(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 21 (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 0021 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: C12Q 1/00 (06.01) G01N 33/43 (06.01) G01N 33/8 (06.01) () Elsõbbségi adatok: US (72) Feltalálók: Byrd, Patricia, Gilroy, California 90 (US); Qian, Suyue, Fremont, California 9439 (US); Hartz, Thomas P., Los Gatos, California 9032 (US) (73) Jogosult: LIFESCAN, INC., Milpitas, CA (US) (74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Eljárások és készítmények redox reagensrendszerhez tartozó enzimek jellemzésére (7) Kivonat A találmány tárgyát eljárások és készítmények képezik redox reagensrendszerhez tartozó enzimek jellemzésére. A találmány szerinti eljárások gyakorlati kivitelezésében egy redox reagensrendszerhez tartozó enzimet és ismert mennyiségû szubsztrátot tartalmazó mintát juttatnak egy olyan elektrokémiai cellába, amely egy redox reagensrendszer mediátorát tartalmazó, enzimmentes reagenskészítményt tartalmaz. A találmány tárgyát képezik elektrokémiai tesztcsíkok is, amelyek találmány szerinti elektrokémiai cellákat, és ezeket tartalmazó rendszereket és reagenskészleteket tartalmaznak. A találmány szerinti megoldás sokféle, különbözõ alkalmazásban használható, például redox reagensrendszer jellemzésére szolgáló alkalmazásokban. HU T2 A leírás terjedelme oldal (ezen belül 7 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T2 2 Bevezetés A találmány mûszaki háttere Analitok (különféle analizálandó anyagok) kimutatásának fiziológiás folyadékokban vagy mintákban, például vérben vagy vérbõl készült termékekben egyre nagyobb jelentõsége van korunk társadalmában. Analitok kimutatására szolgáló vizsgálati eljárások különféle alkalmazásokban megtalálhatók, például klinikai laboratóriumi tesztelésben, otthoni tesztelésben stb., ahol az ilyen tesztelés eredményei kiemelkedõ jelentõségûek különféle betegállapotok diagnózisában és kezelésében. Vizsgált analit lehet glükóz cukorbetegség kezelésében, koleszterin és hasonlók. Az analitok kimutatásának ilyen növekvõ jelentõségére reagálva különféle analitikai kimutatási eljárásokat és eszközöket fejlesztettek ki klinikai és otthoni alkalmazásra egyaránt. Analitok kimutatására kifejlesztett, egyik ilyen eljárástípus egy elektrokémiai módszer. Ilyen eljárásokban vizes, folyékony mintát helyeznek egy olyan elektrokémiai cellában lévõ reakciózónába, amely legalább két elektródát, azaz referencia- és munkaelektródát tartalmaz. Lehetõvé válik, hogy az analizálandó komponens egy elektródával közvetlenül, vagy egy redox reagenssel közvetlenül vagy közvetetten reagáljon, ezáltal egy oxidálható (vagy redukálható) anyag képzõdjön az analizálandó komponens, azaz az analit koncentrációjának megfelelõ mennyiségben. Ezután a jelen lévõ oxidálható (vagy redukálható) anyag mennyiségét elektrokémiailag lehet meghatározni, és ez arányos az eredeti mintában lévõ analit mennyiségével. Sok ilyen, analit kimutatására szolgáló, elektrokémiai megközelítésben az analit oxidálása által keltett jelet elõállító rendszerben egy enzimkomponenst és egy mediátorkomponenst alkalmaznak, ahol az enzimkomponens oxidálja a kimutatandó analitot, azután átvisz egy elektront egy mediátorra, amely viszont átviszi az elektront az elektrokémiai cellában lévõ elektródára, ezáltal elektromos jelet kelt, amelybõl meg lehet határozni az analit koncentrációját. Analit elektrokémiai kimutatására szolgáló vizsgálati eljárások és rendszerek tervezésekor kívánatos az analitra specifikus enzimet alkalmazni. Például glükóz meghatározásához pirrolokinolin-kinon- (PQQ¹) függõ glükózdehidrogenáz (a továbbiakban s¹gdh-nak nevezzük) az egyik enzim, amit alkalmazni lehet glükózoxidálásra alapuló jelkeltési rendszerben. Az s¹gdh gyenge elektronakceptor, és ezért kedvezõ módon érzéketlen oxigén jelenlétére folyékony mintákban. Azonban a természetesen elõforduló vagy vad típusú s¹gdh hátránya, hogy nemcsak glükózt oxidál, hanem redukálócukrokat is, például maltózt, galaktózt, laktózt, mannózt, xilózt és ribózt. Az s¹gdh glükóztól különbözõ cukrokra kifejtett reaktivitása bizonyos esetekben ronthatja a vércukorszintek meghatározását néhány cukorbeteg páciensben. Például peritoneális dialízisben icodextrinnel (egy glükózpolimerrel) kezelt páciensek vérében magas lehet a maltóz szintje. Az s¹gdh specifitásának ilyen hiánya odavezetett, hogy erõfeszítéseket tettek az s¹gdh specifitásának javítására, az enzim mutáns formáinak elõállításával, például amelyekben egy vagy több aminosavszubsztitúció történt. Azonban, mielõtt ilyen megváltoztatott enzimeket alkalmaznak, tesztelni kell ezeket, hogy meghatározzák alkalmasságukat analit kimutatására szolgáló, vizsgálati eljárásokban. Idõigényes, spektrofotometriás vizsgálati eljárásokat alkalmaztak s¹gdh aktivitásának meghatározására, de ezeket csak enzimlimitáló körülmények között alkalmazzák. Spektrofotometriás vizsgálati eljárásokat, amelyekben 2,6-diklór-fenol-indofenolt (DCIP) és fenazin-metoszulfátot (PMS) alkalmaznak mesterséges mediátorként, leírtak a 6,3,09 számú USA-beli szabadalmi leírásban és az EP A1 számú európai szabadalmi bejelentésben. Azonban a kereskedelmi forgalomban kapható, s¹gdh¹t tartalmazó glükóztesztcsíkokban nem alkalmaznak enzimlimitáló körülményeket, mert az enzim feleslegben van amiatt, hogy hosszú ideig biztosítsák a tesztcsík hatékonyságát. Rekombináns fehérjéket, például s¹gdh mutáns formáit általában csak kis mennyiségekben termeltetnek. Ilyen mutáns s¹gdh-formák reaktivitásának tesztelésére enzimmel burkolt tesztcsíkokat készítenek, és minden egyes lot tesztcsíkot olyan teljes vérrel vagy plazmával tesztelnek, amelyhez hozzáadnak glükózt és az egyes lehetséges zavaró (például redukáló¹) cukrokat több koncentrációban. s¹gdh mutáns formáival burkolt tesztcsíkok elõállításához nagy mennyiség szükséges az egyes mutánsokból, idõ- és munkaigényes, és szükség van arra, hogy a technikusok emberi vérrel vagy plazmával dolgozzanak, ami biológiailag veszélyes lehet. Ennek megfelelõen szükség van egy olyan gyors és olcsó vizsgálati eljárásra, amelyben szubsztrát limitáció van, annak meghatározására, hogy egy adott mutáns enzim, például s¹gdh nagy mennyiségû termeltetésének van¹e értelme javított glükózspecifitása miatt, vad típusú s¹gdh-hoz képest. A vizsgálati eljárásnak olyan, vért nem tartalmazó mintákon is alkalmazhatónak kell lennie, amelyekbe glükózt vagy zavaró cukrokat adagoltak, olyan teljesvér- vagy plazmaminták helyett, amelyekhez redukálócukrokat adagoltak ( spike ). Tehát ezen a területen szükség van még olyan eljárásra, amely gyors és egyszerû, és alkalmas mutáns s¹gdh-formák szénhidrát-specifitásának meghatározására, amelyben kis mennyiségû enzimet alkalmaznak, és szubsztrátlimitáló körülményeket modellez tipikus elektrokémiai alapú tesztcsíkon, amely analit (például glükóz) mérésére szolgál egy folyékony mintában (például teljes vérben vagy plazmában). Továbbá szintén kívánatos gyors és egyszerû eljárás enzimaktivitás mérésére. Tárgyhoz tartozó irodalom,484,708;,723,284;,834,224;,942,2;,912,199;,997,817; 6,09,946; 6,083,7; 6,3,09; 6,121,009; 6,134,461; 6,179,979; 6,193,973; 6,231,31; 6,284,12; 6,3,428; 6,444,11 és 6,716,77 számú USA-beli szabadalmi leírások; valamint más szabadalmi iratok: US 03/049; WO 99/497; WO 97/1846; WO 01/7; WO 01/7238; 2

3 1 HU T2 2 WO 02/48707; WO 02/0609; WO 02/06788 számú nemzetközi közzétételi iratok; EP ; EP11762; JP A és GB számú szabadalmi iratok. A találmány összefoglalása A találmány tárgyát eljárások és készítmények képezik redox reagensrendszerhez tartozó enzimek jellemzésére. A találmány szerinti eljárások gyakorlati kivitelezésében egy redox reagensrendszerhez tartozó enzimet és ismert mennyiségû szubsztrátot tartalmazó mintát juttatunk egy olyan elektrokémiai cellába, amely egy redox reagensrendszer mediátorát tartalmazó, enzimmentes reagenskészítményt tartalmaz. A találmány tárgyát képezik elektrokémiai tesztcsíkok is, amelyek találmány szerinti elektrokémiai cellákat, és ezeket tartalmazó rendszereket és reagenskészleteket tartalmaznak. A találmány szerinti megoldás sokféle, különbözõ alkalmazásban használható, például redox reagensrendszer jellemzésére szolgáló alkalmazásokban. Az ábrák rövid leírása A találmány szerinti megoldás jellemzõit és elõnyeit jobban megértjük az alábbi részletes leírás alapján, amelyben bemutatjuk a találmány szemléltetés célját szolgáló, elõnyös megvalósítási módjait, ahol a találmány szerinti megoldás elveit alkalmazzuk, és a csatolt ábrák alapján, amelyek: az 1. ábrán egy folyamatábra látható, ami a találmány példaként bemutatott elõnyös megvalósítási módja szerint végzett eljárásban, az egymást követõ lépéseket szemlélteti, mutáns s¹gdh-formák tesztelésére, a 2A. és 2B. ábrán perspektivikusan bontva és felülnézetben ábrázolva, sorrendben, látható a példákban bemutatott, találmány szerinti eljárásban alkalmazható tesztcsík, a 3. ábrán egy folyamatábra látható, ami a találmány példaként bemutatott elõnyös megvalósítási módja szerint végzett eljárásban, az egymást követõ lépéseket szemlélteti, vad típusú s¹gdh és mutánsai aktivitásának mérésére, a 4. ábrán látható grafikon vad típusú s¹gdh¹re és két mutáns formájú s¹gdh¹re (Asn44Thr és Asp167Glu) kapott abszolút eltérést mutatja egy olyan kontrollhoz képest, amely nem tartalmazott zavaró cukrokat, a xilózkoncentráció függvényében, hagyományos enzimmel burkolt tesztcsík alkalmazásával, az. ábrán látható grafikon a válasz mértékét mutatja a cukorkoncentráció függvényében, hagyományos enzimmel burkolt tesztcsík esetén, amelyben az enzim vad típusú s¹gdh, a 6. ábrán látható grafikon a válasz mértékét mutatja a cukorkoncentráció függvényé ben, vad típusú s¹gdh alkalmazásával, a találmány szerinti eljárásban, a 7. ábrán látható grafikon a válasz mértékét mutatja a cukorkoncentráció függvényében, Asn43Thr, mutáns s¹gdh-forma alkalmazásával, a találmány szerinti eljárásban, a 8. ábrán látható grafikon a válasz mértékét mutatja a cukorkoncentráció függvényében, Asp167Glu, egy másik mutáns s¹gdh-forma alkalmazásával, a találmány szerinti eljárásban, a 9. ábrán bemutatunk egy standard görbét vad típusú s¹gdh¹ra, amit a találmány szerinti eljárás alkalmazásával kaptunk, a. ábrán bemutatunk egy standard görbét, ami a 9. ábrán bemutatott görbét szemlélteti dupla reciprok görbeként. A találmány konkrét elõnyös megvalósítási módjainak leírása A találmány tárgyát képezik eljárások és készítmények redox reagensrendszerhez tartozó enzim jellemzésére. A találmány szerinti eljárások gyakorlati kivitelezésében egy redox reagensrendszerhez tartozó enzimet és ismert mennyiségû szubsztrátot tartalmazó mintát juttatunk egy olyan elektrokémiai cellához, amely egy redox reagensrendszer mediátorát tartalmazó, enzimmentes reagenskészítményt tartalmaz. A találmány tárgyát képezik elektrokémiai tesztcsíkok is, amelyek a találmány szerinti elektrokémiai cellát, és ezt tartalmazó rendszereket és reagenskészleteket tartalmaznak. A találmány szerinti megoldás sokféle, különbözõ alkalmazásokban használható, például redox reagensrendszer jellemzésére szolgáló alkalmazásokban. A találmány által igényelt oltalmi kört a csatolt szabadalmi igénypontokban fektetjük le. A leírásban és a csatolt szabadalmi igénypontokban az egy és a névelõk egyes számban történõ említésével többes számot is értünk, hacsak a szövegösszefüggés egyértelmûen másra nem utal. Hacsak másképpen nem definiáljuk, a leírásban minden mûszaki és tudományos szakkifejezést ugyanabban az értelemben használunk, mint amit ezen a találmány szerinti megoldás szakterületén jártas szakember általában ért. Ahol egy értéktartományt adunk meg, nyilvánvaló, hogy az egyes közbensõ értékek, hacsak a szövegösszefüggés egyértelmûen másra nem utal, az alsó határérték egységének egytizedéig, a tartomány felsõ és alsó határértéke között, és bármilyen más meghatározott vagy közbensõ érték ebben a kijelölt tartományban a találmány tárgykörébe esik. Ezeknek a kisebb tartományoknak a felsõ és alsó határértékei függetlenül beletartozhatnak a kisebb tartományokba, és szintén a találmány tárgykörébe esnek, és speciális esetben kizárható határértékek lehetnek a kijelölt tartományban. Ha a kijelölt tartományba az egyik vagy mindkét határérték beletartozik, az egyik vagy mindkét ilyen beletartozó határértéket kizáró tartományok is a találmány tárgykörébe esnek. 3

4 1 HU T2 2 Hacsak másképpen nem definiáljuk, a leírásban minden mûszaki és tudományos szakkifejezést ugyanabban az értelemben használunk, mint amit ezen a találmány szerinti megoldás szakterületén jártas szakember általában ért. Bár a leírtakkal hasonló vagy ekvivalens, bármilyen módszert, eszközt és anyagot lehet alkalmazni a találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésében és tesztelésében, az elõnyös módszereket, eszközöket és anyagokat a leírásban ismertetjük. A leírásban idézett minden közleményt teljes egészükben a kitanítás részének tekintünk a közleményekben ismertetett olyan sejtvonalak, vektorok és módszerek leírása és ismertetése céljából, amelyeket a találmány szerinti megoldással összefüggésben alkalmazunk. A fentebb összefoglaltak szerint, a találmány tárgyát képezik eljárások és készítmények egy enzim jellemzésére. A találmány szerinti megoldás ismertetésében a továbbiakban részletesebben áttekintjük a találmány szerinti eljárásokat és annak konkrét, elõnyös alkalmazásait, azután áttekintjük azokat a reprezentatív készítményeket és rendszereket, amelyek a találmány szerinti eljárások gyakorlati kivitelezésében alkalmazhatók. Módszerek A fentebb összefoglaltak szerint, a találmány tárgyát enzim jellemzésére szolgáló eljárások képezik. Enzim jellemzésén azt értjük, hogy meghatározzuk az enzim tulajdonságát vagy paraméterét. A tulajdonság lehet az enzimhez eleve hozzárendelhetõ tulajdonság, például szubsztrátszelektivitása, vagy egy olyan tulajdonság, ami legalábbis részben, függ a környezetétõl, például az enzim koncentrációja egy adott folyékony közegben, az enzim aktivitása egy adott folyékony közegben stb. A tulajdonság lehet természetesen egyaránt eleve hozzárendelhetõ és környezeti faktorok eredménye. Konkrét, reprezentatív tulajdonságokat, amelyeket a találmány szerinti eljárások alkalmazásával meg lehet határozni, lentebb részletesen ismertetünk. Az eljárásokban egy redox reagensrendszerhez tartozó enzimet tartalmazó mintát juttatunk egy elektrokémiai cellához, és detektáljuk a cella által keltett elektromos jelet, ahol azután a detektált jelet használjuk fel a redox reagensrendszerhez tartozó, mintában jelen lévõ enzim jellemzésére. A találmány bizonyos reprezentatív elõnyös megvalósítási módjainak jellemzõje, hogy az elektrokémiai cellával érintkeztetett minta egy redox reagensrendszerhez tartozó enzimet és ismert mennyiségû szubsztrátot tartalmaz, míg az elektrokémiai cella, amelyhez a mintát juttatjuk, olyan enzimmentes reagenskészítményt tartalmaz, amely annak a redox reagensrendszernek mediátorkomponensét tartalmazza, amelynek tagja a mintában lévõ enzim. A mintát és az elektrokémiai cella komponenseit, amelyeket a találmány szerinti eljárások elõnyös megvalósítási módjai szerint alkalmazunk, most részletesebben, külön-külön ismertetjük Minta A minta, amit a találmány szerinti eljárások gyakorlati kivitelezésében érintkeztetünk az elektrokémiai cellával, egy redox reagensrendszerhez tartozó enzimet és az enzim ismert mennyiségû szubsztrátját vagy legalábbis potenciális szubsztrátját, azaz egy enzimszubsztrátot tartalmaz. Enzim A minta enzimkomponense, a találmány több elõnyös megvalósítási módja szerint, egy enzim vagy több enzim, amelyek összhangban mûködnek egy kimutatandó analit oxidálása céljából. Más szavakkal kifejezve: az enzimtag állhat egyetlen, analitot oxidálni képes enzimbõl, vagy két vagy több enzim keverékébõl, amelyek összhangban mûködnek egy adott, kimutatandó analit oxidálása céljából, ami lehetõvé tesz elektrokémiai jel elõállítását egy elektrokémiai cellában, a lentebb leírtak szerint. Vizsgált enzimek lehetnek oxidázok, dehidrogenázok, lipázok, kinázok, diaforázok, quinoproteinek és hasonlók. Még konkrétabb reprezentatív, vizsgált enzim lehet, de ezekre nem korlátozva: glükózoxidáz, glükózdehidrogenáz, koleszterinészteráz, koleszterinoxidáz, lipoproteinlipáz, glicerokináz, glicerin-3-foszfát-oxidáz, laktátoxidáz, laktátdehidrogenáz, piruvátoxidáz, alkoholoxidáz, bilirubinoxidáz, urikáz és hasonlók. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módja szerint, a vizsgált enzim glükózdehidrogenáz, például s¹gdh vagy mutánsa, lentebb részletesen leírtak szerint. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, az enzimkomponens körülbelül 3 és körülbelül M közötti, rendszerint körülbelül 80 és körülbelül 270 M közötti koncentrációtartományban lehet jelen. Enzimszubsztrát A találmány szerinti eljárásokban alkalmazott minta ismert mennyiségû enzimszubsztrátot is tartalmaz. Az enzimszubsztrát lehet a mintában jelen lévõ enzim ismert szubsztrátja, vagy a mintában jelen lévõ enzim kiválasztott szubsztrátja. Például, ha az enzim glükózdehidrogenáz, a mintában lévõ szubsztrát lehet glükóz (amelyrõl ismeretes, hogy az enzim szubsztrátja) vagy más cukor, például maltóz, amelyrõl szintén ismeretes, hogy az enzim szubsztrátja, vagy feltételezzük, hogy az enzim szubsztrátja. Az ismert mennyiség azt jelenti, hogy a minta definiált vagy elõre meghatározott mennyiségû vagy koncentrációjú szubsztrátot tartalmaz. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, a mintában lévõ enzimszubsztrát koncentrációja körülbelül 0 és körülbelül 0 mm közötti (körülbelül 0 és körülbelül 900 mg/dl közötti), rendszerint körülbelül 0 és körülbelül 4 mm közötti (körülbelül 0 és körülbelül 8 mg/dl közötti) tartományban van. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, ha az enzimszubsztrát egyértelmûen jelen van, a mintában lévõ enzimszubsztrát koncentrációja körülbelül 0,1 és körülbelül 0 mm közötti (például körülbelül 0,01 és körülbelül 900 mg/dl közötti), rendszerint körülbelül 0,1 és körülbelül 4 mm közötti (például körül- 4

5 1 HU T2 2 belül 0,01 és körülbelül 8 mg/dl közötti) tartományban van. Koenzim A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, a folyékony közegû minta koenzimet is tartalmaz, amely aktiválja az enzimkomponenst. Szóba jöhetõ koenzim például pirrolokinolin-kinon (PQQ). Más, szóba jöhetõ koenzim például, de ezekre nem korlátozva: nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD), flavin-adenin-dinukleotid (FAD), citokróm és hasonlók, a tesztreagensben alkalmazott enzim típusától függõen. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, bármilyen koenzim koncentrációja körülbelül 60 és körülbelül 670 M, rendszerint körülbelül 0 és körülbelül 4 M közötti tartományban lehet. Enzimkofaktor A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, a minta továbbá egy vagy több enzimkofaktort tartalmaz. Szóba jöhetõ enzimkofaktorok lehetnek kétértékû fémionok, például Ca 2+,Mg 2+ stb. Bármilyen kofaktor koncentrációja körülbelül 0, és körülbelül mm közötti tartományban lehet. Elektrokémiai cella A fentebb összefoglaltak szerint, a találmány szerinti eljárások gyakorlati kivitelezésében a mintát egy olyan elektrokémiai cellához juttatjuk, amely enzimmentes reagenskészítményt tartalmaz. Elektrokémiai cellák sok különbözõ konfigurációtípusban ismertek, például olyanok, amelyeket az alábbi szabadalmi iratokban írtak le:,723,284;,834,224;,942,2;,972,199;,997,817; 6,083,7; 6,121,009; 6,134,461; 6,193,973 és 6,716,77 számú USA-beli szabadalmi leírások; valamint más szabadalmi iratok: WO 99/497; WO 97/1846; WO 01/7; WO 01/7238; WO 02/48707; WO 02/0609 számú nemzetközi közzétételi iratok; EP A2 és GB számú szabadalmi iratok. Az itt leírtak bármelyike és szakember által ismert, bármilyen más elektrokémiai cella módosítható a találmány szerinti készítmények beépítése céljából. A találmány szerinti elektrokémiai cella egy elektrokémiai tesztcsíkban van. A találmány szerinti elektrokémiai tesztcsíkot bemutatjuk a 2A. és 2B. ábrán. A 2A. ábrán az elektrokémiai tesztcsík perspektivikus bontott részábrázolása látható, amely munkaelektródából és referenciaelektródából áll, és ezek egy távtartó réteggel vannak elválasztva, amelyben egy kivágott rész van, ami meghatározza az összeszerelt tesztcsík reakciózónáját vagy reakcióterét; ezeket az elemeket lentebb részletesen leírjuk. A 2B. ábrán ugyanezt a tesztcsíkot összeszerelt formában láthatjuk. Az egyes alkotórészeket lentebb most részletesen leírjuk Elektródák A találmány szerinti elektrokémiai tesztcsíkok, amelyek a reagenskészítményeket tartalmazzák, egy munkaelektródát és egy referenciaelektródát tartalmaznak. A munkaelektróda és a referenciaelektróda általában elnyújtott téglalap alakú tesztcsík formájában van elrendezve. A elektródák hossza tipikusan körülbelül 1,9 cm és 4, cm közötti, rendszerint körülbelül 2 és körülbelül 2,8 cm közötti tartományban van. A elektródák szélessége tipikusan körülbelül 0,38 cm és 0,76 cm közötti, rendszerint körülbelül 0,1 és körülbelül 0,67 cm közötti tartományban van. A referenciaelektródák vastagsága tipikusan körülbelül és 0 nm közötti, és rendszerint körülbelül 18 és körülbelül 22 nm közötti tartományban van. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, az egyik elektróda hossza rövidebb, mint a másik elektróda hossza, a találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint körülbelül 0,32 cm¹rel rövidebb. A munka- és referenciaelektródákat továbbá jellemzi, hogy legalább az elektródák felszíne, ami a tesztcsíkban a reakciótér felé irányul, egy vezetõ anyag, például fém vagy más vezetõ anyag, ahol elõnyösen alkalmazható, reprezentatív anyagok lehetnek, de ezekre nem korlátozva: palládium, arany, platina, ezüst, irídium, szén, adalék anyaggal szennyezett ón¹oxid, rozsdamentes acél és hasonlók. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, a vezetõ anyag arany vagy palládium. Míg elvileg az elektróda egésze készülhet vezetõ anyagból, az egyes elektródák általában egy inert hordozó anyagból készülnek, amelynek felszínén van vékony rétegben az elektróda vezetõ komponense. Bármilyen alkalmas, inert hordozóanyagot alkalmazhatunk a találmány szerinti elektródákban, ahol tipikusan az anyag olyan merev anyag, amely képes biztosítani az elektróda strukturális tartását, és másfelõl az elektrokémiai tesztcsík egészének tartását. Alkalmas anyagok, amelyek hordozóanyagként alkalmazhatók, mûanyagok, például PET, PETG, poliimid, polikarbonát, polisztirol, szilikon, kerámia, üveg és hasonlók. Távtartó réteg A találmány szerinti, elektrokémiai tesztcsíkok jellemzõ tulajdonsága, hogy a fentebb leírt munka- és referenciaelektródák egymás felé vannak fordítva, és csak egy kis távolság választja el azokat, így a munkaés referenciaelektródák közötti távolság az elektrokémiai tesztcsík reakciózónájában vagy reakcióterében rendkívül kicsi. Ez a minimális távolság a munka- és referenciaelektróda között a találmány szerinti tesztcsíkokban egy vékony távtartó réteg jelenlétének eredménye, amely a munkaelektróda és a referenciaelektróda közé van elhelyezve vagy szendvicsként beillesztve. A távtartó réteg vastagsága általában körülbelül 1 és körülbelül 00 m közötti, rendszerint körülbelül 0 és körülbelül 0 m közötti. A távtartó réteg úgy van kivágva, hogy egy reakciózónát vagy reakcióteret biztosítson, amely legalább egy bevezetõnyílással rendelkezzen a reakciózónába, és általában kivezetõnyílással is rendelkezzen a reakciózónából. Egy reprezentatív távtartó réteg elrendezése látható a 2A. és 2B. ábrán. Ezeken az ábrákon ugyan kör alakú reakciózóna látható, amelyhez oldalról bevezetõ- és kivezetõnyílás

6 1 HU T2 2 van vágva, másféle reakciótér-elrendezések lehetnek, például négyszögletes, ovális, háromszögletû, téglalap alakú és szabálytalan alakú reakcióterek stb. A távtartó réteg készülhet bármilyen alkalmas anyagból, amely például PET, PETG, poli-imid, polikarbonát és hasonlók, ahol a távtartó réteg felszíneit kezelni lehet, hogy ezáltal azok ragadósak legyenek a megfelelõ elektródák felé, és ezáltal fenntartsák az elektrokémiai tesztcsík struktúráját. Különösen elõnyös, ha távtartó rétegként kivágott, mindkét oldalon ragadós csíkot alkalmazunk. Reakciózóna A találmány szerinti elektrokémiai tesztcsíkok reakciózónát vagy reakcióteret tartalmaznak, amit a munkaelektród, a referenciaelektród és a távtartó réteg határoz meg, ezeket az elemeket fentebb leírtuk. Konkrétan a munkaelektród és a referenciaelektród határozza meg a reakciótér tetejét és alját, míg a távtartó réteg határozza meg a reakciótér oldalfalait. A reakciótér térfogata legalább körülbelül 0,1 l, rendszerint legalább körülbelül 1 l és gyakrabban legalább körülbelül 1, l, ahol a térfogat lehet akár l, vagy nagyobb. A fentebb említettek szerint, a reakciótér általában legalább egy bevezetõnyílást, és a találmány több elõnyös megvalósítási módja szerint kivezetõnyílást is tartalmaz. A bevezetõ- és kivezetõnyílások keresztmetszeti területe változó lehet, amíg az elegendõen nagy ahhoz, hogy biztosítsa a folyadék hatékony bejutását vagy kivezetését a reakciótérbõl, de általában körülbelül 9 és körülbelül 3 cm 2 közötti, rendszerint körülbelül 4 és körülbelül 2, 3 cm 2 közötti tartományban van Enzimmentes reagenskészítmény A reakciózónában egy enzimmentes reagensforma van jelen, ahol a reagensforma tipikusan száraz formában van jelen. Az enzimmentes azt jeleni, hogy a forma legalább olyan enzimet nem tartalmaz, ami ahhoz a redox reagensrendszerhez tartozik, ami jelen van az elektrokémiai cella által vizsgált mintában. Eszerint, ha az elektrokémiai cellához juttatott minta glükózdehidrogenázt tartalmaz, akkor az elektrokémiai cellában lévõ reagensforma nem tartalmaz glükózdehidrogenázt, és a találmány sok elõnyös megvalósítási módja szerint, semmilyen enzimet sem tartalmaz. Az elektrokémiai cellákban lévõ, enzimmentes reagensforma jellegzetes tulajdonsága, hogy redox mediátor van benne jelen, amely egy vagy több, mediátorágenst tartalmazhat. A mediátor intermedierként mûködik, ami elõsegíti elektronok átvitelét az enzimrõl (ami egy vagy több elektront vett fel az analitról az analit oxidációja alatt) az elektródára. Sokféle, különbözõ, szakember által ismert mediátorágenst lehet alkalmazni, ilyenek például: ferricianid, fenazin-etoszulfát, fenazin-metoszulfát, fenilén-diamin, N,N,N,N -tetrametilfenilén-diamin, 1¹metoxi-fenazin-metoszulfát, 2,- dimetil-1,4-benzokinon, 2,6-dimetil-1,4-benzokinon, 2,-diklór-1,4-benzokinon, ferrocénszármazékok, ozmium-bipiridil komplexek, ruténiumkomplexek és hasonlók. A találmány reprezentatív elõnyös megvalósítási módja szerint, a redoxmediátor ferricianid. A reagenskészítmény másik komponense egy mediátorstabilizáló pufferelõkomponens. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott, mediátorstabilizáló pufferelõ komponensek állhatnak egy vagy több, például kettõ, három, négy vagy több külön pufferelõ ágensbõl, ahol a pufferelõkomponens stabilizálja a mediátort a készítmény szilárd formában való tárolása alatt, így ha a mediátor egyáltalán redukálódik is, akkor kis mennyiség redukálódik felhasználás elõtt, például tárolás közben. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a pufferágensek polikarbonsavak. A polikarbonsav kifejezésen azt értjük, hogy a pufferelõágensek két vagy több karbonsav funkciós csoportot tartalmaznak, ahol a különbözõ karbonsav funkciós csoportok száma körülbelül 2 és körülbelül közötti, például körülbelül 2 és körülbelül 8 közötti lehet, beleértve körülbelül 2 és körülbelül 6 közötti számot. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott pufferelõágensek karbonsavcsoportjai vagy funkciós csoportjai számos különbözõ struktúrához lehetnek kapcsolva, például alifás, aliciklusos, aromás és heterociklusos struktúrákhoz. Az egy vagy több karbonsavcsoport jelenléte kedvezõ hatást fejthet ki, ami legalább egy pka-értéket biztosít a puffernek a kívánt tartományban. Konkrétan alkalmazható polikarbonsavak lehetnek, ezekre nem korlátozva: mellitsav, citrakonsav, maleinsav és hasonlók. Ha a reagenskészítmény száraz reagensforma, például ahogyan jelen lehet a lentebb részletesen ismertetett, elektrokémiai tesztcsíkban, a száraz készítményben lévõ pufferelõkomponens mennyisége tipikusan körülbelül 0,01 és körülbelül,00 tömeg% közötti, rendszerint körülbelül 1 és körülbelül tömeg% közötti tartományban van. A reagenskészítmény továbbá tartalmazhat egy vagy több további komponenst az alábbiak közül: nedvesítõ anyagot, detergensstabilizátort, viszkozitást módosító anyagot vagy ezek kombinációit. A reagenskészítményhez nedvesítõágenst, a találmány néhány elõnyös megvalósítási módja szerint detergenssel kombinációban, lehet hozzáadni a reagenskészítménnyel történõ egyenletes burkolás elõsegítése céljából egy elektrokémiai tesztcsíkon. Ágenskombinációkból egyet vagy többet is lehet alkalmazni. Az alkalmazott ágensek javíthatják a vizsgálati eljárásban alkalmazott reagensek oldhatóságát, valamint fokozzák egy tesztcsík kapillárisainak nedvszívó tulajdonságait. Az ágensek lehetnek szakember által ismertek, például polimerek, habzásgátló anyagok és felületaktív anyagok. Szóba jöhetõ, reprezentatív felületaktív anyagok/detergensek lehetnek az alábbi típusok, ezekre nem korlátozva: Tritonok, Macolok, Tetronicok, Silwet¹ek, Zonylok és Pluronicok. Alkalmas ágensek lehetnek olyan Pluronic-anyagok, amelyek polietilén-oxid és polipropilén-oxid blokk-kopolimerjei. Pluronic-anyagok közé tartozik például a Pluronic P3, aminek jó nedvesítõtulajdonságai vannak, és a Pluronic F87 Prill, aminek jó detergens tulajdonságai vannak. A Pluronic 6

7 1 HU T2 2 P3 és az F87 Prill egyaránt 80 C¹nál magasabb zavarosodási hõmérséklettel rendelkezik, ami kívánatos, mivel ez a tulajdonság lehetõvé teszi, hogy ne következzen be fázisváltozás a készítményben a szárítási eljárás alatt. A reagenskészítményhez stabilizátorokat is hozzá lehet adni az enzim stabilizálásának elõsegítésére és a fehérje denaturálódásának megakadályozására. A stabilizátor segíthet a mediátor, különösen az oxidált redox mediátor redox állapotának stabilizálásában. Stabilizálóágensek lehetnek például, de ezekre nem korlátozva: szénhidrátok (például szacharóz, trehalóz, mannit és laktóz), aminosavak, fehérjék (például BSA és albumin) és szerves vegyületek, például EDTA és hasonlók. Viszkozitást módosító anyagokat is hozzá lehet adni a folyékony reagens reológiájának módosítására. Ilyen ágensek lehetnek például poliakrilsav, poli-(vinilalkohol), dextrán, BSA és hasonlók. Módszerek A találmány szerinti eljárások gyakorlati kivitelezésében, az elsõ lépésben folyékony közeg vagy minta bizonyos mennyiségét juttatjuk az elektrokémiai cella, például elektrokémiai tesztcsík reakcióterébe. A minta elkészítése és a reakciótérbe való bevitele között eltelt idõtartam változó lehet, de a találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint körülbelül másodperc és körülbelül 8 óra közötti, például körülbelül perc és körülbelül 3 óra közötti, beleértve körülbelül perc és körülbelül 60 perc közötti idõtartamot. Az elektrokémiai cella reakcióterébe bevitt mintamennyisége változó lehet, de általában körülbelül 0,0 és körülbelül l közötti, rendszerint körülbelül 0, és 1,6 l közötti. A mintát a reakciótérbe bevihetjük bármilyen alkalmas eljárás alkalmazásával, amelyben például a mintát a reakciótérbe injektálhatjuk, lehetõvé téve, hogy a reakciótérbe szívódjon, alkalmas módon. Miután a mintát a reakciózónához juttattuk, elektrokémiai mérést végzünk referencia- és munkaelektróda alkalmazásával. Az elvégzett elektrokémiai mérés változhat a vizsgálati eljárás konkrét természetétõl és attól a berendezéstõl függõen, amellyel az elektrokémiai tesztcsíkot alkalmazzuk, például függ attól, hogy a vizsgálati eljárás koulometriás, amperometriás vagy potenciometriás. Az elektrokémiai mérés általában a töltést (koulometria), áramerõsséget (amperometria) vagy feszültséget (potenciometria) mér, rendszerint egy adott idõtartam alatt, miután a mintát bevittük a reakciótérbe. A fentebb leírt elektrokémiai mérések kivitelezésére szolgáló eljárásokat leírták továbbá a 4,224,12; 4,4,382; és,266,179 számú USA-beli szabadalmi leírásokban; valamint a WO 97/1846; WO 99/497 számú nemzetközi közzétételi iratokban. A reakciózónában fentebb leírtak szerint keletkezett elektrokémiai jel detektálása után a jelet valamilyen módon a mintában lévõ enzim jellemzésére alkalmazzuk, például az enzim szubsztrátspecifitásának meghatározása, a cellához juttatott mintában lévõ enzim koncentrációjának meghatározására stb., ezt a két reprezentatív alkalmazási lehetõséget lentebb részletesen leírjuk. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, a fentebb leírtak alapján, az elektrokémiai jel mérésére szolgáló lépéseket és az enzim jellemzésére szolgáló lépéseket automatikusan végzi egy berendezés, amely arra lett tervezve, hogy a tesztcsíkkal elvégezzen ilyen lépéseket azután, hogy a mintát az elektrokémiai cellához juttattuk. Automatikus üzemeltetésre szolgáló, reprezentatív leolvasóberendezést, amely az említett lépések közül legalább néhányat elvégez, leírtak továbbá a 6,193,873 számú USAbeli szabadalmi leírásban. Hasznosítás A fentebb leírtak szerint, a találmány szerinti megoldás sokféle, különbözõ alkalmazásokban használható, amelyek közül reprezentatívak enzimek jellemzésére szolgáló alkalmazások, ahol a találmány szerinti eljárások hasznosíthatók, a fentebb ismertetettek szerint. Az elsõ reprezentatív enzimjellemzési alkalmazás, amit a találmány szerinti eljárással lehet végezni, egy elsõ enzim szubsztrát- vagy analitspecifitásának meghatározása, egy vagy több, további enzimhez viszonyítva, például egy mutáns glükózdehidrogenáz specifitása glükózra, más redukálócukrokhoz, például maltózhoz képest, ahol a specifitást egy második glükózdehidrogenázhoz, például vad típusú dehidrogenázhoz viszonyítva határozzuk meg. A találmány szerinti megoldás említett reprezentatív alkalmazásainak gyakorlati kivitelezésében elkészítünk egy folyékony mintákból álló készletet, amelyek legalább elsõ és második enzimet tartalmaznak, kombinálva elsõ és második enzimszubsztráttal, és azután az egyes, elkészített mintákat egyenként teszteljük egy elektrokémiai cellában. Az egyenkénti tesztelés azt jelenti, hogy a készletben lévõ egyes mintákat a sajátjában vagy külön elektrokémiai cellában teszteljük. A találmány említett elõnyös megvalósítási módjai közül néhány szerint, az elkészített mintakészlet, amit azután egyenként a találmány szerinti eljárásokban alkalmazott elektrokémiai cellához juttatunk, legalább az alábbiakat tartalmazza: (i) egy mintát, ami egy redox reagensrendszerhez tartozó, elsõ enzimet, és egy elsõ enzimszubsztrátot tartalmaz egy ismert, elsõ koncentrációban; (ii) egy mintát, ami a redox reagensrendszerhez tartozó, elsõ enzimet, és egy második enzimszubsztrátot tartalmaz egy ismert, elsõ koncentrációban; (iii) egy mintát, ami egy redox reagensrendszerhez tartozó, második enzimet, és az elsõ enzimszubsztrátot tartalmazza az ismert, elsõ koncentrációban; és (iv) egy mintát, ami a redox reagensrendszerhez tartozó, második enzimet, és a második enzimszubsztrátot tartalmazza az ismert, elsõ koncentrációban. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint, a specifitást vizsgáló eljárásban az egyes enzimeket az elsõ és a második enzimszubsztrát különbözõ koncentrációinál teszteljük, például az elsõ és a második enzim több, különbözõ koncentrációjánál. A találmány ilyen elõnyös megvalósítási módjai szerint, leg- 7

8 1 HU T alább az alábbi, további mintákat készítjük el és teszteljük: (i) egy mintát, ami a redox reagensrendszerhez tartozó, elsõ enzimet, és az elsõ enzimszubsztrátot tartalmazza egy ismert, második koncentrációban; (ii) egy mintát, ami a redox reagensrendszerhez tartozó, elsõ enzimet, és a második enzimszubsztrátot tartalmazza egy ismert, második koncentrációban; (iii) egy mintát, ami a redox reagensrendszerhez tartozó, második enzimet, és az elsõ enzimszubsztrátot tartalmazza az ismert, második koncentrációban; és (iv) egy mintát, ami a redox reagensrendszerhez tartozó, második enzimet, és a második enzimszubsztrátot tartalmazza az ismert, második koncentrációban. Az említett alkalmazások reprezentatív elõnyös megvalósítási módja szerint, különbözõ s¹gdh-enzimeket elemzünk a szubsztrátspecifitás vonatkozásában, azaz azt, hogy képesek¹e glükózt fogyasztani, amely azonban szubsztrátként alkalmazva redukáló cukrokkal nem lép kompetícióba. A találmány említett elõnyös megvalósítási módját az 1. ábrán tovább szemléltetjük. Az 1. ábrán a 0. számú eljárás folyamatábrája látható s¹gdh vad típusának és mutáns formáinak tesztelésére, a találmány példaként bemutatott, elõnyös megvalósítási módja szerint. A 0. számú eljárásban elõállítunk egy elektrokémiai cellát, a 1. lépésben leírtak szerint. Egy találmány szerinti eljárásban alkalmazható, tipikus elektrokémiai cellát a 0. számú tesztcsík formájában állítunk elõ, a 2A. és 2B. ábrán perspektivikus bontott részábrázolással és felülnézeti ábrázolással bemutatottak szerint, sorrendben. A 0. számú tesztcsík 2. számú munkaelektródát és 4. számú referenciaelektródát tartalmaz, a 6. számú távtartó réteggel elválasztva. A 2. számú munkaelektródán egy sávban 8. számmal jelölt, beszárított reagens van, amely pufferolt mediátort, felületaktív anyagot és stabilizálóágenst tartalmaz. A 6. számú távtartó rétegben egy kivágott rész van, ami meghatározza a összeszerelt tesztcsík elektrokémiai cellájában a 2. számmal jelölt reakciózónát. A fentebb leírt áttekintés alapján, a 4. számú referenciaelektródnak olyan anyagok lehetnek alkalmasak, amelyeket fentebb felsoroltunk a 2. munkaelektród esetén. A 4. számú referenciaelektród anyaga ellenelektród formában rendszerint palládium vagy arany. Egy olyan elektrokémiai cella formában, amelyben az elektródák egy síkban vannak, a 4. számú referenciaelektród rendszerint szén. A 4. számú referenciaelektród rendszerint molekuláris struktúrájában kéntartalmú csoportot tartalmazó stabilizátorral van burkolva. A fedõ ( burkoló ) anyag tartalmazhat hidrofil csoportot és távtartót is a kéntartalmú csoport és a hidrofil csoport között. A 4. számú referenciaelektród burkolására alkalmas vegyületek például, ezekre nem korlátozva, 2¹merkapto-etánszulfonsav, 2¹merkapto-etanol, 2¹merkapto-etil-amin, 3¹merkapto-propionsav, tiofén, 4¹karboxi-tifén, cisztein, homocisztein és cisztein. A 4. számú referenciaelektród rendszerint aranyból van, 2¹merkapto-etánszulfonsavval burkolva. A 8. számmal jelölt, szárított reagenst a 2. számú munkaelektródra slot coating nevû, speciális fedõeljárással lehet rávinni, az EP 13238A2 számú európai közzétételi iratban leírtak szerint, amelynek tartalmát a kitanítás részének tekintjük. Fedésre (burkolásra) szolgáló más eljárás a festéksugaras ( inkjet ) fedés és a tûfedés ( needle coatig ). A 6. számú távtartó réteg úgy van kivágva, hogy az biztosítsa a reakciózónát, legalább bevezetõnyílással a reakciózónához, és általában kivezetõnyílással a reakciózónától. A távtartó réteget bemutatjuk a 2A. és 2B. ábrán, amelyen kör alakú reakciózóna látható, amelyhez oldalról bevezetõ- és kivezetõnyílás van vágva. Másféle reakciótér-elrendezések lehetnek, nem kizárólagosan, például négyszögletes, ovális, háromszögletû, téglalap alakú és szabálytalan alakú reakcióterek. A 6. számú távtartó réteg készülhet bármilyen alkalmas anyagból, amely például, de ezekre nem korlátozva, PET, PETG, poliimid és polikarbonát, ahol a 6. számú távtartó réteg felszíneit kezelni lehet, ezáltal azok ragadóssá válnak. A 6. számú távtartó réteg kivágott, tipikusan mindkét oldalon ragadós. A mediátor lehet ferricianid, fenazin-etoszulfát, fenazin-metoszulfát, fenilén-diamin, N,N,N,N -tetrametilfenilén-diamin, 1¹metoxi-fenazin-metoszulfát, 2,- dimetil-1,4-benzokinon, 2,6-dimetil-1,4-benzokinon, 2,-diklór-1,4-benzokinon, ferrocénszármazékok, ozmium-bipiridil komplexek, ruténiumkomplexek és hasonlók. Alkalmas pufferelõágensek, ha egyáltalán mutatnak, kismértékû kötési affinitást mutatnak kétértékû fémkationok (például Ca 2+ ) irányában, és ilyen ágens lehet citrakonát, citrát, malát, maleát, foszfát Good - pufferek vagy hasonlók. A pufferoldat továbbá tartalmazhat felületaktív anyagokat vagy nedvesítõágenseket, ami lehet például Triton, Macol, Tetronic, Silwet, Zonyl vagy Pluronic; és stabilizálóágenseket, például szacharózt, trehalózt vagy mannitot. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a mediátor ferricianid, a puffer citrakonát, a felületaktív anyag Pluronic és a stabilizálóágens szacharóz. Ezután, a 0. számú eljárás 1. lépése szerint, vad típusú és legalább egy mutáns formájú s¹gdh¹t pufferolt oldatban összekeverünk koenzimmel, kofaktorral és különbözõ koncentrációban egy elsõ redukálócukorral (például glükózzal). Az elsõ redukálócukor lehet, de nem korlátozó érvénnyel, glükóz, galaktóz, maltóz, xilóz vagy laktóz. A koenzim lehet PQQ és a kofaktor lehet kalcium. A találmány szerinti eljárásban, beleértve a 0. és 0. számú eljárásban (lásd lentebb) alkalmazott s¹gdh lehet bármilyen natív vagy olyan mutáns formájú s¹gdh, amelyben a natív aminosavszekvenciában legalább egy módosítás történt, például, de ezekre nem korlátozva, egy aminosavszubsztitúció vagy ¹deléció történt a glükózspecifitás javítása céljából. Szakember által ismert technikákat lehet alkalmazni az s¹gdh ilyen módosításainak kialakítására, és ilyeneket tárgyalnak a fentebb említett, 6,3,09 számú USA-beli 8

9 1 HU T2 2 szabadalmi leírásban és az EP A1 számú európai közzétételi iratban, ahol vad típusú enzim mutánsainak elõállítására szolgáló általános módszerek szakember által jól ismertek. Az 1. ábrán található 1. lépés szerint az egyes enzim/cukor oldatokat külön-külön elektrokémiai cellákba adagoljuk, amelyek pufferolt mediátort, felületaktív anyagot és stabilizálóágenst tartalmaznak. Ezután megmérjük az áramerõsség-választ, és a cukorkoncentráció függvényében ábrázoljuk, a 1. lépésben leírtak szerint. Tanácsos az enzim/cukor oldatot elkülönítve tartani a mediátortól az áramerõsség-válasz mérése elõtt az enzim és a mediátor közötti gyors reakciósebesség miatt. Ha az enzimet és a mediátort összekeverjük azelõtt, mielõtt az oldatot az elektrokémiai cellához juttatnánk, a reakció befejezõdik vagy majdnem befejezõdik, mielõtt megmérhetnénk az áramerõsségválaszt. Ezután a 1 1. lépéseket megismételjük legalább egy, további redukálócukorral, és legalább egy, további mutáns s¹gdh-formával, a 10. lépés szerint (lásd 2 4. példákban leírtakat). A legalább egy további redukálócukor lehet, de ezekre nem korlátozva, galaktóz, maltóz, xilóz vagy laktóz. Ezután kiszelektálunk legalább egy mutáns s¹gdh-formát, amely csökkent mértékû választ adott a legalább egy további cukorra, a 160. és 170. lépés szerint. Ezen a módon a mutáns s¹gdh specifitását a vad típusú s¹gdh-hoz viszonyítva könnyen meg lehet határozni. Egy másik reprezentatív alkalmazásban, a találmány szerinti eljárásokat egy folyékony mintában lévõ enzim koncentrációjának vagy aktivitásának meghatározására lehet alkalmazni. Az ilyen eljárások gyakorlati kivitelezésében, ismeretlen mennyiségû és ismert mennyiségû szubsztrátot tartalmazó, folyékony mintát juttatunk egy elektrokémiai cellához. A bevitelt követõen, a detektált elektromos jelet alkalmazzuk a bevitt mintában lévõ, kimutatandó analit koncentrációjának meghatározására, például úgy, hogy a detektált elektromos jelet egy referenciához viszonyítjuk. A 3. ábrán bemutatunk egy folyamatábrát, ami a találmány szerinti, 0. számú eljárásban az egymást követõ lépéseket szemlélteti, egy mintában lévõ vad típusú s¹gdh és mutánsai aktivitásának mérésére. A 0. számú eljárásban elõállítunk elektrokémiai cellát, amely pufferben lévõ, beszárított mediátort tartalmaz felületaktív anyaggal és stabilizátorral, a 3. lépés szerint. Ezután vad típusú s¹gdh¹t vagy s¹gdh mutáns formáját növekvõ koncentrációban összekeverjük állandó mennyiségû glükózzal, a 3. lépés szerint. Azután az egyes enzim/glükóz mintákat külön-külön hozzáadjuk egy-egy elektrokémiai cellához, a 3. lépés szerint. A 3. számú lépésben mérjük az áramerõsség-választ az egyes mintákra, és a választ az enzimkoncentráció függvényében ábrázoljuk, felveszünk egy standard görbét, amit referenciaként lehet alkalmazni az azt követõ lépésekben. Ezután a 3 3. lépéseket megismételjük legalább még egy lot vad típusú vagy mutáns formájú s¹gdh-val, a. lépés szerint. A 360. lépésben azután leolvassuk a legalább egy további lot, vad típusú vagy mutáns formájú s¹gdh enzim koncentrációját a standard görbe vagy referencia alapján, például úgy, hogy a detektált jelet a referenciához viszonyítjuk. Rendszerek Szintén a találmány tárgyát képezik rendszerek, a találmány szerinti eljárások gyakorlati alkalmazására, ahol a rendszerek legalább egy mintát vagy folyékony közeget tartalmaznak, amely redox reagensrendszerhez tartozó enzimet és egy elektrokémiai cellát tartalmaz, amely enzimmentes reagenskészítményt tartalmaz, a fentebb leírtak szerint. A találmány szerinti rendszerek egy berendezést is tartalmazhatnak, egy minta elektrokémiai vizsgálatára történõ alkalmazásra, a találmány szerinti reagenskészítmények alkalmazásával. A találmány szerinti berendezések vagy mérõeszközök tipikusan elektrokémiai mérõberendezések. A találmány szerinti mérõeszközök tipikusan az alábbiakat tartalmazzák: a) elektromos feszültség bevezetésére szolgáló eszközt egy elektrokémiai cellába, amelybe a mintát helyezzük; és b) áramerõsség mérésére szolgáló eszközt a cellában. Reprezentatív elektrokémiai mérõeszközöket vagy berendezéseket leírtak az alábbi szabadalmi iratokban:,723,284;,834,224;,942,2;,972,199;,997,817; 6,083,7; 6,121,009; 6,134,461 és 6,193,973 számú USA-beli szabadalmi leírások; valamint más szabadalmi iratok: WO 99/497; WO 97/1846; WO 01/7; WO 01/7238; WO 02/48707; WO 02/0609 számú nemzetközi közzétételi iratok; EP A2 és GB számú szabadalmi iratok. Az alábbi példákat szemléltetés céljából ismertetjük, és nem kívánjuk igényünket semmilyen módon az itt leírtakra korlátozni. 1. példa s-gdh vad típusú vagy mutáns formáival burkolt, hagyományos tesztcsíkok hatékonysága Különféle cukorspecifitásokkal rendelkezõ, mutáns s¹gdh-formák szkrínelésére szolgáló vizsgálati eljárás kifejlesztése céljából, elõször s¹gdh vad típusú és mutáns formáira adott választ teszteltük redukálócukrokkal hagyományos, enzimmel burkolt glükóz tesztcsík formátumban. A szkrínelõ vizsgálati eljárás eredménye ideálisan azt a választ utánozza, amit hagyományosan, enzimmel burkolt tesztcsíkok mutatnak olyan teljes vérrel vagy plazmával, amelyhez glükózt adagolnak. s¹gdh tesztelt mutáns formái az alábbi aminosavszubsztitúció egyikét tartalmazták: Asn42Thr és Asp167Glu. A tesztcsíkokat hálóalapú ( web-based ) eljárással készítettük, amelyben a munkaelektróda (arany) slot-coating eljárással volt burkolva olyan pufferolt reagensoldattal, ami körülbelül 0 és 00 ku/ml vad típusú vagy mutáns s¹gdh¹t, PQQ¹t 2:1 moláris arányban GDH¹ra vonatkoztatva (PQQ/GDH), 2 mm CaCl 2 ¹ot, 70 mm ferricianidot, 67 mm citrakonátot ph 6,8 értéken, 0,1% Pluronicot és 7 mm szacharózt tartalmazott. A vad típusú vagy mutáns s¹gdh koncentrá- 9

10 1 HU T2 2 cióját a reagensoldatban úgy állítottuk be, hogy körülbelül 13 aktivitásegységet alkalmazzunk elektrokémiai cellánként; ennélfogva 1 ml reagensoldatban lévõ aktivitásegységek attól függõen változnak, hogy az alkalmazott enzim 1 grammja mennyi aktivitásegységet tartalmaz. Az egyes enzimek aktivitásának meghatározása spektrofotometriás vizsgálati eljárásra alapul, amelyben DCIP¹t (2,6-diklór-fenol-indofenol) és PES¹t (fenazin-etoszulfátot) alkalmazunk 0 mm PIPES-pufferben [piperazin¹n,n -bisz-(2¹etánszulfonsav)], ph 6,8 értéken. Ebben a vizsgálati eljárásban a DCIP abszorbanciájának változását 600 nm¹en követjük, és az abszorbancia csökkenésének sebességét tekintjük az enzim által katalizált reakció sebességének. Az enzimaktivitást 1 egység definiál, ami megfelel 1 mmol DCIP redukciójának egy perc alatt. A DCIP moláris abszorpciós állandója ph 6,8 értéken 17,4 mm¹1. COBAS FARA II típusú centrifugális analizátort alkalmaztunk spektrofotometriás vizsgálati eljáráshoz. Egy IR energiaforrást alkalmaztunk a reagens beszárítására a munkaelektródra, az EP13238 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak szerint, melyet teljes egészében a kitanítás részének tekintünk. Elektrokémiai cellát (vagy tesztcsíkokat) úgy alakítottunk ki, hogy a szárított reagenssel bevont munkaelektródát egy arany ellenelektródához ragasztottuk, ami szárított MESA¹t tartalmazott az ellenelektróda elszennyezõdésének megelõzése céljából. Körülbelül 80 mg/dl (vagy 4,4 mm) endogén glükózt tartalmazó teljes vérbe zavarócukrot, xilózt adagoltunk magas terápiás szinten (körülbelül 60 mg/dl vagy 4 mm) vagy a magas terápiás szint háromszorosát (körülbelül 180 mg/dl vagy 12 mm). A ráadagolást tartalmazó mintákat a fentebb leírt tesztcsíkokra adagoltuk, és a glükóz koncentrációját kronoamperometriásan határoztuk meg, amelyben 0,3 V feszültséget alkalmaztunk másodpercig, ezután +0,3 V feszültséget alkalmaztunk másodpercig. Kiszámítottuk az abszolút eltérést xilózt nem tartalmazó kontrollmintától az egyes enzimekre, és a xilózkoncentráció függvényében fejeztük ki, a 4. ábrán bemutatottak szerint. Lineáris összefüggés volt az abszolút eltérések és a zavarócukorként hozzáadott xilóz között vad típusú s¹gdh és Asn42Thr-mutáns esetén, ami azt mutatja, hogy vad típusú s¹gdh és Asn42Thr-mutáns egyaránt felismeri a xilózt, úgy, ahogyan a glükózt. Azonban az Asn42Thr-mutáns csökkent mértékû választ adott xilózzal. Mindkét mutáns forma esetén szintén lineáris volt az összefüggés az abszolút eltérés és a galaktóz vagy maltóz között (az adatokat nem mutatjuk), ami arra utal, hogy ezeket a szénhidrátokat ugyanolyan jól felismerik, mint a glükózt. Tehát, s¹gdh mutáns formáinak szkrínelésére alkalmazott vizsgálati eljárásnak hasonló eredményeket kell adnia, mint amik a 4. ábrán láthatók, csak ebben Asp167Glu-nak csökkent mértékû választ kell adnia xilózra. A 4. ábrán bemutatott eredmények nem tartalmaznak tesztelést a cukorkoncentráció fiziológiailag releváns, teljes koncentrációtartományában (azaz 7 mg/dl¹ig vagy mm¹ig); ezért vad típusú s¹gdh-val burkolt, hagyományos tesztcsíkokkal végeztünk további teszteléseket a cukorkoncentráció kiterjesztése céljából. Körülbelül 80 mg/dl (vagy 4,4 mm) endogén glükózt tartalmazó plazmába mm¹ig ráadagolást végeztünk az alábbi öt redukálócukor egyikébõl: glükóz, maltóz, xilóz, galaktóz és laktóz. A ráadagolást tartalmazó mintákat a fentebb leírt tesztcsíkokra adagoltuk, és a glükóz koncentrációját kronoamperometriásan határoztuk meg, a fentebb leírtak szerint. A mért áramerõsség-választ a cukorkoncentráció függvényében ábrázoltuk, az. ábrán bemutatottak szerint. A 4. ábrán bemutatottakhoz hasonlóan, körülbelül mm¹nál kisebb koncentrációnál a vad típusú s¹gdh azonos mértékben jól reagál az öt tesztelt redukálócukor mindegyikével. Azonban, ha a fentebb leírt, DCIP/PES spektrofotometriás vizsgálati eljárás alkalmazásával teszteltünk, az s¹gdh alacsony mértékû reaktivitást mutatott xilózzal és galaktózzal ugyanebben a cukorkoncentráció-tartományban (az eredményeket nem mutatjuk), ami arra utal, hogy a spektrofotometriás vizsgálati eljárást nem lehet annak az enzimválasznak modellezésére alkalmazni, amit az enzim zavarócukrokra ad hagyományos, enzimmel burkolt tesztcsíkokkal. Az elõzõekben említettek szerint a spektrofotometriás vizsgálati eljárásban enzimlimitáló körülmények vannak, míg a hagyományos, enzimmel burkolt tesztcsíkokban az enzimet feleslegben alkalmazzuk; tehát ez magyarázza a cukorra adott válasz különbségét az egyes vizsgálati eljárás formákban. 2. példa Vad típusú s¹gdh redukálócukrokra adott válaszának tesztelése egy olyan eljárásban, amelyben a találmány szerinti elektrokémiai cellát alkalmaztuk Vad típusú s¹gdh redukálócukrokra adott válaszát olyan elektrokémiai cellák (azaz tesztcsíkok) alkalmazásával mértük, amelyeket hálóalapú eljárással készítettünk, amelyben a munkaelektróda (arany) slot-coating eljárással volt burkolva olyan pufferolt reagensoldattal, ami 70 mm ferricianidot, 67 mm citrakonátot ph 6,8 értéken, 0,1% Pluronicot és 7 mm szacharózt tartalmazott. Az 1. példában leírtak szerint, egy IR energiaforrást alkalmaztunk a reagens munkaelektródára való rászárítására. Elektrokémiai cellát úgy alakítottunk ki, hogy a szárított reagenssel bevont munkaelektródát egy arany ellenelektródához ragasztottuk, ami szárított MESA¹t tartalmazott az ellenelektróda elszennyezõdésének megelõzése céljából. Vad típusú s¹gdh¹t 67 mm citrakonátban ph 6,8 értéken, ami PQQ¹t 2:1 moláris arányban GDH¹ra vonatkoztatva (PQQ/GDH) és 2 mm CaCl 2 ¹ot tartalmazott, összekevertünk az alábbi cukrok egyikével fiziológiásan releváns (körülbelül mm¹ig vagy 7 mg/dl¹ig) koncentrációban: glükóz, xilóz, galaktóz, maltóz vagy laktóz. A vad típusú s¹gdh koncentrációját az egyes oldatokban úgy állítottuk be, hogy egy elektrokémiai cellában körülbelül 13 aktivitásegységet alkalmazzunk. Az egyes enzim/cukor tartalmú

11 1 HU T2 2 oldatokat olyan elektrokémiai cellába adagoltuk, amely beszárított ferricianidot, citrakonátot, Pluronicot és szacharózt tartalmazott, de enzimet nem (lásd fentebb a koncentrációkat). Az áramerõsség-választ mértük, és három meghatározás átlagát a cukor koncentrációjának függvényében ábrázoltuk a 6. ábrán bemutatottak szerint. Az eredmények hasonlóak volt azokhoz, mint amiket s¹gdh-val burkolt tesztcsíkokkal kaptunk az 1. példában (lásd a 4. ábrát) kisebb, mint mm xilóznál, amelyben az enzim azonos mértékben jól reagál glükózzal és xilózzal. Valamennyi tesztelt cukorral szintén hasonló eredményeket kaptunk azokhoz, amiket a. ábrán bemutattunk. Tehát a vizsgálati eljárás modellezi azt a választ, amit hagyományos vad típusú enzimmel burkolt tesztcsíkokkal kaptunk, az alábbi elõnyökkel: 1. enzimmel burkolt tesztcsíkokat nem kell legyártani minden egyes enzimformával, ezáltal idõt és forrásokat (mûszerhasználatot és technikusi munkaerõt) takarítunk meg, és rendszerint kevesebb enzimet használunk fel; és 2. különbözõ koncentrációkban redukálócukrot tartalmazó, pufferalapú mintákat lehet alkalmazni olyan biológiailag veszélyes, teljes vér vagy plazma helyett, amelyekhez cukor van adagolva. 3. példa Asn42Thr (s¹gdh egy mutáns formája) redukálócukrokra adott válaszának tesztelése egy olyan eljárásban, amelyben a találmány szerinti elektrokémiai cellát alkalmaztuk Asn42Thr redukálócukrokra adott válaszát ugyanabból a lotból származó elektrokémiai cella alkalmazásával mértük, mint amit fentebb, a 2. példában leírtunk (azaz beszárított ferricianidot, citrakont, Pluronicot és szacharózt tartalmazó cellákat, de enzim nélkül). Az Asn42Thr¹t összekevertük az alábbi cukrok egyikével fiziológiásan releváns (körülbelül mm¹ig vagy 7 mg/dl¹ig) koncentrációban: glükóz, xilóz, galaktóz, maltóz vagy laktóz. Az Asn42Thr koncentrációját az egyes oldatokban úgy állítottuk be, hogy egy elektrokémiai cellában körülbelül 1 3 aktivitásegységet alkalmazzunk. Az egyes enzim/cukor tartalmú oldatokat olyan elektrokémiai cellába adagoltuk, amely beszárított ferricianidot, citrakonátot, Pluronicot és szacharózt tartalmazott, de enzimet nem. Az áramerõsség-választ mértük, és a cukor koncentrációjának függvényében ábrázoltuk a 7. ábrán bemutatottak szerint. Az eredmények hasonlóak volt azokhoz, amiket az Asn42Thr-rel burkolt tesztcsíkokkal kaptunk az 1. példában (lásd a 4. ábrát), kisebb, mint mm xilóznál (azaz körülbelül háromszor nagyobb értéknél, mint a magas terápiás szint), amelyben a vad típusú enzimhez hasonlóan, Asn42Thr azonos mértékben jól reagál glükózzal és xilózzal. Az eredmények azt is mutatják, hogy s¹gdh-nak ez a mutáns formája azonos mértékben jól reagál minden tesztelt cukorral mm¹nál kisebb cukorkoncentrációban. Tehát a vizsgálati eljárás utánozza azokat az eredményeket, amelyeket Asn42Thr-rel burkolt tesztcsíkokkal kaptunk, a fentebb ismertetett elõnyökkel példa Asp167Glu (s¹gdh másik mutáns formája) redukálócukrokra adott válaszának tesztelése egy olyan eljárásban, amelyben a találmány szerinti elektrokémiai cellát alkalmaztuk Asp167Glu redukálócukrokra adott válaszát fentebb, a 3. példában leírtak szerint mértük. Az Asp167Glu¹t összekevertük az alábbi cukrok egyikével fiziológiásan releváns (körülbelül mm¹ig vagy 7 mg/dl¹ig) koncentrációban: glükóz, xilóz, galaktóz, maltóz vagy laktóz; és olyan elektrokémiai cellába adagoltuk, amely beszárított ferricianidot, citrakonátot, Pluronicot és szacharózt tartalmazott, de enzimet nem. Az áramerõsség-választ mértük, és a cukor koncentrációjának függvényében ábrázoltuk a 8. ábrán bemutatottak szerint. Az eredmények hasonlóak volt azokhoz, amiket az Asp167Glu-val burkolt tesztcsíkokkal kaptunk az 1. példában (lásd a 4. ábrát) kisebb, mint mm xilóznál (azaz körülbelül háromszor nagyobb értéknél, mint a magas terápiás szint), amelyben ez a mutáns s¹gdh-forma csökkent mértékû választ ad xilózra. Ez a mutáns azonos mértékben jól reagál az összes többi tesztelt cukorral. Tehát újra kijelenthetjük: a vizsgálati eljárás kedvezõen utánozza azokat az eredményeket, amelyeket Asp167Glu-val burkolt tesztcsíkokkal kaptunk, de egy gyors és könnyen alkalmazható formában. A fentebb leírt példák azt mutatják, hogy az eljárást enzimmel burkolt tesztcsík hatékonyságának modellezésére lehet alkalmazni, és mutáns s¹gdh-formák cukrokra adott válaszának szkrínelésére lehet alkalmazni. Az alábbi példákban azt szemléltetjük, hogy az eljárást hogyan lehet enzimaktivitás mérésére használni.. példa Standard görbe elektrokémiai cellára, amelyhez vad típusú s¹gdh¹t adagoltunk, a találmány szerinti eljárás alkalmazásával Felvettünk egy standard görbét (lásd 9. ábrát) vad típusú s¹gdh¹ra, melyet olyan elektrokémiai cellába adagoltunk, amely beszárított ferricianidot, citrakont, Pluronicot és szacharózt tartalmazott, de enzimet nem (a koncentrációkat lásd fentebb), növekvõ koncentrációjú vad típusú s¹gdh-val, körülbelül 0 és mg/ml közötti tartományban. A glükóz koncentrációját mg/dl¹en tartottuk. Szakember belátja, hogy standard görbét fel lehet venni s¹gdh bármilyen mutáns formájával is. Egy dupla reciprok görbét (azaz 1/válasz az 1/enzimkoncentráció függvényében) vettünk fel a 9. ábrán bemutatott standard görbébõl, és bemutatjuk a. ábrán. Erõs lineáris korreláció (r2=0,9986) van az elektrokémiai cella által adott válasz és a vad típusú s¹gdh mennyisége között. Az enzim tesztlotjának koncentrációját könnyen meg lehet határozni úgy, hogy mérjük az áramerõsség-választ és a koncentrációt leolvassuk a standard görbérõl. Standard görbe felvétele s¹gdh¹ra egy elektrokémiai formátumban kedvezõ módon lehetõvé teszi ha- 11

12 1 HU T2 2 gyományos tesztcsíkok gyártásához beszerzett enzimek aktivitásának mérését, a száraz tesztcsíkokra felvitt enzimek stabilitásának mérését, és a tesztcsíkok burkolásával kapcsolatos, enzimaktivitással összefüggõ potenciális problémák kijavítását. A fenti eredmények és tárgyalás alátámasztja, hogy a találmány szerinti megoldás kényelmes és költséghatékony módszereket biztosit redox reagensrendszerhez tartozó enzimek jellemzésére. A találmány szerinti megoldás elõnyei közé tartozik, hogy olcsó, és tesztelést lehet vele végezni vér vagy vérbõl készült termékek alkalmazása nélkül is. Eszerint, a találmány szerinti megoldás jelentõsen hozzájárul a technika fejlõdéséhez. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás redox reagensrendszerhez tartozó enzim jellemzésére, amelyben: a) egy redox reagensrendszerhez tartozó elsõ enzimet és ismert mennyiségû enzimszubsztrátot tartalmazó mintát juttatunk egy olyan elektrokémiai cellába, amely a redox reagensrendszer mediátorát tartalmazó, enzimmentes reagenskészítményt tartalmaz; és b) detektáljuk a cellában keletkezett elektromos jelet. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az enzim oxidálóenzim. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, ahol az oxidálóenzim oxidáz és dehidrogenáz közül van kiválasztva. 4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, ahol a minta enzimkofaktort is tartalmaz.. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, ahol az eljárásban a detektált elektromos jelet egy további lépésben a redox reagensrendszerhez tartozó, elsõ enzim analitspecifitásának meghatározására alkalmazzuk. 6. Az. igénypont szerinti eljárás, ahol az eljárásban olyan elektromos jeleket detektálunk, melyek legalább a következõ mintákban keletkeznek: i) minta, amely egy redox reagensrendszerhez tartozó elsõ enzimet és egy elsõ enzimszubsztrátot tartalmaz ismert, elsõ koncentrációban; ii) minta, amely a redox reagensrendszerhez tartozó elsõ enzimet és egy második enzimszubsztrátot tartalmaz ismert, elsõ koncentrációban; iii) minta, amely egy redox reagensrendszerhez tartozó második enzimet és az elsõ enzimszubsztrátot tartalmazza az ismert, elsõ koncentrációban; és iv) minta, amely a redox reagensrendszerhez tartozó második enzimet és a második enzimszubsztrátot tartalmazza az ismert, elsõ koncentrációban. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, ahol az eljárásban olyan elektromos jeleket is detektálunk, melyek a következõ mintákban keletkeznek: i) minta, amely a redox reagensrendszerhez tartozó elsõ enzimet és az elsõ enzimszubsztrátot tartalmazza ismert, második koncentrációban; ii) minta, amely a redox reagensrendszerhez tartozó elsõ enzimet és a második enzimszubsztrátot tartalmazza ismert, második koncentrációban; iii) minta, amely a redox reagensrendszerhez tartozó, második enzimet és az elsõ enzimszubsztrátot tartalmazza az ismert, második koncentrációban; és iv) egy olyan minta, ami a redox reagensrendszerhez tartozó, második enzimet és a második enzimszubsztrátot tartalmazza az ismert, második koncentrációban. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol a redox reagensrendszerhez tartozó elsõ enzim meghatározott analitspecifitása a redox reagensrendszerhez tartozó második enzimhez van viszonyítva. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol a redox reagensrendszerhez tartozó elsõ enzim egy redox reagensrendszerben természetben nem elõforduló enzim.. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol a redox reagensrendszerhez tartozó második enzim egy redox reagensrendszerben természetben elõforduló enzim. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az eljárásban a detektált elektromos jelet a mintában lévõ enzim aktivitásának meghatározására is használjuk. 12. Elektrokémiai cella, amely tartalmazza a következõket: munkaelektródát és referenciaelektródát, amelyek egy távtartó réteggel vannak elválasztva, miáltal egy reakciózónát határoznak meg; valamint enzimmentes reagenskészítményt, amely tartalmazza egy redox reagensrendszer mediátorát, amely az elektrokémiai cella reakciózónájában található. 13. Rendszer, amely tartalmazza a következõket: a) egy elektrokémiai cellát, amely egy redox reagensrendszer mediátorát tartalmazó, enzimmentes reagenskészítményt tartalmaz; valamint b) egy folyékony közeget, amely tartalmaz egy redox reagensrendszerhez tartozó enzimet és ismert mennyiségû enzimszubsztrátot. 12

13 HU T2 Int. Cl.: C12Q 1/00 13

14 HU T2 Int. Cl.: C12Q 1/00 14

15 HU T2 Int. Cl.: C12Q 1/00 1

16 HU T2 Int. Cl.: C12Q 1/00 16

17 HU T2 Int. Cl.: C12Q 1/00 17

18 HU T2 Int. Cl.: C12Q 1/00 18

19 HU T2 Int. Cl.: C12Q 1/00 19

20 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest