!HU000008601T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 601 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 707434 (22) A bejelentés napja: 2005. 02. 16. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050707434 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1720611 A2 2005. 08. 25. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1720611 B1 2010. 05. 19. (51) Int. Cl.: A61P 35/00 (2006.01) G01N 33/574 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05078124 PCT/EP 05/001567 (30) Elsõbbségi adatok: 102004008449 2004. 02. 16. DE 102004038076 2004. 07. 29. DE (72) Feltalálók: CAHILL, Michael, 55296 Lörzweiler (DE); KLOCKER, Helmut, A-6401 Inzing (AT); ROGATSCH, Hermann, A-9020 Klagenfurt (AT) (73) Jogosult: ProteoSys AG, 55129 Mainz (DE) (74) Képviselõ: Schläfer László, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (54) Diagnosztikai marker rákos betegségekhez HU 008 601 T2 A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 10 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1 HU 008 601 T2 2 A jelen találmány tárgyát képezi az annexin A3 protein alkalmazása diagnosztikai markerként prosztatarák esetén, azzal jellemezve, hogy a prosztataráknál a prosztatarák meghatározott altípusairól van szó. A rákos betegségekre általában jellemzõ egy vagy több tumor kialakulása. Tumor alatt egy daganatot, illetve a szövetek térfogatának helyileg körülírt megnövekedését értjük. Szélesebb körben értelmezve idetartozik minden lokalizált duzzanat, például ödéma miatt, egy akut vagy krónikus gyulladás, aneurizmás megnagyobbodás, egy gyulladás miatti szervduzzadás (például mint egy úgynevezett léptumor). Szûkebb körben értelmezve a tumor alatt értendõk a szöveti neoplazmák (burjánzások, plasztomok, neopláziák), testazonos szövetek spontán, különbözõ mértékben szabadjára engedett, autonóm és irreverzíbilis túlzott növekedése, amihez általában specifikus sejt- és szöveti funkciók eltérõ kiterjedésû elvesztése társul. A tumorok egy jobb osztályozás szerint az alábbi csoportokra oszthatók: I. Biológiai viselkedésük alapján 1. benignus (jóindulatú) tumorok differenciált sejtekkel és lassú, lokális kiterjedésû növekedéssel, 2. malignus (rosszindulatú) tumorok sejtmag-polimorfiával, sejtatipusos jelleggel, anapláziával és beszûrõdõ, jobbára gyors, roncsoló növekedéssel és áttétellel, 3. semimalignus tumorok malignus tumorok hisztológiás jellemzõivel és lokális beszûrõdõ növekedéssel, de általában áttétel nélkül. II. Hisztogenetikai rendszerezés Ennek során a tumorokat azon szövetek alapján osztályozzák, amelybõl fejlõdéstörténetileg származnak. Így léteznek: 1. epiteliális tumorok, amelyek az ektodermából és az entodermából származnak: a) benignus tumorok, így adenomák, papillomák és polipok, b) malignus tumorok, így karcinómák; 2. mezenchimális tumorok, amelyek a mezodermából származnak: a) benignus tumorok, így lipómák, fibrómák, oszteómák, miómák, leiomyomák, rhabdomyomák, kondrómák, b) malignus tumorok, így szarkómák; 3. embrionális tumorok, amelyek differenciálatlan szövetekbõl származnak. Idetartoznak például a nefroblasztomok, neuroblasztomok, medulloblasztomok, retinoblasztomok, valamint az embrionális rhabdomyosarcomák és teratómák. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 III. Klinikai és patológiás leletek alapján történõ osztályozás: Többek között idetartozik a TNM osztályozás, Grading, Lauren-féle osztályozás, Dukes-féle osztályozás, Kieler-féle osztályozás, Rappaport-féle osztályozás és hasonlók. Már ez a rövid áttekintés is mutatja, hogy a tumorok besorolásánál milyen sokszínûség (és részben ellentmondás) található a különbözõ tumorfajták között. Így például nemcsak a jóindulatú és rosszindulatú tumorok között lehet különbséget tenni, hanem az egyes tumoroknál jelentkezõ halandóság, illetve mortalitás és annak valószínûsége alapján, hogy egy jóindulatú tumor rosszindulatú tumorrá fejlõdik tovább. Egyes tumorok, így például a mamakarcinóma (mellrák), a nõknél jelentkezõ leggyakoribb rosszindulatú tumor, gyakran a 45. és 70. év között jelentkezik. Korai tünet a gyanús tapintás, ami általában a rákmegelõzõ vizsgálatok, valamint a mell rendszeres önvizsgálata során jelentkezik. A tumor stádiumától és a tumor differenciálódásának mértékétõl függõen ennek során a prognózis különösen pozitívtól nagyon rosszig terjedhet. A mamakarcinóma korai limfogén és hematogén áttétele miatt a tumor gyors diagnosztizálásától függ a terápia minél elõbbi megkezdése. A prosztatakarcinóma (a prosztata karcinómája) ezzel szemben a férfiak leggyakoribb rosszindulatú tumora, amely elsõsorban az 50. és 70. év között jelentkezik. A legtöbb esetben itt adenokarcinómáról van szó. Ez a rosszindulatú tumor beszûrõdõ növekedéssel elõször a prosztatán belül terjed szét, késõbb beszûrõdik az ondóhólyagocskába és a medence kötõszövetébe, és viszonylag ritkán a végbélbe, a húgyhólyagba vagy a húgycsõbe is. Az áttételezõdés limfogén és/vagy hematogén módon történik. A terápia általában a hisztológiás differenciálódási mértéktõl és a klinikai stádiumtól függõen regionális nyirokcsomó-eltávolítással járó radikális prosztatakimetszés, elõrehaladott állapotban a férfi szexuális hormonok megvonása. A prognózis itt is függ a karcinóma stádiumától. Még nagyon korai stádiumban radikális prosztatakimetszés után az esetek mintegy 90%-ában gyógyulás érhetõ el, elõrehaladott állapotban inkább pesszimista prognózissal kell számolni. A prosztatakarcinómát a diagnózis során meg kell különböztetni a prosztatahiperpláziától. A prosztatahiperplázia esetén egy benignus, vagyis jóindulatú tumorról van szó. Ennek során a prosztata megnagyobbodik a sejtek és a váz mirigyeinek számszerû gyarapodása miatt. A prosztatahiperplázia a férfiaknál jelentkezõ hólyagürítési zavarok leggyakoribb oka. Klinikailag elsõsorban a 40. és 50. év között jelentkezik. Kialakulása lassú és fokozatos. Panaszok általában csak évek múlva jelentkeznek a vizeletsugár lassú gyengülésével és a vizelés megkezdésének késlekedésével. A tünetek kezelésére, illetve enyhítésére fitoterapeutikumok adagolása jöhet szóba. Mivel a terápia gyors megkezdéséhez általában fontos a tumor korai felismerése, vagyis diagnosztizálása, és a prognózis annál jobb, minél korábbi a tumor felismerése, a klinikai gyakorlatban egy sor úgynevezett tumormarkert alkalmaznak. Tumormarkernek általában olyan anyagokat és celluláris elváltozásokat neveznek, melyek kvalitatív vagy kvantitatív analízissel lehetõvé teszik a (rosszindulatú) betegségek jelentkezésének, lefolyásának vagy prognózisának kimondását. A tumormarkerek az alábbiak szerint csoportosíthatók: 2
1 HU 008 601 T2 2 1. Celluláris tumormarkerek Idetartoznak többek között a sejtmembránálló tumorantigének, receptorok (például hormonreceptorok, leukémia esetén a növekedést gyorsító anyagok receptorai) és sejtmarkerek, amelyek onkogének túlzott expressziójára és monoklonális sejtnövekedésre utalnak, valamint a molekulárgenetikai celluláris elváltozások, elsõsorban a kromoszómaaberrációk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2. Humorális tumormarkerek Ezek fiziológiai körülmények között testmintákban, elsõsorban szérumban, vizeletben és más testfolyadékokban megemelt koncentrációkban kimutatható (leggyakrabban fiziológiailag elõforduló) anyagok, amelyeket tumorszövetek szintetizálnak és/vagy választanak ki, a tumor szétesése során szabadulnak fel, vagy a szervezetnek egy tumorra adott válaszaként képzõdnek. A tumormarkerek fiziológiai jelentõsége még csak megközelítõleg ismert. Az emberi szervezetben ezek általában nem váltanak ki immunogén hatást. A klinikai (diagnosztikai) jelentõségük függ a specifikus jelleg és az érzékenység mértékétõl. A humorális tumormarkerek két csoportba sorolhatók. Az elsõ csoportba tartoznak azok a humorális tumormarkerek, melyeket maga a tumor produkál. Idetartoznak például a tumorral összefüggõ antigének, meghatározott hormonok (például gasztrin, kortizol és hasonlók), enzimek [például neurospecifikus enolázok (NSE)], valamint proteinek (például Bence-Jones-protein). A második csoportba tartoznak azok a tumormarkerek, melyeket a tumor indukál, de nem maga produkálja. Ebbe a csoportba tartozó fontos humorális tumormarkerek például a lúgos foszfatázok (AP), LDH, Neopterin és hasonlók. Nemrég publikálták olyan proteinek listáját, melyeket a gyerekeknél leggyakrabban elõforduló agydaganat, a medulloblasztóma két reprezentatív sejtvonalában tudtak kimutatni, és lehetõség szerint tumormarkerként alkalmazhatók [A. Peyrl és munkatársai: Proteomics, 3, 1781 1800 (2003)]. Az US 6,645,465 számú iratból ismert, hogy a Ca 2+ -kötõ proteinek közé tartozó annexin A1 és A2 tumormarkerként alkalmazható tüdõ¹, mell- és nyelõcsõrák esetén, és az ezekre specifikus autoantitestek detektálásával kimutathatók. Állatkísérletekkel igazolták, hogy az annexin A1 ellen radioaktív jelölésû antitestek alkalmazásával csökkenthetõ a tumor tömege, ami feltehetõen a tumorsejtek pusztulására vezethetõ vissza [P. Oh, Y. Li; J. Yu, E. Durr, K. M. Krasinska, L. A. Carver, J. E. Testa, J. E. Schnitzer: Nature, 429, 629 35 (2004)]. Ezenkívül legújabban differenciált abundanciaanalízist végeztek rosszindulatú és nem rosszindulatú (jóindulatú) hasnyálmirigy-epitéliumsejteken, ahol az annexin A3 ebben az összefüggésben mint azonosított protein volt kimutatható [A. R. Shekouh és munkatársai: Proteomics, 3, 1988 2001 (2003)]. Ezenkívül vizsgálták proteinek abundanciáját rosszindulatú és nem rosszindulatú prosztataszövetekben. Az ilyen összefüggésben azonosított proteinekkel kapcsolatban azonban általában semmilyen közelebbi adatot nem adtak meg arról, hogy az említett proteinek karcinomatikus szövetekben esetleg nagyobb vagy kisebb mértékben expresszálódnak, mint egészséges szövetekben [A. A. Alaiya és munkatársai: Cell. Mol. Life Sci., 58, 307 311 (2001)]. Az US2003/0108963 számú irat az annexin A3 alkalmazását ismerteti mint általános prosztatarákmarker. Az eddigi közlemények igazolják, hogy milyen fontosak a tumorokra vonatkozó szelektív és érzékeny kimutatási eljárások. Ezenkívül jelentõs igény van tumor¹, illetve rákterápia esetén új célpontok azonosítására. Ennek megfelelõen a találmány feladata rákos betegségeknél alkalmazható új diagnosztikai markerek, valamint rákterápiában alkalmazható új támadási pontok és hatóanyagok kidolgozása. Ennek a feladatnak a megoldását tárgyalják a független igénypontok. Az elõnyös megvalósítási formákat a függõ igénypontokban adjuk meg. Az egyes igénypontokat a leírás tartalmára hivatkozva fogalmaztuk meg. A rosszindulatú elfajult szövetek (rákos szövetek) és nem elfajult szövetek intenzív összehasonlító analizálásával különbözõ proteineket azonosítottunk, amelyek ezekben a szövettípusokban szignifikáns eltérést mutatnak a gyakoriságban, illetve koncentrációban (abundanciában). Egy meghatározott protein jellemzõ abundanciája a kontrollhoz viszonyítva ezért fontos bizonyítékot jelent elfajult sejtnövekedés, vagyis rákos szövet jelenléte szempontjából. A találmány értelmében ezeket a proteineket diagnosztikai markerként lehet alkalmazni rák esetén. Az ilyen proteinek azonosításához mintát veszünk rákos szövetekbõl (prosztatarák) és egészséges prosztataszövetbõl, és a két mintát egyenként különbözõ radioaktív izotópokkal jelöljük. A mintákat összekeverjük, és együtt egy kétdimenzionális poliakrilamidgélre felvive elektroforetikusan szétválasztjuk. Az egyes izotópok jeleit egymástól elválasztva detektáljuk, és a megfelelõ proteinfoltokat tovább analizáljuk. Ezzel az eljárásmóddal különbözõ proteinek azonosíthatók, amelyeknél a rákos szövetekben mutatott gyakoriság jelentõsen eltér az egészséges szövetekben mutatott gyakoriságtól. A különbözõ proteinek itt részben lényegesen gyakrabban elõfordulnak, illetve abundanciát mutatnak, vagyis felülszabályozottak rákos szövetekben, és részben lényegesen kevésbé fordulnak elõ, vagyis kisebb abundanciát mutatnak, vagyis alulszabályozottak. A találmány tárgya annexin A3 protein alkalmazása diagnosztikai markerként prosztataráknál. A feltalálók kimutatták, hogy ez a protein rákos szövetekben átlagosan 2,4-szeresen, egyes betegeknél akár több mint 5¹szörösen felülszabályozott. Ennek következtében egy különösen elõnyös megvalósítási mód értelmében az annexin A3 diagnosztikai szerként alkalmazható a prosztatarák meghatározott altípusainál (betegek meghatározott csoportjainál). Ezért elõnyösen ezen protein felülszabályozottságát a kontrollhoz viszonyítva a rákos szövetre jellemzõ markerként vizsgáljuk. Az annexinek szerkezetileg rokon proteinek egyik családja, amelyek a kalciumtól függõen foszfolipideket kötnek 3
1 HU 008 601 T2 2 meg, és kalciumpórusokat képeznek. Az annexin pontos szerepe azonban jelenleg ismeretlen. Feltételezhetõ, hogy az annexinek részt vesznek mind az intracelluláris, mind az extracelluláris folyamatokban, melyekre példaként említhetõ a membránutazás (Membran-Trafficking), sejtmozgékonyság, Ca 2+ -influx és jelátvitel. Az azonban ismeretlen, hogy az annexinek milyen módon választódnak ki. Így például nem rendelkeznek klasszikus Leader-szekvenciával a transzlációhoz az endoplazmatikus retikulum lumenjében. Mivel azonban az annexinek részben megtalálhatók a 30 100 nm átmérõjû kisméretû kiválasztott membránvezikulumokban, az úgynevezett exoszómákban, feltételezhetõ, hogy az annexinek az ilyen exoszómák lizálásával elérhetik a sejt külsõ részét. Az ilyen vezikulumok lizálása következtében megváltozhat az antigének jelenléte a tumorban. Az exoszómák az immunrendszerben általában az antigének jelenléte szempontjából töltenek be szerepet, és ennek során az MHC 1. osztály/t¹sejt rendszerben vesznek részt. Érdekes módon az annexinek a csont mineralizálódása folyamatában mûködnek közre (Wang, W., Xu, J., Kirsch, T.: Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis, J. Biol. Chem., 278, 3762 9, 2003). Ez különösen figyelemre méltó, mivel a prosztatarák-áttételek más rákfajtákhoz viszonyítva szokatlanul nagy gyakorisággal okoznak oszteoblasztikus csontsérüléseket. A legtöbb rákáttételre az oszteolitikus aktivitás, vagyis a csontok lebontása jellemzõ. A prosztatarák-áttételek ezzel szemben mind oszteoklasztikus, vagyis lebontó, mind oszteoblasztikus, vagyis csontfelépítõ aktivitást mutatnak. Ehhez elõször lebomlanak a normális csontkristályok, majd rendezetlen csontlerakódások formájában újra felépülnek. Ezt a mechanizmust még kevéssé értjük, azonban elsõsorban fiziológiai mineralizálódási folyamatok játszanak benne szerepet. A mineralizálódást kis vezikulumok, úgynevezett mátrixvezikulumok iniciálják, amelyek a plazmamembránról mineralizáló csontsejteket (oszteoblasztokat) szabadítanak fel. Az elsõ mineralizált fázis (kalcium-foszfát-kristályok) a mátrixvezikulumokon belül képzõdik. Mivel ezek a vezikulumok membránokkal vannak körülvéve, csatornaproteinekre van szükség ahhoz, hogy az ásványok behatoljanak a vezikulumokba. Az ilyen vezikulumok fontos komponensei az annexin proteinek, például annexin A2, A5 és A6, valamint a vezikulumok külsõ felületén a II és X típusú kollagén, amelyek az annexin A5 proteinhez kötõdve a vezikulumok külsõ felületén rakódnak le. Az annexinek csatornákat képeznek a mátrixvezikulumok membránjaiban, melyeken keresztülaca 2+ behatol a vezikulumba. A kollagén, amely az annexin A5 proteinhez kötõdik, erõsíti ezt a csatornaaktivitást, és más annexinekkel együtt közvetíti a gyors Ca 2+ -beáramlást és az elsõ kristályos fázisnak a vezikulumon belül történõ kialakulását. Ez a mineralizálódás megindításához vezet. Amikor az intracelluláris kristályok elérnek egy meghatározott nagyságot, széttörik a membránt, és lizálják a vezikulumot. A kristályok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 tovább növekednek (a mineralizálódás növekedési fázisa) és közremûködnek a csontok felépítésében. A feltalálók eredményei szerint az annexin ilyen szerepe a prosztatarák-áttételnél jelentkezõ szokatlan csontmineralizálódás esetén feltehetõen azzal van összefüggésben, hogy a prosztatarákos szövetekben az annexin A3 felülszabályozódik. Ebben az összefüggésben kell vizsgálni a szervetlen pirofoszfatázokat is, amelyek szervetlen foszfátot szabadítanak fel, és amelyek a feltalálók eredményei szerint rák, elsõsorban prosztatarák esetében felülszabályozódnak. Az annexin A3 prosztataráksejtekben megfigyelt felülszabályozódásából következik, hogy az annexin A3 biológiai szerepet tölt be a prosztataráksejtek exoszómáiban. Itt elsõsorban az ioncsatornákkal való összefüggés kerül szóba. Az annexin A3 protein egyik elõnyös alkalmazása során ezért az exoszómákban befolyásoljuk a protein aktivitását. Ez elõnyösen megváltozott immunfelügyelethez és a tumorsejtek megváltozott metasztatikus tulajdonságaihoz vezet. Mivel az extracelluláris annexin A3 nagyobb koncentrációt mutat a tumorsejtek közelében, egy affinitásreagens, elõnyösen egy terápiás antitest, amely nagy affinitással rendelkezik az annexin A3 vonatkozásában, felhasználható hatóanyagoknak, így például toxinoknak vagy radioaktív dózisoknak a tumor közelébe történõ szállításához. Egy ilyen hatóanyagnál elõnyös, ha nem hatol át a sejtmembránon, és ezért az egészséges sejteket, amelyek csupán intracelluláris annexin A3 proteint exprimálnak, így nem fogjuk befolyásolni. Érdekes módon a mátrixvezikulumokat oszteoartritiszes porcokkal és arterioszklerotikus sérülésekkel összefüggésben is megfigyelték. Citoplazmatikus proteineknek az extracelluláris közegbe történõ felszabadulása, ami az exoszómák lizálása után következik be, gyulladásos válasz indukálható, amely a sejtnekrózisnál jelentkezõ válaszhoz hasonlít. Ismert, hogy a gyulladás csökkenti az adaptív T¹sejtek által közvetített immunválaszt, ami ismert módon sok ráksejtet megkülönböztet. Emellett az annexineknek az extracelluláris térben való jelenléte ezt a folyamatot szintén befolyásolhatja (A. Bondanza és munkatársai: J. Exp. Med., 200, 1157 65, 2004). Ezért egy rák elleni oltás meghatározható lenne az említett rendszer megértésével és befolyásolásával. Az annexin A3 protein egyik különösen elõnyös alkalmazása értelmében ezen protein felülszabályozottságát az annexin A1, annexin A2 és/vagy annexin A5 alulszabályozottságával kombinálva vizsgáljuk. Ezt elõnyösen kontrollal történõ összehasonlítással végezzük. Kimutatható, hogy az annexin A1, A2 és annexin A5 rákos szövetekben, elsõsorban prosztatarákos szövetben alulszabályozott. Ezért az annexin A3 felülszabályozottságának analízise egy vagy több ilyen további annexin alulszabályozottságával kombinálva a diagnózis szempontjából különösen tanulságos. A bemutatott eredmények szerint az annexin A3 más annexineket helyettesíthet a prosztatakarcinogenezis során, és ezért helyettesítõ marker vagy helyettesítõ célpont lehet a prosztatarák kezelése esetén. 4
1 HU 008 601 T2 2 5 10 A találmány értelmében kimutatható, hogy rákos szövetekben különbözõ proteinek jellemzõ módon alul¹, illetve felülszabályozódnak az egészséges szövetekhez viszonyítva. Az ezzel kapcsolatos egyedi adatokat az alábbi 1. táblázatban adjuk meg. Ebben összefoglaljuk a különbözõ proteinek azonosítását és mennyiségi jellemzõit jóindulatú és rosszindulatú szövetekben. A proteinek kiválasztását a proteineknek jóindulatú (benignus frakció) és rosszindulatú (rákos frakció) szövetekben mutatott, statisztikusan szignifikáns módon differenciált relatív abundanciája alapján végeztük. Az Acc szám az NCBI-adatbankra vonatkozó mindenkori számnak felel meg. Az elméleti móltömeg (MW) az adatbanki szekvencia alapján számolt móltömeg. A PMF-érték a Mowse-értékre vonatkozik, amit a MASCOT-szerverrõl alkalmazunk, ahol általában egy 65 fölötti PMF-érték szignifikáns azonosítást jelent. Az utolsó két oszlop a proteinfolt-intenzitás mértékét foglalja össze, amit jóindulatú és rosszindulatú szövetfrakcióknál találunk. 1. táblázat Sorszám Acc-szám Ismertetés Elméleti MW PMF-pontszám Benignus frakció Rákos frakció 1. gi 1732411 izopeptidáz T [Homo sapiens] 94 104 115 83,6 16,4 2. gi 576259 A-lánc; szérum amiloid P komponens 23 598 106 73,1 26,9 (Sap) 3. gi 494781 Zsírsavkötõ protein (Holo-forma, 14 775 87 71,6 28,4 humán izom) (M¹Fabp) 4. gi 4504981 béta-galaktozidázkötõ lektin prekurzor; lektin; galaktózkötõ; oldható; 1.; galektin [Homo sapiens] 15 769 177 66,2 33,8 5. gi 225159 mikroszeminoprotein béta 12 238 92 63,9 36,1 6. azonosítás nélkül 60,6 39,4 7. gi 662841 hõsokk protein 27 (Homo sapiens) 22 667 182 60,2 39,8 8. gi 4507949 tirozin-3-monooxigenáz/triptofán-5- monooxigenáz akvitáló protein, béta-polipeptid; 14 3 3 pr 27 946 160 41,2 58,8 9. gi 4507953 tirozin-3¹/triptofán-5-monooxigenáz aktiváló protein, zéta polipeptid, protein-kináz C inhib. 27 810 160 41,1 58,9 10. gi 2073569 nukleáris kloridion-csatorna protein 27 249 139 40,1 59,9 (Homo sapiens) 11. azonosítás nélkül 39,5 60,5 12. azonosítás nélkül (annexin A3) 36 524 160 37,4 62,6 13. gi 5803227 tirozin-3/triptofán-5-monooxigenáz aktiváló protein, téta polipeptid, 14 3 3 protein tau 28 032 130 35,6 64,4 14. gi 13129150 hõsokk 90 kda protein 1, alfa, hõsokk 90 kd protein 1, alfa (Homo sapiens) gi 20149594 hõsokk 90 kda protein 1, béta, hõsokk 90 kd protein 1, béta, hõsokk 90 kd protein 1, béta 15. gi 20070125 prolil-4-hidroxiláz, béta alegység, v¹erb¹a madár eritroblasztikus leukémia, virális onkogén homológ 2 16. gi 4557581 (NM_001444) zsírsavkötõ protein 5 (pszoriázishoz asszociált); E¹FABP (Homo sapiens) 17. gi 2707570 mitokondriális rövid láncú enoil-koenzim A hidratáz 1 prekurzor (Homo sapiens) 18. gi 16307090 nukleofoszminhez hasonló (nukleoláris foszfoprotein B23, numatrin) (Homo sapiens) 85 006 147 32,6 67,4 83 554 164 57 480 235 31,2 68,8 15 497 94 27,9 72,1 31 807 101 26,2 73,8 29 617 77 21,9 78,1 5
1 HU 008 601 T2 2 1. táblázat (folytatás) Sorszám Acc-szám Ismertetés Elméleti MW PMF-pontszám Benignus frakció Rákos frakció 19. gi 768772 HES1 protein E. coli és zebrahal ES1 protein homológja, anti-szigma keresztreakciós protein homológ 1 alfa prekurzor, KNP¹1a, GT335, E¹coli SCRP27A és zebrahal ES1 homológ (Homo sapiens) 20. gi 4506181 proteaszom alfa 2 alegység, proteaszom HC3 alegység; proteaszom C3 komponens; makropain C3 alegység; multikatalitikus endopeptidáz komplex C3 (Homo sapiens) 21. gi 4502171 adenin-foszforibozil-transzferáz, AMP pirofoszforiláz, AMP difoszforiláz, transzfoszforibozidáz 22. gi 11056044 szervetlen pirofoszfatáz (Homo sapiens) 29 215 95 <20 >80 26 236 105 32,6 67,4 20 127 134 33 67 38,6 61,4 25 30 35 40 45 50 55 60 Ezzel összefüggésben utalunk továbbá az 5. és 10. ábrára, melyekben táblázatos formában adjuk meg a proteinfoltok eredményeit 21 betegnél, illetve 31 betegnél kapott szignifikáns, differenciált, átlagos abundancia alapján különbözõ statisztikus értékekkel együtt. Az alábbi összeállításban felsoroljuk a különbözõ proteinek angol nyelvû szinonimáit. Itt az elöl álló szám az 1. táblázatban alkalmazott számozásnak felel meg. Az elsõ helyen mindenkor az adott proteinnek a leírásban alkalmazott magyar megnevezését szerepeltetjük. 1. gi 1732411: ubikitin-izopeptidáz T; Isopeptidase T (isot); ubiquitin specific protease 5; Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5; Ubiquitin thiolesterase 5; Ubiquitin-specific processing protease 5; Deubiquitinating enzyme 5; de¹ubiquitinase. 2. gi 576259: szérum-amiloid P¹komponens; Chain A; Serum Amyloid P Component (SAP). 3. gi 494781: zsírsavkötõ protein 3 (FABP¹3); Mammaryderived growth inhibitor (MDGI); fatty acid binding protein 3 (FABP¹3); Heart-Type Fatty Acid Binding Protein (H¹FABP); Muscle-Type Fatty Acid Binding Protein (M¹Fabp). 4. gi 4504981: galektin; galectin¹1; 14 kda beta-galactoside-binding lectin; beta galactoside soluble lectin; Beta-galactoside-binding lectin L¹14 1; Galaptin; soluble galactoside-binding lectin; S¹Lac lectin 1. 5. gi 225159. mikroszeminoprotein béta; beta-microseminoprotein; microseminoprotein beta; Immunoglobulin binding factor (IGBF); PN44; Prostate secreted seminal plasma protein; Prostate secretory protein of 94 amino acids (PSP¹94); Seminal plasma beta-inhibin; seminal plasma protein. 6. Azonosítás nélkül 7. gi 662841: hõsokk protein 27 (HSP27); Heat shock protein 27; 27 kda heat shock protein 1 (HSP¹27); Stress-responsive protein 27 (SRP27); Estrogenregulated 24 kda protein; 28 kda heat shock protein. 8. gi 4507949: 14 3 3 protein béta; 14 3 3 protein beta (14 3 3 beta); 14 3 3 protein alpha (14 3 3 alpha); Protein kinase C inhibitor protein¹1; PKC inhibitor protein¹1 (KCIP¹1: auch 14 3 3 zeta); RNH¹1. 9. gi 4507953: 14 3 3 protein zéta; 14 3 3 zeta; 14 3 3 delta; KCIP¹1 (14 3 3 beta is); YWHAZ; mitochondrial import stimulation factor S1 (MSF S1); Factor activating exoenzyme S; tryptophan monooxygenase activation protein zeta; tyrosine monooxygenase activation protein zeta. 10. gi 2073569: nukleáris kloridion-csatorna protein; chloride intracellular channel 1 (CLIC¹1); nuclear chloride ion channel protein (p64clcp); nuclear chloride channel; chloride channel ABP; Nuclear chloride ion channel 27 (NCC27); RNCC protein; Nuclear chloride ion channel 27 (NCC27). 11. Azonosítás nélkül 12. (Annexin A3, lásd 23.) 13. gi 5803227: 14 3 3 protein tau; 14 3 3 tau; 14 3 3 theta; S15076 protein kinase regulator 14 3 3; HS1; tryptophan 5 ¹monooxygenase activation protein; tyrosine 3 ¹monooxygenase activation protein. 14. gi 13129150: hõsokk protein 90 (HSP90); Heat shock protein 90 (HSP¹90); Heat shock protein HSP 90¹alpha; heat shock protein 90¹alpha; 90 kda heat-shock protein; heat shock protein 86 (HSP 86); Hspca; heat shock 90 kda protein 1; heat shock protein 1; Tumor specific transplantation 86 kda antigen (TSTA). 15. gi 20070125: protein-diszulfid-izomeráz (PDI); protein disulfide isomerase (PDI); Prolyl-4-hydroxylase beta; protein disulfide oxidoreductase; thyroid hormone binding protein p55; glutathione insulin transhydrogenase. 6
1 HU 008 601 T2 2 16. gi 4557581: epidermális zsírsavkötõ protein (E¹FABP); Fatty acid binding protein 5 (FABP¹5); epidermal fatty acid-binding protein (E¹FABP); Psoriasis-associated fatty acid-binding protein (PA- FABP); cutaneous fatty acid-binding protein (C¹FABP); keratinocyte lipid binding protein (KLBP); DA11. 17. gi 12707570: mitokondriális enoil-koenzim A¹hidratáz; Mitochondrial Enoyl Coenzyme A hydratase; Mitochondrial enoyl-coa hydratase; short-chain enoyl-coa hydratase, mitochondrial; short-chain enoyl-coenzyme A hydratase (SCEH). 18. gi 16307090: nukleofoszmin; Nucleophosmin; nucleolar phosphoprotein B23; Nucleolar protein NO38; numatrin; NPM(1). 19. gi 7768772: HES1 protein, E. coli és zebrahal ES1 Protein homológ, anti-sigma cross-reacting protein homológ 1 alpha precursor, KNP- 1a/Kpn¹1 alpha, GT335, E. coli SCRP27A és zebrahal ES1 homológ [Homo sapiens]. 20. gi 4506181: proteaszom alfa¹2 alegység; proteasome subunit HC3, proteasome component C3; macropain subunit C3; multicatalytic endopeptidase complex subunit C3 [Homo sapiens]. 21. gi 4502171: adenin-foszforibozil transzferáz; AMP pyrophosphorylase; AMP diphosphorylase; transphosphoribosidase. 22. gi 11056044: szervetlen pirofoszfatáz; cytosolic inorganic pyrophosphatase; inorganic pyrophosphatase 1; pyrophosphate phospho-hydrolase [Homo sapiens]. Ezenkívül még négy további protein azonosítható, amelyek rákos szövetekben a kontrollszövetekhez viszonyítva egyes betegcsoportoknál (csoportos analízis, Clusteranalyse) felülszabályozódnak, illetve alulszabályozódnak. Az itt érintett proteinek az annexin A3, transzgelin, triózfoszfát-izomeráz és aldoláz A. Az annexin A3 rákos szövetekben mintegy 5¹szörösen felülszabályozódik, és a transzgelin mintegy 5¹szörösen alulszabályozódik. A triózfoszfát-izomeráz és az aldoláz A rákos szövetekben egyenként mintegy 20%¹os, illetve mintegy 10%¹os mértékben felülszabályozódik. Ebben az összefüggésben utalunk a 3. ábrára, amely grafikus módon mutatja a csoportos analízis eredményeit. Ezekbõl látható a különbözõ proteinek felül¹, illetve alulszabályozottsága rákos szövetekben meghatározott betegcsoportoknál, illetve csoportoknál, melyeket egyenként egy kör ábrázol az egészséges szövetekhez viszonyítva. Az annexin A3 és transzgelin angol nyelvû szinonimái a következõk: 23. gi 4826643: annexin A3; Annexin III; lipocortin III; anticoagulant protein III; Placental anticoagulant protein III (PAP III); 35 alpha calcimedin. 24. gi 4507359: transzgelin; SM22-alpha smooth muscle protein, 22 kda actin-binding protein, Smooth muscle 22 protein, Actin-associated protein p27, 25 kda F¹actin-binding protein. Ezenkívül még további proteineket azonosítottunk, amelyek rákos szövetek kontrollszövetekkel történõ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 összehasonlításban meghatározott betegcsoportoknál eltérõ abundanciát mutatnak, illetve felül¹, illetve alulszabályozottak. Ilyen proteinek az ATP-szintáz, biliverdin-reduktáz B, glükózszabályozó protein, prolil-4-hidroxiláz béta és dnak-szerû molekuláris kaperon. Ezek közül az ATP-szintáz alulszabályozott, és az ilyen proteinek maradéka felülszabályozott. Érdekes módon az azonosított proteinek közül sok összefüggést mutat a lipidmetabolizmussal. Az annexin A3 és SAP esetén leírták a lipidek közvetlen megkötését. Mindkét protein részt vesz a fagocitotikus folyamatokban. FABP¹3 és E¹FABP alkalmazásával két zsírsavkötõ proteint azonosítottak. A mitokondriális enoil-koenzim A¹hidratáz zsírsavak ¹oxidálásában vesz részt. A HSP27 aktivitását a protein-kináz C aktivitása stimulálja, amit önmagában a foszfolipázok aktivitása befolyásol, amelyek foszfolipideket alakítanak át. A HSP90 szintén befolyásolja a foszfolipid-anyagcserét, mivel a HSP90 gátlása megváltozott foszfolipidmetabolizmust eredményez (Chung Y. L. és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 95, 1624 33, 2003). Ezenkívül feltételezhetõ, hogy a PDI is a lipidmetabolizmussal van összekapcsolva, mivel a PDI multifunkcionális proteinként mûködik, ami többek között a trigliceridtranszferben vesz részt (Horiuchi R. és Yamauchi K,: Nippon- Rinsho 52, 890 5, 1994). Ezenkívül a 14 3 3 proteinek a protein-kináz C aktivitását gátolják, és olyan konzervált szekvenciákat tartalmaznak, amelyek a proteinkináz C pszeudoszubsztrátum doménjéhez és az annexin C¹terminális részéhez hasonlítanak. Mindez arra utal, hogy a különbözõ ilyen proteinek között funkcionális összefüggés áll fenn. Az annexin A3 proteinnel prosztatarák, elsõsorban prosztatakarcinóma diagnosztizálható. Mint a bevezetõben említettük, a prosztatakarcinóma a férfiaknál leggyakrabban elõforduló rosszindulatú tumor. A prosztata megelõzõ mûtéti eltávolítása csak a prosztatatumor korai stádiumban történõ kimutatása esetén lehet eredményesnek ígérkezõ terápia. Egy elõrehaladott, már nemcsak egy szervre korlátozott betegség esetén a prosztata megelõzõ eltávolítása már nem elegendõ. Az ilyen részben inoperatív prosztatatumoroknál a férfi szexuális hormonok gátlása jöhet szóba. Az ilyen gátlás, elõnyösen mûtéti vagy farmakológiai kasztrálással kombinálva részben gátolja a tumor proliferációját és metasztázisát, és így lehetõvé teszi ezek meghatározott idõtartamra kiterjedõ kontrollálását. A legtöbb prosztatatumor esetén azonban idõvel bizonyos rezisztencia alakul ki az endokrinológiai terápiával szemben. Más terápiás lehetõségek, így például citotoxikus szerek, génterápia vagy immunoterápia alkalmazása klinikai kísérleti fázisban vannak, és sajnálatos módon ezekkel eddig még nem sikerült átütõ eredményeket elérni. Ez szükségessé teszi, hogy a prosztatarákot a lehetõ legkorábbi stádiumában ismerjük fel, hogy így még sebészetileg sikeresen kezelhetõ legyen. Az annexin A3 találmány szerinti alkalmazásával több protein vizsgálata során a prosztatarák meghatározott altípusa diagnosztizálható. A feltalálók kimutatták, hogy meghatározott proteinminták úgynevezett 7
1 HU 008 601 T2 2 csoportanalizálásával mérhetõ különbözõ proteinek jellemzõ felül¹, illetve alulszabályozottsága, ami meghatározott betegcsoportokkal korrelál. Itt egy csoportba tartozó betegek mindig a prosztatarák egy meghatározott altípusát mutatják. Ebbõl a szempontból hivatkozunk a 3. ábrára, amely grafikus módon ábrázolja a különbözõ betegcsoportokra jellemzõ proteinmintákat. A 4. ábrán táblázatos formában foglaljuk össze a különbözõ betegcsoportokat, illetve a prosztatarák különbözõ altípusait reprezentáló proteinmintákat. A prosztatarák különbözõ altípusainak diagnosztizálásához különbözõ proteinek kombinációját vizsgáljuk az abundancia szempontjából. Ehhez az annexin A3 proteint legalább egy alábbi proteinnel kombinálva analizáljuk a prosztatarák három altípusának (betegcsoportjának) megfelelõen: (a) altípus: a felülszabályozott transzgelin, erõsen alulszabályozott galektin, erõsen alulszabályozott mikroszeminoprotein béta, alulszabályozott zsírsavkötõ protein 3, semmilyen vagy csekély elváltozás az epidermális zsírsavkötõ protein esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a nukleáris kloridion-csatorna protein esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein béta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein zéta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein tau esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás az aldoláz A esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a szérum-amiloid P komponens esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a triózfoszfát-izomeráz esetén és/vagy semmilyen vagy csekély elváltozás az annexin A3 esetén, (b) altípus: az erõsen felülszabályozott protein-diszulfid-izomeráz, erõsen felülszabályozott hõsokk protein 90, erõsen alulszabályozott ubiquitin-izopeptidáz T, felülszabályozott 14 3 3 protein béta, felülszabályozott 14 3 3 protein zéta, felülszabályozott 14 3 3 protein tau, felülszabályozott aldoláz A, felülszabályozott triózfoszfát-izomeráz, felülszabályozott annexin A3, alulszabályozott transzgelin, alulszabályozott galektin, alulszabályozott mikroszeminoprotein béta, alulszabályozott szérum-amiloid P komponens, semmilyen vagy csekély elváltozás a zsírsavkötõ protein 3 esetén és/vagy semmilyen vagy csekély elváltozás a nukleáris kloridion-csatorna protein esetén, vagy (c) altípus: az erõsen felülszabályozott nukleáris kloridion-csatorna protein, alulszabályozott szérumamiloid P komponens, semmilyen vagy csekély elváltozás a zsírsavkötõ protein 3 esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein béta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein zéta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein tau esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás az aldoláz A esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a triózfoszfát-izomeráz esetén, csekély elváltozás az annexin A3 esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás az epidermális zsírsavkötõ protein esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a mikroszeminoprotein béta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a galektin esetén és/vagy semmilyen vagy csekély elváltozás a transzgelin esetén. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Az ismertetett proteinek diagnosztikai markerként történõ találmány szerinti alkalmazása során különbözõ módszerek alkalmazhatók a proteinek rákos szövetekben (például a vizsgálandó szövetekben) mutatott gyakoriságának, illetve abundanciájának a kontrollszövethez viszonyított analizálására. Különösen elõnyös, ha a vizsgálandó minta és a kontrollminta proteinjeit gélelektroforetikusan szétválasztjuk, például a szokásos poliakrilamidgélen. Ezután a mindenkori proteinnek a mintában és a kontrollban mutatott abundanciáját egymással összehasonlítjuk. A szükséges felbontás érdekében itt elsõsorban elõnyösen kétdimenzionális gélt alkalmazunk. Lehetséges az is, hogy a gélelektroforetikus szétválasztás elõtt egy elõtisztítást végzünk úgy, hogy például egy egydimenzionális poliakrilamidgélelektroforézissel is kielégítõ szétválasztást és analizálhatóságot érjünk el. A proteinek szétválasztására elõnyösen alkalmazhatók más módszerek is, például a szokásos kromatográfiás módszerek, elsõsorban az oszlopkromatográfiás módszerek. Különösen elõnyös, ha a vizsgálandó mintát és a kontrollmintát eltérõ markerrel jelöljük, például eltérõ izotópokat alkalmazunk. Ez megkönnyíti a mindenkori protein esetén a vizsgálandó mintában és a kontrollban mért abundancia összehasonlítását. Egy további elõnyös megvalósítási mód értelmében az analizálandó proteint tömegspektrometriásan vizsgáljuk, ami lehetõvé teszi a protein pontos azonosítását. Így például szöveteknél vagy testfolyadék-preparátumoknál alkalmazható a Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation -módszer (SEL- DI-módszer). Elõnyösen alkalmazhatók továbbá az in vivo leképezõ eljárások, elsõsorban a pozitronemissziós tomográfia (PET). Ezenkívül a vizsgált proteinek kvalitatíve és kvantitatíve jellemezhetõk olyan molekulák segítségével, amelyek a diagnosztikai markerként alkalmazott mindenkori vizsgált proteinre irányulnak. Ilyen molekulaként különösen elõnyösen alkalmazhatók az antitestek, elsõsorban a poliklonális és/vagy monoklonális antitestek. A találmány tárgya értelmében alkalmazható továbbá minden egyéb, szakember számára ilyen összefüggésben ismert affinitásreagens. A kvalitatív és elsõsorban a kvantitatív vizsgálatokhoz alkalmazhatók a szokásos immunoassay módszerek, így például az általános enzimmel kapcsolt immunoszorbens vizsgálat (ELISA). Alkalmazhatók továbbá immunohisztokémiai eljárások és/vagy protein chipsek. Így például felhasználható a SELDI-módszer. Az analízishez vizsgálhatók például testfolyadékok vagy tumorszövetek. Az antitestek különösen alkalmasak annexin A3, 14 3 3 protein béta, 14 3 3 protein tau, 14 3 3 protein zéta és/vagy SAP vizsgálatához. Így például a Pan anti 14 3 3 béta/zéta monoklonális antitest (Stressgen katalógusszám KAM-CC012C) megfesti az epitélium- és rákos sejteket, valamint a sztrómában található limfocitákat. A szérum-amiloid P¹komponensre (SAP) specifikus egér monoklonális antitest (Stressgen katalógusszám HYB 281 05, vizsgálati hígítás 1:10) megfesti a sztrómát, de nem festi meg az epitélium- vagy rákos sejteket. 8
1 HU 008 601 T2 2 A különbözõ proteineknek abundanciájára a kontrollszövettel szemben a találmány szerint megállapított jellemzõ elváltozás kihat elsõsorban a mindenkori protein aktivitására, például annak enzimatikus aktivitására. Ezért elõnyös továbbá, ha az abundancia vizsgálata mellett vagy annak alternatívájaként a mindenkori proteinaktivitást is meghatározzuk és a kontrollhoz viszonyítjuk. Ez is értelmezhetõ a különbözõ proteinek felül¹, illetve alulszabályozottsága alatt. Egy megfelelõ vizsgálat megvalósítható például a szokásos enzimtesztek alkalmazásával, amelyek a mindenkori protein vonatkozásában szakember számára ismertek. Ezenkívül például zsírsavkötõ proteinek esetében alkalmazhatók megfelelõ kötõdési vizsgálatok vagy ehhez hasonló vizsgálatok a protein aktivitására, illetve felülvagy alulszabályozottságára vonatkozó ismeretek megszerzése érdekében. Hasonló érvényes más proteinekre is. Így például mérhetõk meghatározott csatornaaktivitások a nukleáris kloridion-csatorna protein (CLIC¹1) vizsgálatához. Ezek felhasználhatók a különbözõ proteinek diagnosztikai markerként történõ alkalmazásához, illetve a következõkben ismertetésre kerülõ találmány szerinti diagnosztizálókészletek esetén. Ezenkívül a mindenkori proteinek aktivitásának ilyen jellegû mérése megvalósítható egy hatóanyag hatásának tesztelésére, amely a találmány értelmében rák kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény elõállítására alkalmazható, ahogy ezt a késõbbiekben ismertetjük. A találmány szerinti alkalmazás egy további elõnyös megvalósítási módja értelmében a legalább egy protein vizsgálatához például a betegbõl vett mintából exoszómákat izolálunk, és az egy vagy több proteinre analizáljuk. Elõnyösen egy vagy több protein proteinmintáját vizsgáljuk az exoszómán belül, és így egyetlen vagy több proteinre megállapítjuk a diagnosztikailag releváns felül- és/vagy alulszabályozottságot. Az exoszómáknak a például betegbõl vett mintából történõ megfelelõ izolálása szokásos módszerekkel megvalósítható, amelyek szakember számára ismertek. A vizsgálandó minták és a kontrollminták általában egy beteg testébõl származnak, ahol például szövetmintát vagy testfolyadékokból, így például vérbõl, szérumból, nyirokfolyadékból vagy vizeletbõl származó mintát veszünk, és valamely szakember számára ismert módon feldolgozzuk. Különösen elõnyös, ha a potenciálisan rosszindulatú szövetet, vagyis jellemzõen a vizsgálandó szövetet, és a kontrollszövetet, vagyis a jóindulatú szövetet, ugyanabból a betegbõl vesszük, és közvetlenül egymáshoz hasonlítjuk. Lehetséges azonban az is, hogy a mindenkori proteinek abundanciáját más standardekhez viszonyítjuk, amelyek például statisztikusan meghatározhatók nagyszámú független kontrollmintából. Prosztatarák esetében elõnyösen a jóindulatú és a potenciálisan rosszindulatú prosztataszöveteket egy betegbõl vesszük, akinél például prosztatakimetszést vagy biopsziát végzünk. A kontrollszövet lehet például jóindulatú prosztatahiperplázia-szövet. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Példák A találmány értelmében releváns proteinek azonosításához betegek két csoportjából (A csoport: 23 beteg és B csoport: 33 beteg) származó szövetmintákat vizsgálunk. A rákos szöveteket és a kontrollszöveteket egyenként elõkészítjük, és ezekkel kétdimenzionális poliakrilamid-gélelektroforézist (2D-PAGE) végzünk. Az izoelektromos fokuszálást ph=4 7 és ph=6 11 értéken végezzük. Az A csoportból származó két betegnél a gélelektroforetikus eredmények további analízist nem tettek lehetõvé. További két betegnél ph=6 11 értéknél nem kielégítõ eredményeket kaptunk. A ph=4 7 tartományban összesen 21 betegtõl kapott eredmények, és a ph=6 11 tartományban összesen 19 betegtõl kapott eredmények voltak kiértékelhetõk. A B csoportból két betegnél kapott eredmények ph=4 7 tartományban további analízisre alkalmatlanok voltak. A ph=4 7 tartományban összesen 31 betegtõl kapott eredmények voltak kiértékelhetõk. Minden betegnél a két különbözõ mintát egyenként eltérõ izotóppal jelöljük, összekeverjük, és egyetlen kétdimenzionális poliakrilamidgélen elektroforetikusan szétválasztjuk. Az egyes izotópok jeleit ezután egymástól elkülönítve detektáljuk úgy, hogy mindkét szövetminta proteinmintáját közvetlenül egymással hasonlítjuk össze (proteotóp technológia). A proteinek végsõ azonosításához a radiojelölésû protein analitikai mennyiségét (<1 g) az azonos mintából származó protein preparatív mennyiségével (>200 g) együtt preparatív dúsítógélen választjuk szét. A kérdéses proteinfoltokat ezüsttel megfestett preparatív gélbõl kivágjuk, tripszinnel emésztjük, és matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) módszerrel azonosítjuk (Bruker BiFlex vagy Ultra-Flex). Részben alkalmazható az electrospray ionization ion trap mass spectrometry (ESI¹MS) módszer is (Bruker Esquire). Ily módon különbözõ proteinek egyértelmûen azonosíthatók, amelyek egyezõ módon fokozott vagy csökkentett abundanciát mutatnak rákos szövetben a kontrollszövethez viszonyítva. Az analízisnél részben meghatározott betegcsoportokat képezünk, melyeken belül vizsgáljuk a különbözõ proteinek abundanciáját. Ennél az úgynevezett csoportanalízisnél (Clustan Graphics 6.4) az A csoportba tartozó betegeknél három csoportot és a B csoportba tartozó betegeknél két csoportot határozunk meg, akik egyenként jellemzõ protein expressziós/abundancia mintát mutatnak. Ezzel az eljárásmóddal annexin A3, transzgelin, triózfoszfát-izomeráz és aldoláz A proteineket azonosítunk, amelyek meghatározott betegcsoportoknál jellemzõ abundanciát mutatnak. Szövetminták Egészséges prosztataszövet- és rosszindulatú prosztataszövet-mintákat veszünk olyan betegekbõl, akiknél elõzetesen prosztatakimetszést végeztünk. A betegeket PSA-vizsgálattal (prosztataspecifikus antigén) ellenõrizzük, és a tumort ultrahanggal állapítjuk 9
1 HU 008 601 T2 2 meg. A mûtét megvalósítása elõtt minden betegtõl beleegyezést kérünk. Közvetlenül az eltávolítás után a prosztatát steril dobozba helyezzük, és ott lehûtjük. Ezután 0,5 1 cm vastag szövetmetszeteket készítünk, amiket egy bal és egy jobb félre osztunk. Ezeket egy freezing mátrixba (fagyasztómátrixba) ágyazzuk be, és sokkszerûen lefagyasztjuk. A prosztata maradékát formalinban fixáljuk, és a szokásos eljárással tovább kezeljük. Szövetminták elõállításához vékony szakaszokat veszünk a prosztata mindkét oldaláról, és hematoxilin-eozin festékkel megfestjük. Ezeket a metszeteket felhasználásig 80 C hõmérsékleten tároljuk. A kontrollszövetmintákat tumortól mentes területekrõl vesszük, és azonos módon kezeljük. A minták elõkészítése A proteineket 100 l forró 2% SDS, 0,1 mol/l Tris, ph=8,8, elegyben lizáljuk, és a proteinkoncentrációt Bicinchoninic acid módszerrel (BCA) mérjük. Ezután a szokásos módon 125 I, illetve 131 I izotóppal jódozzuk, kétdimenzionális poliakrilamid-gélelektroforézist végzünk, és az adatokat analizáljuk (Cahill és munkatársai: Rapid Communications in Mass Spectrometry 17, 1283 1290). A radioaktív jód beszerezhetõ az Amersham Bioscience (Freiburg) cégtõl. A proteinek jódozását 125 I vagy 131 I izotóppal végezzük egymástól elkülönítve és azonos jódkoncentrációnál. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Poliakrilamid-gélelektroforézis A poliakrilamidgélre történõ felvitelhez a jelölt minták (rákos szövet és kontrollszövet) azonos proteinmennyiségeit egymással összekeverjük. A 4 7 és 6 11 ph¹tartományokban végzett izoelektromos fokuszáláshoz (IEF) a mintákat egy szokásos mintapufferben 18 cm immobilizált ph¹gradiens (IPG) csíkokra (Amersham Bioscience) visszük. Az IEF fokuszálást, mint a 2D¹PAGE proteinszétválasztás elsõ dimenzióját egy Multiphor berendezésen (Amersham Bioscience) végezzük. A második dimenziót (SDS-PAGE) egy ISO-DALT berendezések (Höfer) végezzük. A géleket megszárítjuk, 80 m mûanyag filmre lamináljuk, és ezután elvégezzük a két radioizotóp jelének radioaktív mérését. A különbözõ radioizotópok választott analizálásával elérhetõ a különbözõ minták proteinjeinek kvantitatív, többszínû differenciált ábrázolása. Ezért az egy gélen szétválasztott két minta integrált proteinfolt-intenzitásainak közvetlen összehasonlítása felhasználható a további analízishez. Az egy gélen végzett analízis elõnye, hogy nem kell figyelembe venni a két vagy több gél közötti variációkat. A legnagyobb potenciális hibaforrás az egyik vagy másik izotóppal végzett eltérõ sztöchiometriai jelölés. Ez egyenként fordított jelöléssel ellátott gélek elõállításával kizárható. Ez azt jelenti tehát, hogy a kontrollmintát és a rákos szövet mintáját egyenként az egyik, majd a másik izotóppal is jelöljük, és egyenként inverz módon egymáshoz viszonyítjuk. Mivel a mindenkori inverz jelölési eljárással kapott proteinminták egybeesnek, a kvalitatív kritériumok teljesítve vannak. Számítógéppel segített eljárás esetén a különbözõ izotópszignálok egyenként eltérõ színnel (kék, illetve narancssárga) láthatóvá tehetõk, és így megjelennek az abundanciában jelentkezõ konzisztens eltérések a minták között az alkalmazott izotópjelöléstõl függõen az egyik, illetve a másik színben. Az eljárást közelebbrõl ismertetik Cahill és munkatársai: Rapid Communications in Mass Spectrometry 17, 1283 1290 (2003). Képanalízis A proteinabundancia differenciális analízise az ismertetett poliakrilamidgélen kapott proteinfoltok véletlenszerû differenciált kvantifikálásán alapszik. A kvantitatív képanalízishez a Phoretix 2D Advanced szoftvert (Nonlinear Dynamics) alkalmazzuk, ahol saját illesztést végzünk. A proteinek azonosítása tömegspektrometria alkalmazásával Elvben két tömegspektrometriás módszert alkalmazunk. Az egyik az erõsen abundáns proteinek nagyon gyors és véletlenszerû azonosítása peptide mass fingerprinting módszerrel kiegészített MALDI-TOF MS vizsgálat. A nagyon alacsonyan abundáns proteinek azonosítását idõigényesebb LC¹ESI IonTrap-MS/MS vagy MALDI-TOF-TOF módszerrel végezzük. Összefoglalva kivágjuk a kiválasztott proteinfoltok géldarabkáit, és a géldarabkákban található proteineket tripszinnel emésztjük. A kapott oldatot elõször peptide mass fingerprint módszerrel analizáljuk MALDI-TOF¹MS módszer alapján. Azoknál a proteinfoltoknál, amelyeknél ily módon nem lehetséges az egyértelmû azonosítás, lassabb fragmension-analízist végzünk MALDI- TOF-TOF vagy LC¹ESI IonTrap-MS/MS módszer alapján. Az említett módszerek pontos leírását adja Vogt és munkatársai: Rapid Communication in Mass Spectrometry 17, 1273 1282 (2003), valamint Vogt és munkatársai: Molecular Cellular Proteomics 2, 795 (2003). A proteinek azonosítása A proteinek azonosításához a tömegspektrometriával kapott peptidtömeget NCBI-protein adatbankkal szemben értékeljük ki. Ezt a MASCOT Version 1.9 programmal (Matrix Science, London, UK) végezzük. Kvantitatív képanalízis A kvantitatív analízist a digitális adatok segítségével végezzük, amiket egy radioaktív leképezõ fotosokszorozójával a képmátrix minden pixeljére megrajzolunk. A proteinfolt határait Phoretix 2D Advanced szoftverrel (Nonlinear Dynamics) határozzuk meg, és a folt területén belüli pixel értékeket egy megfelelõ háttérjel levonása után integráljuk. A generált komplett adatok alapján elvégezzük a detektált proteinfolt részletes kvantifikálását. Az 1. táblázat ilyen eredmények összefoglalását adja. Az 1. és 2. ábra egyenként a kiválasztott proteinfoltok pozícióit mutatja egyszer ph=4 7 izoelektromos fo- 10
1 HU 008 601 T2 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 kuszálásnál (1. ábra) és a másik esetben ph=6 11 esetén (2. ábra). Az ábrák a következõk: 1. ábra: Kétdimenzionális poliakrilamidgél ábrázolása a szétválasztott proteinekkel az A csoport egyik betegénél. Az izoelektromos fokuszálás ph=4 7 tartományban történt. A számokkal jelölt proteinfoltok azok a proteinek, amelyek eltérõ abundanciát mutatnak rákos szövetekben és kontrollszövetekben. A számozás az 1. táblázatnak felel meg. 2. ábra: Kétdimenzionális poliakrilamidgél ábrázolása szétválasztott proteinekkel az A csoport egyik betegénél. Az izoelektromos fokuszálás ph=6 11 tartományban történt. A számokkal jelölt proteinfoltok azok a proteinek, amelyek eltérõ abundanciát mutatnak rákos szövetekben és kontrollszövetekben. A számozás megfelel az 1. táblázatnak. 3. ábra: Meghatározott betegcsoportra, illetve a prosztatarák altípusaira jellemzõ proteinminta grafikus ábrázolása. A p<0,01 T¹teszt valószínûségi eredményeket feketén ábrázoljuk, a 0,01<p<0,1 T¹teszt valószínûségi eredményeket szürkén ábrázoljuk. Azokat a proteineket, amelyek abundanciája különbözõ csoportokon belül változik, bekeretezve ábrázoljuk. 4. ábra: Az A csoportba tartozó betegek 1 3 csoportjánál mért eltérõ proteinszintek táblázatos ábrázolása a jóindulatú (egészséges) és rosszindulatú elfajult szövetek összehasonlításában. Az adatok a rákos szövetben mért proteinfolt méretének százalékos adatai standard hibával a teljes (jóindulatú+rosszindulatú) proteinfoltmérethez viszonyítva. A T¹teszt-eredményeket valószínûség formájában adjuk meg, ami a két adott csoportból származó foltfrakciók eloszlását szignifikánsan megkülönbözteti. A legalább 99%¹os T¹teszt-eredményeket vastag betûvel ábrázoljuk. A 95% alatti eredményeket világosszürke betûvel ábrázoljuk. 5. ábra: Az A csoportba tartozó betegeknél a jóindulatú (egészséges) és rosszindulatú szövetek összehasonlításában szignifikáns differenciált abundanciát mutató proteinfoltok táblázatos listája a kétszínû proteotóp analízis alapján. A megfigyelések száma azon betegek számát adja meg, akiknél a folt megfigyelhetõ. A foltfrakciót a jóindulatú (benignus frakció) és rosszindulatú (rákfrakció) esetén standard hibával (SD) adjuk meg a teljes folttérfogat (jóindulatú+rosszindulatú) százalékában. A T¹teszt eredménye az a valószínûség, amellyel a jóindulatú szövetben talált foltfrakciók eloszlása eltér a rákos szövetben talált eloszlástól, valamennyi beteg figyelembevételével. A foltokat azzal a feltétellel választjuk ki, hogy a T¹teszt valószínûsége legalább 99%. 6. ábra: Kétdimenzionális poliakrilamidgél ábrázolása a szétválasztott proteinekkel a B csoport 14. betegénél. Mind a kontrollmintát, mind a rákos szövet mintáját 131 I- és 125 I-ionokkal jelöljük, és egymással inverz módon hasonlítjuk össze. A különbözõ izotópjeleket egyenként eltérõ színnel (kék, illetve narancssárga) tesszük láthatóvá úgy, hogy konzisztens eltérés jelenjen meg a proteinek abundanciájában a különbözõ minták között egyenként az egyik, illetve a másik színen az alkalmazott izotópjelöléstõl függõen. 7. ábra: Grafikus ábrázolás, amely a proteotóp mérés pontosságát és statisztikai jelentõségét mutatja a B csoport mintáján: a: Bland és Altman grafikon, amely a differenciális M abundancia arányban jelentkezõ eltérés és annak számszerû átlaga közötti arányt mutatja 125 I- és 131 I-ionokkal jelölt gél esetén, b: grafikon, amely a differenciált M abundancia arányban jelentkezõ eltérés és az A intenzitás számszerû átlaga közötti arányt adja meg 125 I- és 131 I-ionokkal jelölt gél esetén, c: MA grafikon, amely a differenciált M abundancia arányt és az A intenzitás közötti arányt mutatja 125 I- és 131 I-ionokkal jelölt gél esetén, ahol M=log2 (I2/I1) és A=0,5 Iog2 (I1 I2) (I=mért intenzitás). 8. ábra: Volcano grafikon, amely a karcinómás és jóindulatú szövetekbõl származó kimutatott inverz jelölésû proteinek átlagos intenzitása közötti különbséget mutatja. 9. ábra: A B csoport rákos betegeinél a protein abundancia eloszlási minta két alcsoportjánál végzett Pavlidis Templat Matching analízis grafikus ábrázolása. Az egyik csoport 22 betegbõl áll, a másik csoport, amely ettõl lényegesen eltér, 9 betegbõl áll. A protein számozása megfelel a 10. ábrán mutatott táblázat számozásának. A 22 betegbõl álló alcsoporton belül jelentõsen eltér az annexin A3 (14. protein) relatív abundanciája. Ez a protein a 14., 11. 10., 21., 3., 1., 6., 22., 23., 7., 4., 19. és 27. betegnél lényegesen nagyobb abundanciát mutat a rosszindulatú prosztataszövetben, mint a 29., 28., 32., 15., 31., 24., 25., 30. és 33. betegnél. 11
1 HU 008 601 T2 2 10. ábra: A differenciált analízisbõl származó proteinfoltok táblázatos ábrázolása mind a 31 betegnél (B csoport), a 22 beteget tartalmazó csoportnál és a 9 beteget tartalmazó csoportnál (Pavlidis Templat Matching analízis alapján). Az Acc-szám az NCBI-adatbankon belüli mindenkori számnak felel meg. A PMF-érték alatt a MASCOT-technikával kapott találatot értjük. A PMF-érték a Mowse-értékre vonatkozik, ami a MASCOT-szerverrõl származik, ahol általában a 65 fölötti PMF-érték szignifikáns azonosítást reprezentál. A csillaggal jelölt proteinek azonosítását LC/MS/MS módszerrel végezzük. A karcinómás szövetekre vonatkozó átlagos foltfrakciót az SD¹értékkel a teljes folttérfogat (jóindulatú+rosszindulatú) százalékában adjuk meg. Szintén megadjuk a modellre vonatkozó T¹értéket. A folyamatos sávok táblázatos ábrázolásban az egyes proteinek százalékos átlagos abundanciáját mutatják jóindulatú (sötétkék) és karcinómás (halvány narancssárga) mintákban a megadott betegcsoportokra vonatkozóan. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1. Annexin A3 protein alkalmazása diagnosztikai markerként prosztatarák esetén, azzal jellemezve, hogy a prosztataráknál a prosztatarák meghatározott altípusairól van szó, ahol a prosztatarák altípusai az alábbiak közül vannak megválasztva: (a) altípus, amelyre jellemzõ a felülszabályozott transzgelin, erõsen alulszabályozott galektin, erõsen alulszabályozott mikroszeminoprotein béta, alulszabályozott zsírsavkötõ protein 3, semmilyen vagy csekély elváltozás az epidermális zsírsavkötõ protein esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a nukleáris kloridion-csatorna protein esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein béta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein zéta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein tau esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás az aldoláz A esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a szérum-amiloid P komponens esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a triózfoszfát-izomeráz esetén és/vagy semmilyen vagy csekély elváltozás az annexin A3 esetén, (b) altípus, amelyre jellemzõ az erõsen felülszabályozott protein-diszulfid-izomeráz, erõsen felülszabályozott hõsokk protein 90, erõsen alulszabályozott ubiquitin-izopeptidáz T, felülszabályozott 14 3 3 protein béta, felülszabályozott 14 3 3 protein zéta, felülszabályozott 14 3 3 protein tau, felülszabályozott aldoláz A, felülszabályozott triózfoszfát-izomeráz, felülszabályozott annexin A3, alulszabályozott transzgelin, alulszabályozott galektin, alulszabályozott mikroszeminoprotein béta, alulszabályozott szérum-amiloid P komponens, semmilyen vagy csekély elváltozás a zsírsavkötõ protein 3 esetén és/vagy semmilyen vagy csekély elváltozás a nukleáris kloridion-csatorna protein esetén, vagy (c) altípus, amelyre jellemzõ az erõsen felülszabályozott nukleáris kloridion-csatorna protein, alulszabályozott szérum-amiloid P komponens, semmilyen vagy csekély elváltozás a zsírsavkötõ protein 3 esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein béta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein zéta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a 14 3 3 protein tau esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás az aldoláz A esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a triózfoszfát-izomeráz esetén, csekély elváltozás az annexin A3 esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás az epidermális zsírsavkötõ protein esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a mikroszeminoprotein béta esetén, semmilyen vagy csekély elváltozás a galektin esetén és/vagy semmilyen vagy csekély elváltozás a transzgelin esetén. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az annexin A3 felülszabályozását vizsgáljuk kontrollhoz viszonyítva. 3. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az annexin A3 felülszabályozását vizsgáljuk az annexin A1, annexin A2 és/vagy annexin A5 alulszabályozásával kombinálva. 12
HU 008 601 T2 Int. Cl.: A61P 35/00 13
HU 008 601 T2 Int. Cl.: A61P 35/00 14
HU 008 601 T2 Int. Cl.: A61P 35/00 15
HU 008 601 T2 Int. Cl.: A61P 35/00 16
HU 008 601 T2 Int. Cl.: A61P 35/00 17
HU 008 601 T2 Int. Cl.: A61P 35/00 18
HU 008 601 T2 Int. Cl.: A61P 35/00 19
HU 008 601 T2 Int. Cl.: A61P 35/00 20