Az Egészségügyi Minisztérium szakmai protokollja a tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikájáról

Az Egészségügyi Minisztérium szakmai protokollja a tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikájáról Készítette: az Orvosi Mikrobiológiai Szakmai Kollégium I. Alapvető megfontolások 1. A protokoll alkalmazási / érvényességi területe 1.1. A protokoll témája a tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikája a járó- és fekvőbeteg szakellátásban. 1.2. A protokoll célja az egységes hazai gyakorlat kialakítása, figyelembe véve a témában meghatározó jelentőségű nemzetközi (WHO, IUATLD, EuroTB, ECDC) és más külföldi szervezetek (CDC, FDA) ajánlásait és az érvényben lévő hazai rendelkezéseket. 1.3. A protokoll célcsoportjai (a protokollt alkalmazó ellátók köre): mikrobiológiai laboratóriumok mycobacteriológiai részlegei, önálló mycobacterologiai laboratoriumok, klinikai osztályok, szakrendelők, pulmonológiai gondozó hálózat 1.4. Ellátottak: tuberkulózis fertőzés és megbetegedés gyanúja, tuberkulózissal fertőzöttek, tuberkulózis betegségben szenvedők, tuberkulózis betegségre veszélyeztetettek. 1.5. A protokollt alkalmazó ellátók: mycobacteriológiai diagnosztikát végző mikrobiológiai laboratóriumok. 1.6. Ellátási szint: II. és III. kompetencia szintű mikrobiológiai laboratóriumok, melyek mycobacteriológiai diagnosztikát, mycobacteriológiai laboratóriumi szakellátást végeznek. 2. Definíciók Bakteriológiailag igazolt eset Bakteriológiailag nem igazolt eset Újonnan igazolt eset Korábban tuberkulózis miatt már kezelt eset Antituberculotikum rezisztens tuberkulózis, polyrezisztens, multi-drug rezisztens (MDR) és extensively-drug rezisztens (XDR) eset II. Diagnosztikai eljárások Tuberkulózis gyanúja esetén a mikrobiológiai diagnosztikai módszerek széles skálájával és korszerű technikáinak felhasználásával (direkt mikroszkópos vizsgálatok, tenyésztés, identifikálás, nukleinsav amplifikációs technikák) törekedni kell arra, hogy a fertőző ágenst a lehető legrövidívebb időn belül igazoljuk, és a definitív diagnózist követően a rezisztencia vizsgálatok eredményét a kezelő orvossal közöljük. Kötelező (minimálisan elvégzendő) mikrobiológiai diagnosztikai vizsgálatok és azok gyakorisága A tuberkulózis definitív diagnózisának felállításának alapfeltétele a M. tuberculosis-nak a beteg testnedveiből (köpet, pleurális folyadék, vizelet, hörgőmosó folyadék, stb) tenyésztéssel történő kimutatása, vagy a kórokozó direkt nukleinsav amplifikációs módszerekkel történő detektálása direkt mikroszkópos vizsgálattal kapott saválló pozitivitás mellett. A diagnózis felállításához minimum három, maximum öt adekvát vizsgálati mintára van szükség. A terápiában még nem részesült, vagy két hónapnál kevesebb ideig kezelt beteg első M. tuberculosis tenyészetéből a kezdeti rezisztencia vizsgálatok kötelezően elvégzendők. Ismert fertőzés fennállásakor pedig követni kell a beteg fertőzőképességét (mikroszkópos vizsgálatok), és monitorozni kell a gyógyulás folyamatát (tenyésztés és rezisztencia 1

vizsgálatok). A kezelés 4. hónapját követően is baktériumot ürítő beteg esetén a rezisztencia vizsgálat megismétlendő. A beteg akkor tekinthető gyógyultnak, ha a kezelés alatt, illetve annak befejezése után megfelelő számú negatív tenyésztési lelettel igazolták, hogy nem ürít baktériumot. 1. Szakmai háttér A mycobacteriológiai laboratóriumok alapvető szerepet játszanak a tuberkulózis elleni hatékony védekezésben, hiszen a definitív klinikai diagnózis felállításához nélkülözhetetlen feltétel a kórokozó baktérium izolálása és identifikálása. A mycobacteriológiai vizsgálatok elengedhetetlen információkat szolgáltatnak az antituberkulotikus kezelés összetételének meghatározásához, valamint a kezelés hatásosságának monitorozásához is, részben a kórokozó kimutathatóságával, részben az izolálást követő rezisztencia vizsgálatok eredményeivel. Magyarországon a bakteriológiailag igazolt TBC-s betegek aránya évek óta mindössze 46 % körüli értéken van. Ennek okai között szerepet játszik, hogy az ország legtöbb TBC laboratóriumában jelenleg alkalmazott bakteriológiai módszerek érzékenysége nem megfelelő illetve, hogy a betegek egy jelentős százalékában (bakteriológiailag negatív esetek egyharmadában) egyáltalán nem készül tenyésztés, illetve az adatközlés nem megfelelő. További gond, hogy a tenyésztés és az ebből végzett rezisztencia meghatározás átfutási ideje klinikai szempontból elfogadhatatlanul hosszú. Így a terápiarezisztens betegek időbeni felismerése, illetve érzékeny mycobacterium okozta fertőzés esetében a kezelés 8. hetének végén szükséges gyógyszerkombináció szűkítés, valamint a kezelés hatékonyságának megfelelő monitorozása megoldatlan. Ezt a megállapítást támasztják alá a gyógyeredmények, melyek szerint a gyógyult betegek aránya nem éri el a 60 %-t, a nemzetközi 80 %-os elvárásokkal szemben. 2. Bakteriológiai vizsgálatok 2.1 Mintavétel, mintatovábbítás, tárolás (1-3) A tuberkulózis és az egyéb mycobacterialis fertőzések megbízható, pontos és főleg gyors mikrobiológiai diagnosztikájának alapja a megfelelő mennyiségű, minőségű, és kellő számú minta továbbítása a laboratóriumba. Az inadekvát mintavételből fakadó problémákat a legmodernebb molekuláris biológia módszerek sem képesek kiküszöbölni. Nagyon fontos, hogy a minták késedelem nélkül megérkezzenek a laboratóriumba, mivel egyes vizsgálatok átfutási idejét (pl. mikroszkópos vizsgálat és direkt nukleinsav amplifikáció eredménye 24 órán belül) és minőségét (tenyészetek befertőződése) nagyban befolyásolhatja, ha a vizsgálati anyagot a laboratórium mintavételt követő 24-48 órán belül nem kapja kézhez. Mycobacteriológiai vizsgálatra alkalmatlan a nyálköpet, a gyűjtött köpet, a tamponnal vett garat és sebváladék. A reggeli, ébredés utáni köpet begyűjtésére kell törekedni. A felköhögött köpetet a beteg ürítse az erre a célra rendszeresített steril edénybe. A legmegfelelőbb a 30-50 ml térfogatú, steril, milliliteres beosztású, kónuszos aljú, csavaros fedelű, műanyag centrifugacső. Optimális esetben a köpet 5-10 ml térfogatú. Ügyelni kell a mintavételi csövek megfelelő címkézésére az azonosíthatóság érdekében. A mintavételi edények 1-2 órán át szobahőmérsékleten, 24-72 órán át 2-8 C-n hűtőben tárolandók. Nagyobb nyári meleg esetén érdemes azonnal hűtőszekrényben tárolni a mintákat. Amennyiben a laboratórium nem házon belül van, akkor a centrifuga csöveket jól zárható fémtartályokba, majd ezeket papírdobozba csomagolva a megfelelő kísérő papírokkal ellátva kell továbbítani a laboratórium részére. Egyebekben 121/ 2000 Postaügyi értesítő 32. Fertőző anyagok kezelése című utasítása a mérvadó. A kísérőlap feltétlenül tartalmazza a beteg adatai mellett, hogy a kért vizsgálat célja a diagnózis felállítása/megerősítése, vagy a kezelés eredményességének ellenőrzése. Fel kell tüntetni azt is, hogy korábban tuberkulózis miatt nem kezelt, vagy tuberkulózis miatt már korábban is kezelt betegtől származik-e a vizsgálatra küldött minta. Ha ismert, fel kell sorolni azokat az antituberkulotikumokat (legfőképpen a rifampicin vonatkozásában) is, amelyekre a beteg izolátuma a korábbi vizsgálatok során rezisztens volt. Utóbbi információk kiemelten fontosak a rezisztencia vizsgálatok indítása és értékelése 2

szempontjából a laboratórium és a klinikus számára is. Amennyiben a beteg alkalmatlan értékelhető köpet adására úgy meg lehet kísérelni hypertoniás (5-10%) sóoldattal való inhaláltatást követően ún. indukált köpet gyűjtését, illetve ébredés utáni, még az ágyban levett éhgyomori gyomorbennék aspirátum (és nem mosás) nyerését. Négy órát meghaladó tárolás esetén a gyomorsav mycobacteriumokat is elölő hatását 100 mg steril szódabikarbona segítségével semlegesíteni kell. A köpeten kívül a leggyakrabban beküldésre került minták a következők: bronchusmosó folyadék, bronchoalveoláris lavage, pleurális, pericardiális vagy ascites folyadék (steril edényben, utóbbi három esetében 0,2 mg/ml steril heparin hozzáadásával vagy közvetlenül folyékonytáptalajba oltva), vizelet (> 40 ml, reggeli középsugaras vagy katéteres, nem gyűjtött, nem katéter zsákból, kellő genitális toalettet követően), széklet (> 1 g), liquor (>2-5 ml), seb vagy tályogváladék (steril fecskendőbe felszívva amennyit csak lehetséges), menstruációs folyadék, biopsziás minta (nem formalinba ágyazott, csak fiziológiás sóoldatban). A ritkábban előforduló minták esetében a mintavétel előtt érdemes a laboratórium tanácsát kérni a mintavételi, tárolási és szállítási előírásokat illetően. A mikroszkópos vizsgálatokat minden alkalommal három különböző alkalommal levett mintából, a tenyésztéseket öt különböző alkalommal levett mintából kell végezni. 2.2 A minta előkezelése: homogenizálás, dekontaminálás (1-4, 6) A minta előkezelése, homogenizálása, dekontaminálása a fertőzés veszély elkerülése érdekében laminális box-ban (minimálisan BSL2) kell hogy történjen. A mycobacteriumok osztódási ideje meglehetősen hosszú (16-20 óra) ezért a nem steril testájékokról származó minták (pl. köpet, vizelet, széklet) nem mycobacteriális, ún. kontamináns baktériumai számottevően gyorsabb növekedési ütemüknek köszönhetően könnyen túlnőhetik az adott klinikai minta mycobacteriumait. Az álnegatív eredmények elkerülése céljából a mycobacteriológiai laboratóriumok ezeket a klinikai mintákat ún. dekontaminációs eljárásnak vetik alá. A dekontamináció steril minták esetében (pl. liquor, pleurális folyadék) nem szükséges. A dekontaminálás során alkalmazott vegyszerek a kontamináns baktériumok vagy gombák elölésén kívül segítenek a gyakran erősen purulens minták homogenizálásban, valamint a centrifugálási lépések közbeiktatásával azok koncentrálásában is. A dekontaminálás hatékonyságát befolyásolja az alkalmazott reagens toxicitása, expozíciós ideje, és a centrifugálási lépés során keletkező hő károsító hatása. Mindezektől függően még a legenyhébbnek számító dekontaminálási módszer a N-Acetyl-L-Cystein-NaOH (NALC-NaOH) is elpusztítja a minta mycobacterium tartalmának legalább 33%-át, míg erősebb reagensek (pl. klórhexidin digluconikum) alkalmazása esetén ez az érték könnyen 70%-ra emelkedhet, amely jelentősen csökkentheti a tenyésztés érzékenységét. A táptalaj beszennyeződés mértékéből következtetni lehet az alkalmazott eljárás helyességére. Így szilárd táptalajon a 3%-nál alacsonyabb, ill. folyékony táptalajt használva az 5-8 %-nál alacsonyabb kontaminációs ráta esetén a dekontaminálás túl erős, míg az ezen értékek feletti arány túl gyenge dekontaminálásra utal. Többféle előkezelési technika ismert. A hazai TBC tenyésztéssel foglalkozó laboratóriumok 1976 óta egységesen a klórhexidinum-digluconatos eljárást alkalmazzák, ami a maga idejében egyszerűsége, olcsósága miatt megfelelő választás volt. A módszer nem túl munkaigényes, egyszerűen kivitelezhető, nem kell a vizsgálati anyagot centrifugálni, semlegesíteni, ezért tömeges minta feldolgozására is kiválóan alkalmas. Számításba kell azonban venni, hogy közel 30 évvel ezelőtt a laboratóriumok a mai mintaszámnak több mint hússzorosát dolgozták fel. A módszer hátránya, hogy jobban károsítja a mycobacteriumokat, mint a NALC-NaOH technika, és csak szilárd alapú tenyésztéshez alkalmazható. A két eljárás összehasonlító vizsgálata szerint a LJ-en történő tenyésztés pozitivitásának aránya közel duplájára emelkedett a NALC-NaOH előkezelés mellett. A klórhexidines módszer folyékony táptalajon történő tenyésztésre alkalmatlan (roncsolja a táptalajt), így napjainkban az újabb folyékony alapú táptalajok hazai elterjesztésének gátjává vált. Ezen okok miatt a CDC, valamint a jelentősebb nyugateurópai mycobacteriológiai referencia laboratóriumok is a NALC-NaOH előkezelést ajánlják. A 3

folyékony tenyésztő rendszerek rutinszerű alkalmazásának feltétele az adekvat előkezelési technika használata, ezért elengedhetetlen ennek az új módszernek a fokozatos hazai bevezetése. Bizonyos betegcsoportok megkülönböztetett figyelmet igényelhetnek a dekontaminálás vonatkozásában. Így például a cisztikus fibrózisban szenvedő betegek légúti mintájából egyre gyakrabban kerül izolálásra klinikai szignifikanciával (pl. transzplantálhatóság kérdése) bíró Nem Tuberculosist okozó Mycobacterium (NTM). Azonban a betegek 80%-ban a minta P. aeruginosa-t is tartalmaz, amely könnyedén túlnövi a tenyésztés során a mintában jelenlévő NTM-ot, és álnegatív tenyésztéshez vezet még a rutinszerűen alkalmazott dekontaminálási módszerek mellett is. Ezért az ilyen betegek esetében speciális 5% oxálsavas kezeléssel kiegészített dekontaminálás javasolt. 2.3 Direkt vizsgálatok 2.3.1. Mikroszkópos vizsgálatok (1-3, 6, 9-12) A direkt mikroszkópos vizsgálat a mycobacteriológiai vizsgálatok legolcsóbb, legegyszerűbben kivitelezhető és leggyorsabb módszere. Egyes laboratóriumokban a minta a dekontaminálás elhagyásával, közvetlenül kerül mikroszkópos vizsgálatra, az így készült keneteket direkt keneteknek, az így végzett vizsgálatotokat direkt mikroszkópos vizsgálatnak nevezzük. A mikroszkópos vizsgálat leggyakoribb módja azonban hogy a minták dekontaminálásra kerülnek és a mikroszkópos kenet nem közvetlenül a klinikai mintából, hanem a minta előkezelt, centrifugált üledékéből készül. Magasabb érzékenysége miatt a direkt módszerrel szemben ez a módszer választandó, azonban tudni kell, hogy a dekontaminálás során felhasznált steril desztillált víz tartalmazhat elölt saválló környezeti baktériumokat, amelyek fals pozitívvá tehetik a kenetet, ezért ilyenkor szűrt, steril desztillált víz használata ajánlott. A kenetkészítést követően a festés a Ziehl-Neelsen (ZN), Kinyoun-féle karbol fukszin alapú vagy auramin alapú fluoreszcein eljárásokkal történhet. A Kinyoun-féle festés alacsony érzékenysége miatt nem ajánlott módszer. A ZN festést követően a mycobacteriumok vörös pálcákként észlelhetőek a kék, vagy zöld háttér kontrasztja mellett. Az auramin festést követően a mycobacteriumok sárgás-zölden fluoreszkálnak fekete háttér mellett. A fluoreszcein mikroszkópia elsősorban azon laboratóriumok számára ajánlható, amelyek nagy esetszámmal dolgoznak. A sötét háttér mellett ugyanis a mycobacteriumok könnyebben észlelhetők, a fluoreszcens mikroszkóp látótere nagyobb, mindezek miatt egy-egy kenet áttekintése gyorsabb. Ez a módszer azonban még a ZN vizsgálathoz képest is nagyobb gyakorlatot igényel, a kevésbé tapasztalt vizsgáló gyakran jelez vissza álpozitív eredményt, a fluoreszcein festékrögöket nézve baktériumnak. Emellett, a fluoreszcens festés a karbol fukszinhoz képest sokkal jobb hatásfokkal képes megfesteni az antituberkulotikus kezelés miatt már károsodott saválló baktériumokat, így a mikroszkópos pozitivitás a fluoreszcens festés mellett hosszabb ideig detektálható egy kezelt beteg esetében, amely nem feltétlenül jelenti azt, hogy a kezelés inadekvát vagy a beteg még mindig fertőző. További eltérés a ZN festéshez képest, hogy a mintában esetlegesen jelenlévő vér álpozitivitást okozó fluoresceinciát eredményezhet. Mindezek miatt minden újonnan felismerésre került beteg esetében a fluoreszcens mikroszkópos pozitivitást ZN vizsgálattal meg kell erősíteni. 2.2.1/a Módszer érzékenysége, specificitása: A mikroszkópos vizsgálat legnagyobb hátránya, hogy nem kellően érzékeny és a negatív eredmény kiadásához minimum 100-300 látótér áttekintése szükséges, ami meglehetősen munkaigényes. A mikroszkópos vizsgálat érzékenysége az adott beteg populáción belül a kiterjedt tuberkulózisban szenvedő betegek hányadától, a vizsgált minta típusától (felsőlégúti vs. mélylégúti), a mintagyűjtés minőségétől, a mycobacteriumok mintán belüli számától, az alkalmazott dekontaminálási és centrifugálási módszertől (cytocentrifugálás), a centrifuga minőségétől (legalább 3000 x g) függően 50-75%. Míg a pozitív mikroszkópos eredmény a tuberkulózis preszumptív diagnózisa mellett szól, addig a negatív eredmény, az alacsony érzékenységi mutató miatt, nem zárja ki a tuberkulózis lehetőségét. Legalább 10.000 mycobacterium milliliterenkénti jelenléte szükséges ahhoz, hogy egy kenet teljes átvizsgálását követően legalább néhány saválló pálcát találjunk. A mikroszkóposan 4

pozitív betegek tehát megkülönböztetett figyelmet igényelnek, hiszen az általuk ürített baktérium mennyiség miatt ezek a betegek a legfertőzőbbek. Éppen ezért, hogy az ilyen esetben szükséges izolációs lépések időben foganatosíthatóak legyenek, a mikroszkópos vizsgálat eredményét a laboratórium 24 órán belül vissza kell, hogy jelezze a vizsgálatkérő számára. Nem szabad elfeledkeznünk azonban arról a tényről sem, hogy a mikroszkópia nem képes különbséget tenni élő és élettelen mycobacterium között. Így egy megfelelően kezelt és ellenőrzött beteg esetében a mikroszkópos vizsgálat negatívvá válást követő esetleges pozitivitása nem feltétlenül a klinikai romlás jele. Ugyancsak fontos szem előtt tartani azt a tényt is, hogy a mikroszkópos vizsgálat nem tud különbséget tenni a M. tuberculosis complex és NTM-ok között. Azaz a kenet pozitivitás atypusos Mycobacterium jelenlétének eredménye is lehet, amely nem biztos, hogy klinikai fontossággal bír. Egy hazai felmérés szerint ugyan Magyarországon a mikroszkópos vizsgálat pozitivitásának hátterében az esetek több mint 90 %-ában M. tuberculosis jelenléte igazolható tenyésztéssel, de HIV fertőzött vagy egyéb immunszupprimált betegek esetében, vagy olyan földrajzi területeken, ahol bizonyos NTM előfordulási gyakorisága magas, mindig gondolni kell NTM jelenlétére is. Emellett az aerob Actinomycetaceae-k, legionellák egyes fajai is saválló pozitivitást mutathatnak. Mindezek miatt a mikroszkópos vizsgálat eredményét saválló baktérium pozitív vagy negatív megjelöléssel kell visszajelezni. 2.2.1/b Minőségbiztosítás: Pozitív és negatív kontrollt kell alkalmazni minden új festék charge használatánál. Minden kenet pozitív mintát és a negatívak legalább 10%-át egy második vizsgálónak ellenőriznie kell. Ugyancsak figyelemmel kell kísérni a mikroszkóposan poztív és tenyésztéssel negatív betegek arányát is. Az ilyen betegek (elsősorban az újonnan nyilvántartásba vett betegekről van szó) arányának kevesebb, mint 1%-nak kell lennie. Az ennél magasabb arány dekontaminálási, tenyésztési (táptalaj minőség, rövid inkubációs idő) hibát, nehezen tenyészthető NTM (pl. M. haemophilum, M. genavense) jelenlétét vagy laboratóriumi keresztfertőzést jelezhet. 2.3.2 Direkt nukleinsav-amplifikációs módszerek (2,6,7,12,14,15) A direkt nukleinsav amplifikációs módszereknek (DNAM) a mycobacteriológiában való alkalmazása a lassan tenyészthető M. tuberculosis és a bizonyos speciális tenyésztési feltételeket igénylő, ezért nehezen izolálható NTM-ok direkt (közvetlenül a klinikai mintából) történő detektálásának gyors, 24 órán belüli kivitelezésének lehetőségét teremtette meg. A módszer minden mintából történő rutinszerű alkalmazása szükségtelen. Mikroszkópos vizsgálattal pozitívnak bizonyuló mintából csak akkor javasolt a teszt elvégzése, ha olyan betegről van szó, akinél NTM kóroktani szerepe vetődik fel (pl. HIV fertőzött, transzplantált beteg, cisztikus fibrózis). A tesztek érzékenysége a mikroszkóposan pozitív légút i minták esetében közel 100 %. Mikroszkóposan negatív beteg esetében csak akkor végezzünk ilyen vizsgálatot, ha a tuberkulózis diagnózisának felállítása komoly differenciál diagnosztikai problémát jelent a rendelkezésre álló egyéb klinikai adatok tükrében. A tesztek érzékenysége ezen betegcsoport esetében függ az alkalmazott módszertől, mérvadó irodalmi adatok alapján 70-90 %. Az eredmények értékelése minding individuálisan történjék. Elengedhetetlen hogy a direkt nukleinsav amplifikációs vizsgálatra kerülő mintákból a mikroszkópos és tenyésztéses vizsgálatok is elvégzésre kerüljenek. A módszerek légúti vizsgálati anyagokra vannak validálva, érzékenységük extrapulmonális minták esetében alacsonyabb. Extrapulmonális kórképekben a módszer szenzitivitását jelentősen csökkenti a minta jellemzően alacsonyabb csíraszáma, és az amplifikációt gátló inhibítorok jelenléte, amelyek aránya szignifikánsan magasabb, mint a légúti anyagokban. A központi idegrendszer tuberkulózisa a humán gümőkór legveszélyesebb formája, ezért ebben a kórképben a gyors diagnózis felállítása kiemelkedően fontos. A publikált esetek alacsony száma és a módszerek elégtelen szenzitivitása miatt a meningitis basillaris diagnózisának gyors felállítására jelenleg nincs nemzetközileg ajánlott módszer. Az utóbbi időben megjelent metaanalizis megállapítása szerint a 5

DNAM technikák érzékenysége extrapulmonális esetekben a vizsgáló helyektől és módszerektől függően széles határok között (27-85 %) mozog. Meningitisben átlagosan 56 % körüli. A Pulmonológiai Szakmai Kollégium a módszerek indikációjára vonatkozó 2000-ben kiadott korábbi állasfoglalása továbbra is mérvadó. Ennek megfelelően a DNAM indikációi: Mikroszkóposan negatív, akut súlyos állapotú betegnél tuberkulózis gyanúja esetén (pl. lélegeztetést igénylő pneumónia) Bármilyen rendkívüli sürgősséget igénylő esetben (pl. nem tüdőbetegellátó intézmény ellátására szoruló beteg esetében) Mikroszkóposan pozitív immunszuprimáltaknál NTM fertőzés fokozottabb veszélye miatt Szervtranszplantált betegeknél Fertőzési veszély vélelmének kizárására fokozottan veszélyeztetettek védelmében (mikroszkópos negativitás mellett) A DNAM legfontosabb előnye, hogy 6-8 órán belül elvégezhetőek, ezért a klinikus részéről elvárható, hogy az eredmények még a mintafeldolgozás napján, de legkésőbb 24 órán belül visszajelzésre kerüljenek. Jelenleg többféle kereskedelmi teszt van forgalomban, (Amplicor PCR-Roche Molecular Systems, Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test AMTD-Gen-Probe Inc., BDProbeTec-Becton- Dickinson, GenoType Mycobacteria Direct-HAIN, Genotype MTBDRplus-HAIN), amelyek a minta előkezeléséből, nukleinsav izolálásából, amplifikációból és detektálásból állnak, és minden egyes kit lépésenként más-más módszert alkalmaz. Egyes tesztek csak a M. tuberculosis complexet detektálják, mások a M. tuberculosis complexet és az isonicid (INH) és a rifampicin (RMP) rezisztenciához társuló mutációkat is, és megint mások a M. tuberculosis complexen belüli specieseket, ill. a gyakori és klinikailag relevans nem tuberculosist okozó mycobacteriumokat (NTM) is képesek kimutatni. A módszerek szenzitivitása alapvetően a kenet pozitivitásának függvénye, de az alkalmazott tesztenként is változó. 2.4 Tenyésztés (1-6, 9, 11, 12) A mycobacteriológiai vizsgálatok következő lépése a dekontaminált minta tenyésztése, amely továbbra is nélkülözhetetlen a következő okok miatt: a tenyésztés érzékenysége nagyságrendekkel nagyobb, mint a mikroszkópos vizsgálatoké, a M. tuberculosis complexen belüli differenciáláshoz, a különböző NTM azonosításához, a molekuláris epidemiológiai vizsgálatok elvégzéséhez (DNS ujjlenyomat vizsgálat) megfelelő mennyiségű biomasszára van szükség, amelyet a tenyésztés biztosít, a rezisztencia vizsgálatok elvégzéséhez élő kórokozót ugyancsak a tenyésztés biztosít. A mycobacteriumok izolálására használt talán legismertebb táptalaj a tojás alapú, szilárd Löwenstein-Jensen (LJ) táptalaj. Az agar alapú táptalajok, mint amilyen a Middlebrook 7H10 vagy 7H11 agar, a LJ táptalajhoz képest a némileg gyorsabb tenyésztési idő, és a transzparenciájuk folytán megvalósitható egyszerűbb kolónia morfológia vizsgálat lehetősége miatt kedveltek. Mindazonáltal, ezeken a hagyományos szilárd táptalajokon a M. tuberculosis telepei általában 3-6 hét elteltével jelennek csak meg. Az izolálást követő identifikálás, majd rezisztencia meghatározás további 3-6 héttel növelheti ezt az amúgy is tetemes tenyésztési időt. Mindemellett vizsgálatok azt is igazolták, hogy csak szilárd táptalajon tenyésztve a klinikailag egyértelműen tuberkulózisként diagnosztizált betegek mintáit mintegy 20-30%-ban nem sikerült a M. tuberculosis izolálása. Ez az adat világosan jelzi, hogy a szilárd táptalajon való tenyésztés érzékenysége, bár lényegesen jobb, mint a mikroszkópos vizsgálaté, mégsem haladja meg a 70-80%-ot. A CDC és a WHO jelenlegi ajánlása az, hogy a TBC izolálása, identifikálása valamint az ezt követő rezisztencia vizsgálatok lehetőleg a mintavétel időpontjától számított 2-3 (izolálás, identifikálás) illetve 2-5 (rezisztencia meghatározás) héten belül történjenek meg. Ez az átfutási idő nélkülözhetetlen 6

ahhoz, hogy a klinikus a kezelés nyolcadik hetének végén el tudja dönteni, hogy az alkalmazott négyes kombinációból biztonsággal elhagyhatja-e a pyrazinamidot (PZA) és az ethambutolt (EMB). Ahhoz, hogy ez az ajánlás a gyakorlatban is megvalósítható legyen, nélkülözhetetlen az újabb, folyékony táptalaj alapú rendszerek rutinszerű alkalmazása. Folyékony táptalajon tenyésztve, a tenyésztési idő a minta mycobacterium tartalmától függően 1-3 hétre rövidíthető. Emellett a folyékony táptalajok szenzitivitása 90% feletti. Hátrányuk, hogy jóval hajlamosabbak a befertőződésre. 2.4/a Módszer érzékenysége Bár a folyékony táptalajok alkalmazása jelentősen csökkenteni képes a tenyésztési időt, szilárd táptalajra azért továbbra is szükség van, mivel bizonyos törzsek nem növekednek jól folyékony miliöben. A tenyésztés érzékenységét jelentősen befolyásolja a szilárd táptalaj ph értéke is. Felmérések azt jelzik, hogy a rutinszerűen alkalmazott ph 7-es LJ táptalaj nem felétlenül alkalmas minden Mycobacterium optimális tenyésztésére. Így olyan helyeken, ahol bizonyos NTM okozta megbetegedések gyakoribbak (pl. HIV fertőzöttek), vagy endémiásak szükség lehet egy savanyú ph érékű LJ-re vagy a ph 6 értékű Ogawa (Japánban elterjedt tojás alapú táptalaj) táptalajra való leoltásra is. A szilárd táptalaj további előnye, hogy a növekedés kvantitatív formában is visszajelenthető, a kolónia morfológia és a pigment termelés is vizsgálható, illetve kellő biomassza biztosítható az identifikálást segítő biokémiai tesztekhez. Önmagában tehát sem a szilárd, sem a folyékony táptalaj érzékenysége nem éri el a 100%-ot, azaz mindkét táptalajtípus esetében előfordulhatnak olyan törzsek, amelyek vagy csak az egyik vagy csak a másik táptalajtípuson képesek növekedni. Ez az oka, hogy jelenleg a nemzetközi ajánlásoknak megfelelően a mycobacteriumok izolálása szilárd és folyékony táptalaj kombinációján kell, hogy alapuljon a kórokozó minél gyorsabb és érzékenyebb detektálása, valamint a rezisztencia vizsgálatok minél gyorsabb elvégezhetősége érdekében. Amennyiben a beoltott szilárd vagy folyékony táptalajokon növekedés nem észlelhető, úgy negatív tenyésztési eredmény 8 illetve 6 hetes inkubálást követően adható ki. 2.4/b Minőségbiztosítás az előkezelési és tenyésztéses vizsgálatok ellenőrzéséhez Általános: Összes eszköz és berendezés szabályozott időközönkénti kontroll vizsgálatát el kell végezni, különös tekintettel a laminális boxokra és a centrifugákra Naponként: Reagensek lejárati idejének kontrollja: a NALC-ot mindig a munkafolyamat kezdetén kell a NaOH-hoz adni, NALC-NaOH oldatot 24 órán túl nem szabad felhasználni Monitorozni kell a szennyezett minták százalékos előfordulását: ha 10 előkezelt mintát véres táptalajra inokulálunk, 24-48 óra múlva szennyező baktérium nem ill. minimális mennyiségben tenyészhet csak ki. Ha ismételten azonos szennyező baktérium tenyészik ki, ellenőrizni kell az összes felhasznált reagens sterilitását. A dekontaminálás kezdetén és végén 1-1-cső (5 ml) steril desztillált víz ill, fiziológiás só oldattal is el kell végezni a munkafolyamatot. Az előkezeléshez használt reagenseket a munkafolyamat előtt véres agárra kell oltani. Ellenőrizni kell a táptalajok és reagensek lejárati idejét. Minden új, házilagosan gyártott táptalaj charge minőségi vizsgálatát M. fortuitum (ATCC 6841), egy gyorsan növő NTM-el ajánlott elvégezni. A kereskedelmi forgalomban kapható, minőségbiztosítási bizonylattal ellátott táptalajokat nem szükséges ellenőrizni, de a felhasznált táptalajok gyártási számát fel kell jegyezni. Hetente: 7

Havonta: Meg kell határozni a szennyezett tenyészetek százalékos előfordulását. Szilárd táptalaj esetén az >5 %, folyékony táptalaj esetén a >8-10 % kontamináció inadekvát előkezelési munkafolyamatra utal. A <3 % szennyeződés túl erős dekontaminációt jelez. Monitorozni kell a M. tuberculosis pozitiv tenyészetek számát. Monitorozni kell a kenetben pozitív és tenyésztéssel negatív minták számát. Ha az ilyen minták száma meghaladja az 1 %-t, ez túl erős előkezelésre, megfelelő minőségű táptalajokra, különleges igényű mycobacteriumokra, vagy antituberculotikum kezelés alatt álló beteg mintájára utal. Monitorozni kell a kenet negatív, tenyésztéssel pozitív minták számát. Az elvárhatóság kb. 30%. Monitorozni kell a kenet negatív és mindössze egy pozitív tenyészettel rendelkező betegek számát. Monitorozni kell a kenetben és tenyésztéssel is pozitív esetek arányát. Az elvárt mérték 95 %. Monitorozni kell a tenyészetek pozitivvá válásának idejét külön a szilárd és folyékony táptalajok esetében mind kenet pozitív, mind a kenet negatív mintáknál A fenti értékektől való szignifikáns eltérés nem megfelelő előkezelési eljárásra, vagy fals pozitív tenyészetek előfordulására utal. Fals pozitív tenyészetek előfordulása kenet pozitív mintákkal történő kontamináció következtében: A mycobacteriológiai laboratóriumokban az előkezelési és tenyésztéses eljárások során a vizsgálati anyag keresztfertőzése következtében fals pozitívvá válhat.. A fals pozitív tenyészetek elfogadható aránya kb. 3 %. A keresztfertőzés létre jöhet az előkezelőszer adagolása, vagy a semlegesítés során az aerosol képződés miatt, esetleg a reagens csövek, vagy oldatok kontaminálódhatnak saválló baktériummal. Ez utóbbiak könnyen szennyeződhetnek a vízben gyakran előforduló atypusos mycobakteriumokkal (M. gordonae, M. xenopi), ha a felhasznált víz nem volt steril. A vizsgálati anyagok átfertőződésének esélyét csökkenti, ha a laminális boxban kisebb mennyiségű reagenst használunk, a manipulációk során alkalmanként csak egy minta csöve van nyitva, és a centrifuga csövek zárókupakját lassan nyitjuk ki az aerosol képződés csökkentése érdekében. 2.5 Identifikálás (1-3, 6, 11, 12) 2.5.1 Identifikálás hagyományos módszerrel A különböző Mycobacterium fajok egymástól való elkülőnitésének, identifikálásának hagyományos útját a különböző hőmérsékleti szinteken mutatott növekedési sajátságok, a telepmorfológia és pigment termelés vizsgálata, valamint különböző enzimaktivitás vagy növekedésgátlás kimutatását célzó biokémiai reakciók elvégzése jelenti. Ezeknek a hagyományos identifikálási teszteknek a legnagyobb hátránya, hogy elvégzésük jelentős mennyiségű biomasszát igényel, amely szubkulturákra való átoltással és a primér izolálást követően még további több hetes tenyésztéssel és időveszteséggel jár. Emellett a vizsgálatok elvégzése munkaigényes, az eredmények értékelése sok esetben szubjektív. Az utóbbi évek során nagy számban írtak le olyan új NTM törzseket, amelyek identifikálása a hagyományos módszerek segítségével egyáltalán nem lehetséges, ezeket a fajokat csak az új molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával lehet felismerni. Mindezen okok miatt a hagyományos identifikálási módszerek szerepe világszerte igen jelentősen visszaszorulóban van. A M. tuberculosis complex identifikálására és az ehhez szükséges alapvető hagyományos identifikálási módszerek elvégzésére (niacin, nitrát reduktáz teszt) minden mycobacteriológiai laboratóriumnak képesnek kell lennie. Az átfutási idő mérséklésére azonban hazai viszonylatban is meg kell teremteni a molekuláris vagy egyéb 8

gyors identifikálási módszerekhez való hozzáférés lehetőségét legalább a magasabb kompetenciájú, regionális laboratóriumok számára. 2.5.2 Identifikálás molekuláris biológiai és egyéb technikákon alapuló módszerekkel A kereskedelmi forgalomban napjainkban többféle identifikáló teszt kapható, amelyek különböző géntechnikai, kromatográfiás, vagy tömegspektrografiás módszert alkalmaznak a mycobacterium speciesek azonosítására. 2.5.2.1. Nukleinsav hibridizációs módszer: A kereskedelmi forgalomban hozzáférhető AccuProbe (Gen-Probe Inc., San-Diego, CA) nukleinsav hibridizációs teszt bevezetése jelentősen meggyorsította a M. tuberculosis complex, a M. avium complex, a M. gordonae, és a M. kansasii identifikálását. Mivel a teszt nem alkalmaz amplifikációs lépést így közvetlenül a klinikai mintából való kórokozó kimutatásra alkalmatlan, pozitivitásához legalább 10 5 számú baktérium jelenléte szükséges. A teszt azonban kiválóan alkalmas a pozitív folyékony vagy szilárd tenyészetek esetében (ahol a teszt érzékenységéhez szükséges baktérium mennyiség többszöröse rendelkezésre áll) a kitenyészett saválló baktérium identifikálására 1-2 órán belül. 2.5.2.2. Reverz hibridizáción alapuló identifikáló tesztek: A tesztek során egy speciális DNS szakaszt sokszorozzuk PCR segítségével, majd a DNS terméket egy tesztcsíkon elhelyezett, az egyes mycobacteriumokra specifikus próbákkal hibridizáltatjuk. Ez a rendszer a GenoType MTB-HAIN módszer esetében a M. tuberculosis complex-en kívül az összes jelenleg ismert klinikailag szignifikáns NTM kimutatására is alkalmas. Az InnoLipa (Innogenetics) módszerrel a M. tuberculosis complex, a M. avium, a M. intracellulare, a M. kansasii, a M. xenopi, a M. gordonae, a M. scrofulaceum, és M. chelonae azonosítható. 2.5.2.3. DNS szekvenálás: A DNS szekvenálás a mycobacteriumok identifikálásának jelenleg a legpontosabb módszere. Az egyes törzsek azonosításán kívül információval szolgál az egyes fajok filogenetikájáról és rokonsági fokáról is. A DNS szekvenálás során egyes gének olyan fajspecifikus szakaszainak bázissorrendjét határozzák meg, amelyet azután már ismert és jól karakterizált törzsek bázissorendjével vetnek össze. A referencia bázissorend adatbázis összeállítása történhet házilagosan, de kereskedelmi forgalomban árult adatbázisok is rendelkezésre állnak. A rutinalkalmazásban mintegy referencia módszerként legelterjedtebb DNS szekvenálás a 16S rrns hypervariábilis régiójának vizsgálatán alapszik. Automata DNS szekvenáló műszer segítségével a vizsgálat 1-3 nap alatt elvégezhető. A DNS szekvenálás lehetővé tette olyan NTM fajok felfedezését is, amelyek nem vagy nagyon nehezen tenyészthetőek, potenciálisan patogének, vagy egyenlőre még nem kellően karakterizáltak, nem minden szempontból ismertek (patogenitás, rezervoár, transzmisszió stb.). A módszer alkalmazása referencia laboratóriumban indokolt. 2.5.2.4. Magas hatékonyságú folyadék kromatográfia (high-performance liquid chromatography; HPLC): A Mycobacterium sejtfala fajonként változó és specifikus mycolsav összetételének gyors és pontos vizsgálati lehetőségét kínálja a HPLC, amellyel számos ismert, sőt új, korábban még azonosítatlan Mycobacterium faj identifikálása lehetséges. A HPLC berendezés megléte esetén a mérés olcsó és gyors, 2 órán belül elvégezhető. A módszer hátránya, hogy a szükséges műszer költséges és az eredmények értékelése gyakorlatot, nagy tapasztalatot igényel. A módszer alkalmazása referencia laboratóriumban indokolt.. 2.5.2.5. A tömegspektrometriás módszer egy olyan új, modern technika, amellyel a lézerrel ionizált sejt komponensek tömegét mérik, az eredményt egy detektoron regisztrálják, így megkapják az egyes 9

speciesekre jellemző spektrum profilt. Egy software segítségével a spektrum profil alapján a törzs beazonosítható. A módszer alkalmazása referencia laboratóriumban indokolt. 2.5.2.6. A Capilia TB Test (Tauns, Numazu, Japan Nippon Becton-Dickinson Tokio: Az egyszerű és gyorsan elvégezhető, immunokromatografiás assay a M. tuberculosis complex-t különíti el a NTM törzsektől. A módszer a M. tuberculosis törzsekre specifikus MPB64 protein és a gén által termelt monoklonális antitestek reakcióján alapszik. Pozitív reakció esetén a cellulóz membránhoz kötött anti-mpb64 monoklonális antitestek reakcióba lépnek a MPB64 proteinnel, és 15 percen belül egy piros gyűrű válik láthatóvá. A módszer specificitása a vizsgálatok szerint 100 %, és a szenzitivitása is 90 % feletti. 2.6 A M. tuberculosis és az NTM genotipizálása, molekuláris epidemiológiai vizsgáló módszerek (2,6) Az utóbbi években a DNS ujjlenyomat vizsgálat, a PCR alapú spoligotyping és VNTR-MIRU, (Variable Numbers of Tandem Repeats of Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) valamint a tömeg spektrometriás módszerek segítségével lehetségessé vált a M. tuberculosis nagy pontosságú tipizálása. A spoligotyping és VNTR-MIRU technikák a PCR-el amplifikált DNS-t detektálják. A spologotipizálás dot blot módszerrel mutatja ki a speciális DR locuson a spacer szekvenciák jelenlétét, vagy hiányát, a VNTR- MIRU a különböző számban ismétlődő mycobacteriális repetitív egységeket detektálja azok mérete alapján. Ezekkel a módszerekkel az izolátumok un. clusterekbe sorolhatók, és a clonális tipizálásra kiválóan alkalmasak. A tömeg spektrometriás módszerrel a lézerrel ionizált sejt fehérje komponensek tömegét mérik, egy detektoron regisztrálják, így megkapják a mycobacterium spektrum profilját, azaz a specifikus ujjlenyomatát. Jelenleg a molekuláris epidemiológia arany standard módszere a DNS ujjlenyomat Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) vizsgálat. Az enzímemésztés során nyert fragmentumok molekuláris mérete oly módon variálódik, hogy két nem rokon M. tuberculosis törzs egymástól eltérő mintázatot mutat a jelölt IS6110 próbával való hibridizációt követően. A DNS ujjlenyomat vizsgálatot sikeresen alkalmazzák különböző járványok vizsgálatára, a tuberkulózis aktív transzmissziójat befolyásoló rizikó tényezők vizsgálatára (pl. antituberkulotikum rezisztencia), a konvencionális módszerekkel azonosíthatatlan kontaktok kiszűrésére és ezáltal a fertőzési lánc felderítésére, különböző veszélyeztetett szubpopulációkon belül a tuberkulózis transzmisszójának vizsgálatára, és a laboratóriumi keresztfertőzések okozta téves diagnózisok kiszűrésére. Az ezekben a helyzetekben szükséges prevenciós lépések meghatározásához és megtételéhez hazánkban is szükséges a molekuláris epidemiológiai vizsgálatok bevezetése legalább a referencia laboratóriumban. 2.7 Rezisztencia meghatározás (1-3, 8,9, 11, 12) 2.7.1. Alapfogalmak Az eddigi genetikai vizsgálatok szerint a M. tuberculosis antituberkulotikumokkal szembeni rezisztenciájának megjelenéséért vagy a gyógyszer támadáspontját kódoló génekben, vagy a gyógyszer aktiválásáért felelős enzimeket kódoló génekben kialakuló spontán pontmutációk a felelősek. A rezisztenciával kapcsolatos pontmutációk, deléciók és inzerciók az összes első vonalbeli szernél (isonicid {INH}, rifampicin {RMP}, pyrazinamid {PZA}, ethambutol {EMB} és már néhány másodvonalbeli újabb szernél (streptomycin, ethionamid, fluorokinolonok, makrolidek,) is felismerésre kerültek. Mindezek alapján nagy valószínűséggel kizárható egy olyan egyedüli gén jelenléte, amelynek mutációi önmagukban vezetnének a polirezisztens (rezisztencia RMP mellett több más antituberculotikummal szemben) illetve a multidrug rezisztens (MDR) (rezisztencia legalább INH-val és RMP-el szemben; MDR) fenotípus kialakulásához. Az extensively-drug rezisztens (XDR) Mycobacterium törzsek (rezisztencia RMP és INH mellett fluoroquinolonokra, és iv. adagolható kanamycin, capreomycin és amikacin-ra) megjelenése és terjedése tovább erősíti azt az igényt, hogy a rezisztencia vizsgálat minden először izolált törzs esetében megtörténjen. Úgy tűnik, hogy a MDR és 10

XDR több, egymással párhuzamosan, illetve lépcsőzetesen kialakuló mutációk sorozatának az eredménye a különböző génszakaszokon. Rezisztencia leggyakrabban a nem megfelelő gyógyszeres kombináció és dózis, a beteg nem megfelelő compliance következtében, az egyébként természetes körülmények között is mindig előforduló, de csak igen kis kópiaszámban jelenlévő mutáns törzsek szelektálódásával alakul ki. A Nemzeti Tuberkulózis Program szabályozásának megfelelően minden újonnan felismerésre került, tuberkulózisban szenvedő beteg elsőként izolált tenyészeteiből kötelezően rezisztencia vizsgálatokat kell végezni (kezdeti rezisztencia vizsgálat). Ellenőrző rezisztencia vizsgálatok végzése akkor szükséges, ha a beteg kontroll tenyésztései a kezelés negyedik hónapja után is pozitivitást mutatnak, illetve ha radiológiai romlás vagy reaktiváció jelei észlelhetők. Rezisztens Mycobacterium okozta infekció veszélye merül fel akkor, ha a beteg ismert rezisztens M. tuberculosis okozta infekcióban szenvedő beteg kontaktja, a beteg korábban már antituberkulotikus kezelést kapott, a beteg az alkalmazott antituberkulotikus kezelés ellenére progressziót mutat (tenyésztései a három hónapos kezelés után is pozitívak), a beteg olyan országból származik, ahol a rezisztens Mycobacterium okozta infekció gyakorisága magas. 2.7.2 Szilárd és folyékony alapú rezisztencia vizsgálat, a vizsgálat átfutási ideje 2.7.2.1 A szilárd táptalajon (proportios módszer) végzett rezisztencia-meghatározás bár pontos, de meglehetősen idő (az izolálást követő további 3-5 hetes tenyésztés) és munkaigényes. A vizsgálat biomassza igénye miatt szükség van az identifikált kórokozó LJ vagy egyéb szubkultúrán történő felszaporítására, vagy ha a M. tuberculosis NTM-al együtt ú.n. kevert tenyészet formájában került izolálásra, akkor a tenyészetnek az álrezisztenciához vezető NTM-tól való megtisztítására, ami újabb több hetes időveszteséget okozhat. 2.7.2.2. Folyékony alapú rezisztencia vizsgálatok A Bactec MGIT, a radiometriás Bactec 460 TB, vagy a Bact/Alert rendszer segítségével az öt elsővonalbeli antituberkulotikumon kívül a másodrendű szerek többségével szembeni rezisztencia vizsgálatok kb. 4-6 nap alatt elvégezhetők, és a klinikus számára visszajelezhetők. Mind az antituberculoticum-érzékeny, mind a rezisztens kórokozót hordozó betegek esetében az adekvát kezelés folytatásához, a beteg compliance-nak megtartásához és javításához kívánatos, hogy a rezisztencia vizsgálatok eredményei mihamarabb, de a mintavételtől számított legkésőbb 8 héten belül rendelkezésre álljanak. Ehhez a kórokozó izolálásához, identifikáláshoz és a rezisztencia vizsgálatokhoz alkalmazott gyorsabb átfutási időt biztosító újabb módszerek hazai rutinszerű bevezetése szükséges. 2.7.2.2./a Külső minőségi kontroll A rezisztencia vizsgálatok megbízhatósága kiemelten fontos, ezért elengedhetetlen, hogy minden rezisztens izolátum kontroll vizsgálata megtörténjen és a vizsgálat eredménye a Referencia Laboratóriumban megerősítésre kerüljön. Különösen fontos a MDR törzsek rezisztenciájának minőségi kontrollja. Az MDR törzsek ellenőrző vizsgálata mellett a Referencia Laboratórium automatikusan elvégzi a másodvonalbeli szerekkel szembeni rezisztencia meghatározást is, ezért ezen törzseknek a Referencia Laboratóriumba történő továbbítása kötelező. 2.7.3. Rezisztencia meghatározás géntechnikai módszerrel (13) A rifampicin (RMP) kulcsfontossággal bír a tuberkulózis kezelésében és a gyógyszerrel szembeni rezisztencia mihamarabbi felismerése vitális a beteg számára. Mindemellett a RMP monorezisztencia ritka, a RMP rezisztencia leggyakrabban polirezisztencia vagy az INH rezisztenciához társulva MDR formájában jelentkezik. Így a RMP rezisztencia gyors kimutatása nemcsak a kezelés optimalizálása szempontjából, hanem a legveszélyeztetettebb MDR törzs okozta megbetegedésben szenvedő betegek 11

gyors azonosítása szempontjából is fontos. A RMP rezisztenciát okozó mutációknak a kimutatása néhány órán belül elvégezhető az rpob gén specális szakaszának DNS szekvenálásával, vagy a PCR és reverz hibridizáción alapuló (GenoType HAIN és Inno-LiPA Rif TB Innogenetics) line probe assay-k segítségével. Az újabb kereskedelmi forgalomban kapható tesztek a rifampicin rpob génjének és az isonicid (INH) katg és inha génjének mutációját szimultán is képesek kimutatni az izolált törzsből (GenoType MTBDR HAIN) és közvetlenül a mikroszkópos vizsgálattal saválló pozitívnak bizonyult beteg mintájából is (GenoType MTBDRplus HAIN). A MDR tuberculosis fenyegető mértékű globális terjedése miatt, a gyors rezisztencia eredményekhez való hozzájutás érdekében a WHO új diagnosztikai algoritmus bevezetését javasolja elsősorban a mikroszkópos vizsgálattal saválló pozitív betegek esetében. A WHO állásfoglalása szerint: A line probe assay-k alkalmasságát a mikroszkóposan pozitív esetek RMP, ill. INH + RMP rezisztencia detektálására megfelelő számú evidencián alapuló vizsgálattal bizonyították A módszerek bevezetését a referencia laboratóriumokban ill. a technikailag jól felszerelt és képzett munkaerővel rendelkező mikrobiológiai laboratóriumokban ajánlják Ha a line probe assay érzékeny törzset detektál, az érzékeny M. tuberculosis okozta infekció diagnózisa elfogadható, és a kezelés az elsőrendű szerekkel azonnal megkezdhető Ha a line probe assay rezisztens törzset detektál, további tenyésztés, majd a kitenyészett törzsből az első és másodrendű szerek iránti rezisztencia vizsgálat is azonnal elvégzendő A szükséges közegészségügyi intézkedések késedelem nélkül beindíthatók A M. tuberculosis-al szemben a NTM esetében,- egyes kivételektől eltekintve (M. avium, M. kansasii, gyorsan növő NTM-k)- a rutinszerű rezisztencia meghatározás a megfelelően standardizált módszerek hiányában nem javasolt. Az 1. ábra a mycobacteriumok okozta infekciók egyszerűsített diagnosztikus sémáját, algoritmusát mutatja. 2.8. Látens-és aktív tuberculosis fertőzés kimutatása immunológiai módszerekkel A kereskedelmi forgalomban levő technikák (T-SPOT-TB és Quantiferon-TB Gold) olyan gyors vértesztek, amelyek a M. tuberculosis specifikus antigénjei által aktivált immunsejtek (T sejtek) fokozott jelenlétét, ill. a sejtek által termelt γ interferon kimutatását teszik lehetővé. A te sztek a Mantoux próbát helyettesítik, de annál határozottan specifikusabb módszerek, fajlagosságukat a BCG vaccináció, és az atypusos mycobacteriumok (NTM) okozta infekciók többsége nem befolyásolja. Immunszuprimált betegeken a módszer érzékenysége még nem kellően bizonyított. III. A diagnosztikus vizsgálatok megfelelőségének indikátorai Direkt mikroszkópos, tenyésztéses és genetikai vizsgálatok eredményinek összevetése (szenzitivitás, specificitás, pozitív és negatív prediktív érték) A bakteriológiailag igazolt esetek aránya a regisztrált esetekhez viszonyítva. Tenyésztéssel pozitív esetekben a rezisztencia vizsgálatok aránya. IV. A protokoll bevezetésének feltételei A tárgyi és személyi feltételeket a kompetencia szinteknek megfelelően a 15/2004 ESZCSM rendelet tartalmazza. 1.Tárgyi feltételek 12

A Mycobacterium diagnosztika az ország egész területén elérhető, jelenleg összesen 10 TBC Tenyésztő Laboratórium és a Nemzeti Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium müködik. A TBC tenyésztő laboratóriumok alkalmasak direkt mikroszkópos, tenyésztéses vizsgálatok végzésére és legalább a M. tuberculosis identifikálására, egyes laboratóriumok rezisztencia vizsgálatokat is végeznek. Egyes III. kompetencia szintű mikrobiológiai laboratóriumok néhány molekuláris genetikai vizsgálat végzésére is alkalmasak. A Referencia Laboratóriumban történik a rezisztens törzsek kontroll vizsgálata, az atypusos Mycobacterium (NTM) törzsek identifikálása, egyes esetekben rezisztencia vizsgálata, és a molekuláris technikák alkalmazása. (direkt kimutatás, species identifikálás, rezisztencia gének detektálása, tipizálás epidemiológiai érdekből) 2. Személyi feltételek A kompetencia szinteknek megfelelő személyi feltételek: a 15/2004 ESZCSM rendelet szerinti megfelelő számú diplomás és egészségügyi szakdolgozó 3. Szakmai képzési feltételek A jelen protokoll oktatása a szakorvosképzés, egyéb diplomásképzés és továbbképzés keretében történik V. Irodalomjegyzék 1. Kent, P. T., and G. P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology. A guide for a level III laboratory. Center for Disease Control, Atlanta, GA. 2. Dunlap, N. E., J. Bass, P. Fujiwara, P. Hopewell, J. Horsburgh, C.R., M. Salfinger, and P. M. Simone. 2000. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. This official statement of the American Thoracic Society and the Centers for Disease Control and Prevention was adopted by the ATS Board of Directors, July 1999. This statement was endorsed by the Council of the Infectious Disease Society of America, September 1999. Am. J. Respir. Crit Care Med. 161:1376-1395. 3. Metchock, B. G., F. S. Nolte, and J. Wallace, R.J. 1999. Mycobacterium, p. 399-437. In P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4. Szabó, N., Lipót Z., Vámos M., Nagy J. 2003. A mycobactériumok tenyésztésének hatásfoka különböző előkezelési eljárások és tenyésztési módszerek függvényében. Medicina Thoracalis 56: 188-192. 5. Somoskovi, A., C. Kodmon, A. Lantos, Z. Bartfai, L. Tamasi, J. Fuzy, and P. Magyar. 2000. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB system, and Lowenstein-Jensen medium. J. Clin. Microbiol. 38:2395-2397. 6. Somoskovi, A., J. Mester, Y. M. Hale, L. M. Parsons, and M. Salfinger. 2002. Laboratory diagnosis of nontuberculous mycobacteria. Clin. Chest Med. 23:585-597. 7. 2000. Update: Nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep. 49:593-594. 8. Mester, J., Vadász I., Bártfai Z., Ködmön CS., Somoskövi Á.. 2002. A Mycobacterium tuberculosis antituberkulotikum-rezisztenciájának molekuláris alapjai. Medicina Thoracalis 55:30-36. 9. Fodor T., Lőrinczi I., Szikra L. A Mycobacterium tuberculosis és egyéb típusos mycobacterium fertőzések bakteriológiai vizsgálatának módszerei. 555-557. old. In: Czirók É. (szerk.): Klinkai és járványügyi bakteriológia kézikönyv. Melánia, Budapest 1999. 10. National plan for reliable tuberculosis laboratory services using a systems approach. Morb. Mortal. Wkly.Rep. 54: No: RR-6. 2005. 11. Drobniewski F.A., Hoffner S., Rüsch_Gerdes S., Skenders G., Thomsen V. and the WHO European Laboratory Strengthening Task Force. Recommended standards for modern 13

tuberculosis laboratory sevices in Europa. Eur.Respir J. 28. 903-909. 2006. 12. Somoskövi Á., Szabó N., Nagy E.: A tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikájának irányelvei A Tüdőgyógyászati Szakmai Kollégium és az Orvosi Mikrobiológiai Kollégium közös állásfoglalása. Med. Thor. 57. 116-137. 2004. 13. World Health Organization: Molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) policy statement 27 June 2008. 14. Pai M., L.L Flores, Pai N., Hubbard A., Riley L.W., Colford J.M. Jr. 2003 Diagnostic accuracy of nucleic acid amplification tests for tuberculosis meningitis: a systematic review and metaanalysis. Lancet Infect.Dis 3: 633-643. 15. Rock R.B., Olin M., Baker C.A., Molitor T.W., Peterson P.K. 2008. Central nervous system tuberculosis: Pathogenesis and clinical aspects. Clin.Microbiol.Review 21: 243-261. VI. Melléklet 1. A protokoll fejlesztés módszerei: 1.1. A nemzetközi szervezetek (WHO, IUATLD, CDC, ECDC) és tekintélyes külföldi un. supranacionális laboratóriumok és társaságok (CLSI) által kiadott irányelvek alapján, azokat az irodalmi hivatkozásokat vettük figyelembe, amelyek megfelelnek a fenti irányelveknek. 1.2. A felhasznált nemzetközi irányelveket a hazai nemzeti tuberculosis programban foglaltaknak megfelelően adaptáltuk. 1.3. A mycobacteriumok okozta infekciók egyszerüsitett diagnosztikus sémáját az 1-ábra mutatja 1.4. Az protokollban használt röviditések: WHO = World Health Organisation IUATLD = International Union against Tuberculosis and Lung Disease CDC = Center for Disease Control and Prevention EuroTB = Európai Tuberculosis Surveillance Központ ECDC = European Centre for Diseases Control and Prevention NTM = Non Tuberculous Mycobacterium DNAM = Direkt Nukleinsav Amplifikációs Módszerek CLSI = Clinical and Laboratory Standards Institute FDA = Food and Drug Administration VNTR-MIRU = Variable Numbers of Tandem Repeats of Mycobacterial Interspersed Repetitive Units INH = Isonicid RMP = Rifampicin ETB = Ethambutol PZA = Pyrazinamid MDR = Multi-Drug Rezisztens Tuberculosis (Rezisztens INH + RMP) XDR = Extensively-Drug Rezisztens Tuberculosis (Rezisztens INH+RMP+Fluoroquinolon+iv adható szerek egyike: amikacin, kanamycin, capreomycin A szakmai protokollt összeállította: Szabó Nóra, Somoskövi Ákos, Nagy Erzsébet A szakmai protokoll érvényessége: 2011 december 31. 14