és álhyperprolactinaemia

Átírás

1 Valódi és álhyperprolactinaemia Toldy Erzsébet Vas Megye és s Szombathely MJV Markusovszky KórhK rháza Központi Laboratórium, rium, PTE ETK DMI Gyakorlati Diagnosztikai Tanszék, Szombathelyi KépzK pzési KözpontK Endokrin betegségek gek laboratóriumi riumi diagnosztikája kötelezk telezı,, szinten tartó továbbk bbképzés, Rendezı: : PTE, OTK, LMI Pécs, P október Szervezık: Prof. Dr. Kovács L. G., Prof. Dr. Ludány Andrea

2 A prolactin (PRL) identifikálása 1933; Riddle O., Bate R. & Dyshorn S.: The preparation, identification and assay of prolactin- a hormone of the anterior pituitary. American Journal of Physiology, 105, ; Hwang P., Guyda H. & Friesen H.: Purification of human prolactin. Journal of Biological Chemistry, 247,

3 A prolactin frakciók k :hypophysaer: forma I. 199 aminosav három diszulfid-híd a monomer forma : free PRL -bioaktivitása a legnagyobb Prehormon: 26 KDa proteolysis -a keringésben ez a domináns: 85% 23 KDa S S S postranslatiós Glycosilatio (25%), phosphorilatio További 14, 16, 22 Kda-os proteolizált formák a keringésben

4 A prolactin cirkuláló formái Molekulatömeg (kd) Rogol, Suh, Von Werder, Guyda, Kiefer, Fang, Gamier: 50 0 Little free, monomer Biológiai aktivitás big Inaktív > 150 big-big, Macro-PRL

5 Arányeltol nyeltolódás s a prolactin frakciókban kban 1974; Rogol A.D & Rosen : Elsıként jelenti, hogy a keringésben domináló PRL forma a big PRL néhány hyperprolactinaemiás betegénél. J.of Clin. Endocrinol.and Metab ; Whittaker : Elsıként számol be arról, hogy relevans hyperprolactinaemiában, amikor a bbprl volt domináns, betege a terhességet komplikáció mentesen viselte. 1982; Andersen et al: bbprl: in vivo bioinaktív, in vitro bioaktív 1985; Jackson et al: Elıször használja a macroprolactin fogalmát. J. of Clin.Endocrinol.and Metab. 61. A felismerés >20 éves; Endokrin kézikönyv: 2001-csak említi

6 A cirkuláló PRL molekulaformák aránya megváltozik SZINONIMÁK Ábra a Kempinski elıadásból >150 Kda Immunreaktív- Pseudo- hyperprolactinaemia Macroprolactinaemia: Biokémiai- Átlag populáció, t-yperprolactinaemia PRL frakciók %-os aránya little big big-big

7 Analitikai probléma ma: a rutinban alkalmazott immunoassay módszerek eltérı foka Monomer PRL szint: 270 mu/l Roche Elecsys 1.gen Abbott Imx ABBOTT AxSYM J & J Amerlite Bayer Immuno-1 Wallac DELFIA DPC Immulite and 2000 Roche Enzymun és Elecsys2.g J & J Vitros ECI Roche Cobas Core Bayer (Chiron Centaur, ACS:180) Beckman Access Fahie-Wilson Clin. Chem PRL mu/l

8 Macroprolactinaemia prevalenciája Normál populációban - Nık: ~2,00 % - Férfiak: ~0,02 % (Ichihara 1990 (Japán), Bjoro 1995 (Skandinávia)) Hyperprolactinaemiában (reproduktív korú nık: 3%, sec. am. 15%) % (Fahie-Wilson, Leslie, Bjoro, Smith, Strachan ) % (Viera 1998, Hauche 2002)- válogatott minták. Terhességben: 3-8 % (Pascoe-Lira, 2001) Gyermek és pubertás korban: kevés adat

9 Intraindividuális variáci ciók, genetikus faktorok 42 macroprolactinaemiás beteg nyomonkövetése 2-7 évig: intraindividuális variáció rendkívül széles (Vallette-Kasic et al 2002) A macroprolactinaemiások elsıfokú rokonai között : 10% -os gyakorisággal találtak nagyon magas bbprl szintet- az eredményük egy valós, de gyenge családi társulást igazol. (Leite et al 1992)

10 Hazai adat: macroprolactinaemia gyakorisága ga hyperprolactinaemiás (>700 mu/l) szérum 77-79% Macroprolactinaemia recovery: <40% 21-23% n=215 Tényleges Hyperprolactinaemia recovery: >60% (Toldy, Lıcsei, L Góth,, Szabolcs, Kovács GL. 2005)

11 Macroprolactinaemia és s az életkor N=720 >45 év (n=105) 37%* év (n=215) év (n=400) 14% 23%* * p <0,001 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% A macroprolactinaemia gyakorisága ga (Toldy, Lıcsei, L Góth,, Szabolcs, Kovács GL. 2005)

12 Összefüggés a macroprolactinaemia gyakorisága és a szérum összes PRL szintje között N=215 Gyakoriság (%) Soong et al 1982: Hasonló megállapítást tett kiegészítve azzal, ezekben az esetekben a bromocriptin hatástalan, viszont a mellékhatás kifejezettebb >5000 Szérum összes PRL szintek mu/l Toldy, Lıcsei, Góth, Szabolcs, Kovács, 2004: Orv.Hetilap., 2005: Endocrine

13 A macroprolactin szerkezete 1.) PRL-IgG komplexek - macroprolactin molekula-igg KDa - gyakori forma: 24-86% 2.) Monomer PRL -aggregátumok - nem tartalmaznak IgG-t - ritkák: >170 KDa, - de lehet KDa glycosilált forma? - a proteint kódoló gén DNS szekvenciáján nem találtak mutációt! (Carlson 1992, Hattori 1996.)

14 Az IgG tartalmú macroprolactin szerkezete IgG S S S S S S S S S S S S IgG IgG IgG IgG IgG IgG Localisatiója: -intravascularis, -CSF-ben nincs Clearence: -csökkent

15 Prolactin-autoantitest I. Izotípusa: fıként IgG, de leírtak már IgM, IgA-izoformát is Szubtípusa: - heterogének, de pár estben csak IgG4-et igazoltak krónikus Ag stimulusra utal. komplexben foglalt monomer PRL : - serin -phosphorilált, és -dephosphorilált izoformák, - az acidikus isoform (dihidrogén phosphatot köt meg): krónikus antigen stimulusa kifejezettebb. (Hattori et al 2005.).

16 Prolactin-autoantitest II. Nagyon alacsony affinitású: Ka= 3,2 ±4,2* 106 L/mol Nagy kapacítású: - in vivo kevésbé disszociál, - in vitro az assay-ben használt Ab affinitása sokkal nagyobb a PRL auto-antitestnél!!! Eltérı antitesteket használó módszerek, eltérıen mérik a bbprl-t

17 Prolactin-autoantitest III. Hattori munkacsoportja korábbi ( ) közleményeikben leírják: - a PRL autoantitest assay függıen okoz pseudohyperprolactinaemiát, - ezt I-125-el jelölt PRL felvétellel igazolták. - Ugyanakkor hangsúlyozzák: nem minden esetben igaz az a hypothesis, hogy a bbprl zömét a PRL- Ab komplex teszi ki!

18 PRL és autoimmunitás A PRL nem csak a hypophysisben, extrahypophyseálisan is pl. placenta) és az immunsejtekben is termelıdik. Endokrin/parakrin PRL stimulálja az immunsejteket (Th1 és Th2) azáltal, hogy a PRL-receptoraikhoz kötıdnek. Az autoimmun betegségekhez gyakran magas PRL szint társul. De Bellis A et al: Prolactin and autoimmunity.pituitary, 2005, 8: 25-30)

19 SLE-ben : Autoimmun betegségek gek- macroprolactinaemia összefüggései -emelkedett PRL szintek és ezzel együtt különbözı autoantitestek (PRL-, Tg-, TPO-, RF-Ab) emelkedett szintjei mérhetık (Kramer C et al ) - SLE aktivitása és a PRL-Ab jelenléte között inverz korrelációt találtak (Garcia M et al Lupus, 2004: 13;) -Terhes SLE-ésben a terhesség kimenetelére nézve prognostikus marker a bbprl (Leandos- Miranda et al Lupus, 2007, 16.) RA-ban (Ram S. et al.2004): : összes PRL oka szabad-prl nem a bbprl! Magasabb PRL szintőeknek nagyobb a steroid dosis igényük (Rovensky et al. Clin. Endocrinol. 2009: 70). Immundeficiencia (Ram S. et al.2004): -HIV+ és HIV- csoport összes PRL szintje között nincs különbség, viszont a pozitív esetek szabad PRL szintje alacsonyabb bbprl

20 [Prolactin-autoantitest]-komplex A komplexet összetartó erık: - nem kovalens kötés (Hattori et al , Carlson et al 1992) Különbözı behatásokra adott válasz: - a többszöri lefagyasztásra és felengedésre rezisztens, de csak a szérumok és a nem túl nagy molekulatömegő bbprl esetében, - a bb-prl preparátumok, valamint a rendkívül nagy molekulatömegő bbprl-aggregátumok nem! A szérumban lévı proteinek jelenléte megvédik a molekulát a disszociációtól. Ok: eltérı kötések, eltérı ionerısség

21 A macroprolactin biológiai aktivitásának vizsgálata in vitro bioassay-vel (Nb2, lactogen aktivítás: Schepper et al EJE 2003;149:201-7 Összesen 50 macroprolactinaemiás szérumot vizsgáltak PRL-IgG complex okozta macroprolactinaemia: - a lactogen activitás az immunoreactiv PRL szinttel szignifikáns korrelációt mutatott (r=0.64 p< ) Az IgG nélküli PRL aggregátumok okozta macroprolactinaemiában: - a lactogen aktivítás: a kalkulált szabad PRL-el mutatott pozitív korrelációt. -Hattori N. et al. : In vitro Nb2-bioassay-ben a higítás miatt a disszociáció kifejezettebb (Clin. Endocrinol. 2008, 68)

22 A macroprolactinaemia klinikai validítása a kétféle macroprolactin között Schepper et al EJE 2003;149: hyperprolactinaemiás eset domináns macroprolactinaemiával PRL-IgG komplex okozta hyperprolactinaemia (n=46) : idiopathiás hyperprolactinemia : 35 (76%) PRL aggregatum okozta hyperprolactinaemia (n=4) : 3-nak gyógyszer provokálta hyperprolactinemiája volt.

23 Frequency % Vezetı klinikai tünetek t elıfordul fordulása macroprolactinaemia tényleges hyperprolactinemia p < 0.01 p < 0.01 N.S. Galactorrhea Infertility Amenorrhea

24 Morphologiai abnormalitások az MRI leletekben N= p<0.05 macroprolactinaemia Gyakoriság % p<0.05 tényleges hyperprolactinemia 0 Negativ Microadenoma Macroadenoma Egyéb eltérés

25 Macroprolactinaemiában a prolactin pulzatilis és diurnális ritmusa nem olyan kifejezett Ebéd (Andersen 1982, Jackson 1985) Vacsora Elalvás Monomer PRL molekula dominanciájakor: Ébredés Reggeli PRL mu/l h

26 PRL fiziológi giás emelkedésével járój állapotokban: A menstruáci ciós s ciklus folyamán: - Fraser, Larrea et al.. (1989); középidıben ill. lutealis fázisban: Terhesség - Whittaker 1981, Andersen et al. 1982; Az zisban: összes PRL, big-big PRL free PRL - egyforma arány Az összes PRL macroprolactinaemiában vs. free PRL - Hattori et al 1996; A trimesterek növekedtévelvel a big-big PRL és s a free PRL nı n, de arány nyában a bb PRL A monomer PRL szint a terhesség g során n nem különbk nbözik jelentısen azon terhesek értékétıl, akik macroprolactinaemiások sok. Szoptat Szoptatás Jackson 1985, Fraser 1989 összes PRL (30 után: 2-szeres 2 mu/l), big-big PRL --, monomer PRL

27 Hyperprolactinaemiát okozó gyógyszerek gyszerek hatására: a monomer PRL nın meg a bbprl nem változikv Neurolepticumok, Antiepileptikumok Antidepresszánsok Dopamin antagonisták Narcoticumok Antihypertensivumok (methyldopa, Ca2+ csatorna blokkolók pl. verapamil) Hormonok, hormon hatású szerek: E2, TRH, inzulin, cyprosteron acetát

28 Dopamin agonisták: bromocriptin hatás macroprolactinaemiában Egy egyszeri dosisra (2,5-5 mg) adott válasz macroprolactinaemiában óra múlva- csekély változás (Hattori: 1994, Bonhoff:1995) - monomer PRL (82%), bbprl (21%) Fraser et al (1989) Hosszabb ideig adott dosis: (Hattori: 1996, Heaney: 1999, Fabre 1997, Valette-Kasic, Olukoga 2002) - eredmények következetesen csökkenést igazolnak a bbprl-ben is, bár a csökkenés nem olyan kifejezett, mint a nem macroprolactinaemiások között. Fahie-Wilson et al Annals of Clin. Biochem. 2005; 42:

29 bbprl-elimin eliminálásánaknak analitikai lehetıségei Gél l diffúzi ziós s kromatográfia referencia módszer, de nem rutin Protein A precipitáci ciós s módszerm rutinban alkalmazható, 90%-os hatásfok Polyethylene glycol (PEG) precipitáci ció rutinban jól alkalmazható, megfelelı cut-off mellett 100%-os hatásfok Ultrafiltráci ciós módszer rutinban jól alkalmazható, 100%-os hatásfok, drága

30 PEG PEG H 2 O PEG módszer m korlátai : nem quantitatív H 2 O H 2 O nem specifikus precipitáció I g G S S S S S S S S S I g G H 2 O PE G S S S I g G I g G I g G I g G H 2 O I g G PE G H2O PEG PEG nem minden módszerhez használható (MEIA, ACS, Immulite) csak az Ab-PRL komplexet csapja ki nem tudjuk pontosan, a monomer PRL szintek referencia értékét

31 Nincs definiálva a PRL ref. tartománya a bbprl meghatározása után: 169 PEG kezelt minta PRL lelete három módszerrel mérve 30 normal MPRL thprl Fequency of MPRL (%) ECLMA-I EC LMA-II C LMA Distribution of cases % 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% N=153 N=129 N=42 N= N=55 ECMA-I ECLMA-II C LMA Nincs meghatározva a PEG kezelt mintákból mért PRL referencia tartománya

32 Visszanyerési százalék visszanyerési százalék p<0,001 p<0,001 ECLMA I ECLMA II CLMA

33 A klinikai csoportok PRL átlagértékei a PEG kezelést követıen ECLMA I ECLMA II CLMA HPRL valószínő n=70 ** ** ** ** ** HPRL nem valószínő n= PEG kezelést követı PRL szintek **Szignifikánsabb (p<0,0001) magasabb PRL szintek a nagy klinikai valószínőségő csoportban

34 Következtetések A PEG kezelést követı monomer PRL koncentrációk módszerfüggı különbsége jelentıs, hiszen terápiás konzekvenciája van. Az eltérı módszerekkel mért biológiailag aktív PRL értékek harmonizálást igényelnek. A gyártóknak a PRL szintek referencia tartományát a bbprl eliminálását követıen is meg kellene határoznia.

35 Clinical data of women with simultaneous macroprolactinemia and truet hyperprolactinaemia (8/59; 15%) Patient Age (y) Clinical findings PRL in native serum miu/l PRL after PEG precipitation miu/l PRL recovery % Pituitary MRI Drug treatment 1 22 Raromenorrhea, microadenoma bromocriptine breast discomfort 2 43 Regular menses, microadenoma bromocriptine headache 3 54 Headache, prior normal bromocriptine uterus extirpation 4 28 Alopecia, hirsutism, normal bromocriptine infertility 5 28 Oligomenorrhea, normal estrogen infertility 6 24 Acne, alopecia, normal estrogen raromenorrhea 7 31 Raromenorrhea, normal estrogen galactorrhea 8 25 PCOS*, oligomenorrhea normal none *PCOS polycystic ovaries syndrome

36 A hyperprolactinaemia kivizsgálásának algoritmusa A PRL szint meghaladja a referencia tartományt PRL szint mérés, PEG kezelés után, a PRL szint és visszanyerési százalékának (PRL%) meghatározása 1. A PEG kezelés után a PRL magas és a PRL% >50 2. A PEG kezelés után a PRL magas és a PRL% <50 3. Ha a PEG kezelés után a PRL normális és a PRL%: <50 Tényleges hyperprolactinaemia >1000 mu/l sella MR mu/l Fiziológiás és iatrogen tényezık kizárása után, ha a magas PRL szint többször elıfordul, MR elvégzése javasolt Tényleges hyperprolactinaemia és macroprolactinaemia együttes elıfordulása >1000 mu/l sella MR mu/l Fiziológiás és iatrogen tényezık kizárása után, ha a magas PRL szint többször elıfordul, MR elvégzése javasolt Macroprolactinaemia Nincs teendı. (Autoimmun betegség fennállta mérlegelendı) (Endokrin Útmutató: Toldy E. és Lıcsei Z.)

37 Macroprolactinaemia összefüggése más s hormonleletekkel Hypothalamikus eredet: Monomer PRL: Ösztradiol : Macroprolactinaemia Monomer PRL: norm. Ösztradiol : - FSH, LH : - FSH, LH : v. bb PRL : Suliman et al 2003.

38 Saját t tapasztalatunk Vas megyében 214 macroprolactinaemiás eset közül 32 beteg fölöslegesen részesült bromocriptin terápiában

39 Why is this clinically important problem still so little known years after it was first described? Although were described several years ago: 1974 The heterogeneity of PRL -Suh, Allolio,, Jackson The anti-prl antibodies, big-big PRL -Suh, Allolio,, Jackson one reason is that a number of relevant advances in this field have been published in specialised laboratory-journals journals Fabio Cattaneo at al. Swiss Med

40 Big Prolactin? Sokkal kevesebbet tudunk róla,mint a bbprl-rıl. Nem tisztázott: prohormon dimer? : PRL-protein komplex? 32 Kda binding proteinhez kötıdik 36%-a A big PRL jelenléte összefüggést mutat a bbprl-el. Eltér a bbprl-tıl, mivel hı-stresszre monomer formává alakul

41 Big Prolactin? Triton et al esetismertetése Hyperprolactinaemia klinikai jelei hiányoztak 3 esetben, amikor a big PRL volt a domináns (>70%) A big PRL bioaktív in vitro bio-assay-ben. Lisurid eltolja a big PRL big-big PRL konverziót. Lehetıség: a big-big PRL big PRL keletkezik Jelentettek már akromegáliás esetet, ahol a domináns frakció a big PRL volt.

42 Köszönet a megtisztelı figyelemért!