy javítja a bõr helyreállítását. 13. A 9 11. igénypontok bármelyike szerinti hidrogél vagy vizes oldat, gyulladásos bõrbetegségben a bõr gyulladásának csökkentésére történõ alkalmazásra. 14. Hidrogél vagy vizes oldat, a 9 13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazásra, ahol a hidrogél vagy vizes oldat PEG¹en kívül nem tartalmaz egyéb nedvesítõszert.. Hidrogél vagy vizes oldat, a 12. igénypont szerinti alkalmazásra, ahol a seb idült seb. 16. Hidrogél vagy vizes oldat, a 9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazásra, amely 0,0 és % közötti koncentrációjú poliakrilát-hidrokolloid. 11
HU 007 309 T2 Int. Cl.: A61K 31/76 12
HU 007 309 T2 Int. Cl.: A61K 31/76 13
HU 007 309 T2 Int. Cl.: A61K 31/76 14
HU 007 309 T2 Int. Cl.: A61K 31/76
HU 007 309 T2 Int. Cl.: A61K 31/76 16
HU 007 309 T2 Int. Cl.: A61K 31/76 17
HU 007 309 T2 Int. Cl.: A61K 31/76 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest