Laboratóriumi vizsgálatok szisztémás autoimmun kórképekben: Új lehetőségek, régi dilemmák. Nagy Eszter ORFI, Immunológiai Laboratórium

Átírás

1 Laboratóriumi vizsgálatok szisztémás autoimmun kórképekben: Új lehetőségek, régi dilemmák Nagy Eszter ORFI, Immunológiai Laboratórium

2 Immunológiai betegségek laboratóriumi diagnosztikája Diagnózis alapja: Anamnézis, fizikális vizsgálat 30% Rutin laboratóriumi vizsgálatok 20% vérkép, gyulladásos aktivitás (süllyedés, CRP), biokémiai és vizeletvizsgálat, stb. Képalkotó eljárások 20% (röntgen, ultrahang, MR, CT, EKG stb.) Szövettani vizsgálatok 20% Immunológiai vizsgálatok 10 20% Autoantitest vizsgálatok

3 Autoantitestek szerepe az autoimmun kórképek diagnózisában Antitest szerepe Diagnosztikus Diagnózis megerősítése Kórkép SLE MCTD SjS APS RA SSc PM/DM Vasculitis Antitest ANA, dsdns, Sm, apl (CL, β2 GPI, LA) U1 RNP SSA, SSB apl (CL, β2 GPI, LA) CCP, RF Centromer, Scl 70, U3 RNP trns szintetáz (Jo 1), PL 7, SRP, PL 12, Mi 2 MPO, PR3, GBM

4 Klasszikus módszerek: Autoantitestek laboratóriumi kimutatása Immunfluoreszcencia (IFA) Immundiffúzió (ID) Counterimmunelektroforézis Radioimmunassay (RIA) Enzim immunassay (EIA) Új módszerek: Kritikus Pontok: Line immunoassay (LIA) Bead alapú assay k Antigén microarray k Fehérje chip ek Szenzitivitás / specificitás, klinikai interpretáció Irányelvek hiánya az új módszerek alkalmazására és interpretációjára Standardizáció : kalibráció, új referencia minták szükségessége Tesztek harmonizálása Nemzetközi bizottságok: IUS / WHO / CDC Committee for the Standardization of Autoantibodies in Rheumatic Diseases, ACR ANA bizottsága

5 Az ANA szűrés dilemmája: IFA, ELISA vagy Immunoblot? IFA: nukleáris és citoplazma mintázatok DNS Histon Nucleosoma SSA SSB Sm ENA RNP Scl 70 PM Scl Ku (PM) Mi 2 (PM) Sp 100 AMA (PBC) Ribosoma (SLE) Jo 1, SRP, PL 7, PL 12 (PM ) Midbody CENP F (tumorok) Golgi Lysosoma Proteasoma Mitótikus orsó F Actin (AIH) Vimentin IFA előnye: Intakt Hep 2 sejtek, az antigén natív formában (a minőség a fixálás függvénye) Magas szenzitivitás: SLE ben 95 % ANA + anamnézis + fizikális vizsgálat kombinációjában (De alacsony specificitás! 57% SLE ben)

6 Az ANA szűrés dilemmája: IFA, ELISA vagy Immunoblot? IFA Fontos tényező a hígítás: 1: 40 az egészséges populáció 31,7 % a 1: 80 az egészséges populáció 13,3 % a Pozitív 1:160 az egészséges populáció 5 % a (Tan EM et al., 1997) Ajánlás az IFA optimális hígításának kiválasztására: egészséges kontrollok 95 percentilisének megfelelően DE a hígítás emelésével a szenzitivitás csökken!!! Konszenzus hiánya: hígítás gyerekminták esetén (<16 év), 1:40? ELISA / Immunoblot Fontos tényezők: antigén forrása és tisztasága antigén szerkezete, hordozóhoz való rögzítése szűrőtesztek esetén az antigén keverék összetétele mit szűrünk? ha csak néhány mag elleni at. et szűr ANA, csak annak része!!! (eredmény közlés ennek függvényében) A 2007 ben alakult ACR ANA munkacsoport állásfoglalása az ANA irodalmának áttekintése alapján arany standard még mindig az IFA teszt: az IFA teszt helyettesítésére a szolid fázisú immunassay kmég nem teljesen alkalmasak az SLE s betegek kb. 35% a elveszíthető!!! (Meroni et al., 2010)

7 IFA Automata rendszer egyik példája

8 ELISA tesztek eltérő szenzitivitása és specificitása az antigén tulajdonságaiból adódóan dsdns ELISA: ssdns kontamináció miatt álpozitivitás Antigén szerkezete: konformációs / lineáris (konformációs antigének: PT, néhány β2 GPI, SSA 60) Antigén szilárd fázishoz való rögzítése: releváns epitópok hozzáférhetősége PR3 ELISA: direkt, capture, anchor PT ELISA: foszfatidilszerin rögzítése, majd PT hozzáadása Ca 2+ jelenlétében

9 Körkontroll vizsgálat összesített eredményei egy minta kapcsán n=36 ACPA antitest Körkontroll célja: új ACPA standard? Konszenzus: erősen pozitív EWRR ECS on autoantibodies ( ) 0 Negatív, 1 Határérték, 2 Gyengén pozitív, 3 Pozitív, 4 Erősen pozitív

10 Körkontroll vizsgálat összesített eredményei egy minta kapcsán 50% n=36 His trns szintetáz (Jo1) Nincs konszenzus EWRR ECS on autoantibodies ( ) 0 Negatív, 1 Határérték, 2 Gyengén pozitív, 3 Pozitív, 4 Erősen pozitív 12 ELISA 5 IB 1 CIE 7 ELISA 2 IB 2 ELISA 4 IB 2 IB 1 IB

11 Diagnosztikai algoritmus CTD ben ANA IFA Centromer titrálás POZITÍV Mintázat függvényében Citoplazma AMA, RIB, Myositis sp. Nuclear Dots Sp 100 Más titrálás ha 1:160 vagy erős a klinikai gyanú CTD re NEGATÍV STOP PM, SjS klinikai gyanúja POZ dsdns NEG ENA szűrés + ENA profil Mennyiségi meghatározás és konfirmálás Erős klinikai gyanú SLE re Nucleosoma RNP, Sm, SSA, SSB, Jo 1, PCNA, Histon Wiik, 2004; Bizzaro et al., 2007

12 Vizsgálati algoritmus SLE SLE DIAGNÓZIS: Immunológiai vizsgálatok Antinukleáris antitest (ANA) dsdna at., Nucleosoma (Kromatin) ENA at. (SS A,SS B, Sm, RNP) komplement (C3, C4, CH50) apl at. (CL, β2 GPI (G/A/M), LA) RF Direkt Coombs Kémiai, hematológiai vizsgálatok CRP Vérkép Vizelet Kiegészítő vizsgálatok P Ribosoma at. (negatív dsdns és Sm, neurológiai manifesztációk esetén) PCNA at. (ANA mintázat konfirmáció) dsdns Sm U1 RNP SSA PRIB PCNA Különböző ANA mintázatok Hep 2 sejteken

13 SLE KÖVETÉS: Immunológiai vizsgálatok C1q (elsősorban veseérintettség esetén) dsdna at., Nucleosoma (szintje az aktivitás, lupus nephritis jelzője) komplement (C3, C4, CH50) Kémiai, hematológiai vizsgálatok CRP Vérkép Vizelet Aktív SLE ben 3 6 havonta NEONATÁLIS LUPUS (NLE): SS A (Ro 52, Ro 60), U1sn RNP GYÓGYSZER INDUKÁLT LUPUS (DLE): Histon antitest (diagnosztikai kritérium)

14 SjS DIAGNÓZIS: Vizsgálati algoritmus Sjögren Szindróma (SjS) Immunológiai vizsgálatok ANA ENA antitestek: SSA, SSB, Sm, RNP RF További kiegészítő vizsgálatok: Pajzsmirigy at. (TPO, TG) Szervpscifikus at. (APA, AMA, SMA) Komplement (C3, C4, CH50), Kryoglobulin (vasculitis miatt) Szérum immunglobulin szintek (Ig G, IgA, IgM) / immunfixáció (M komponens miatt) Kiegészítő kémiai, hematológiai vizsgálatok: TSH Szérum elektroforézis (monoklonális gammopátia miatt) Vérkép (esetleges leukopénia miatt)

15 ACPA (CCP / MCV) Vizsgálati algoritmus RA RA Diagnózis: CRP, We, C3, C4 RA Követés / Biológiai terápia: CRP, RF, ANA / dsdns, PL at. (CL) ANA IIF pozitív negatív RF IgM pozitív negatív pozitív RA nagyon valószínű < 4 ACR kritérium esetén is negatív RA 33 RF IgA CarP at.? pozitív negatív RA nem RA valószínű 4 ACR krit. SS A SS B Differenciál diagnózis Sm dsdns ACA Scl 70 Nucleoláris Sec. Sjögren SLE Scleroderma

16 Vizsgálati algoritmus Szisztémás Sclerosis (SS) ANA IFA Pozitív (mintázat függvényében) Konfirmálás: ENA ELISA / Immunoblot Centromer + Nucleoláris RNS Polim. I Fibrillarin PM/Scl Th/To + RNS Polim. III + Scl 70 + U1 RNP + Scleroderma limitált forma (Crest sy.) Scleroderma vagy PM Scleroderma overlap sy Sleroderma főként diffúz forma Sleroderma izületi, izom manif. vagy MCTD

17 Vizsgálati algoritmus PM / DM ANA IIF CK, LDH, GPT, GOT Aldoláz Finom / diffúz szemcsés citoplazma pozitivitás CITOPLAZMA negatív Granulált nucleáris / homogén nucleoláris pozitivitás SRP PL 7 PL 12 Jo 1 Mi 2 PM/Scl U1 Ku RNP Polymyositis Anti SRP Szindróma Polymyositis Anti szintetáz Szindróma Dermato myositis Scleroderma / Myositis overlap MCTD

18 Myositis antitestek konfirmációja Immunoblot vizsgálattal MYOSITIS SPECIFIKUS antitestek: Jo 1* (ASS) PL 7 (ASS) PL 12 (ASS) EJ (ASS) OJ (ASS) SRP (Nekrotizáló Myositis) Mi 2 (DM) TIF 1g (p155/140) (DM, CDM) MDA 5 (C ADM, ILD) SAE (DM, ILD) NXP2 (p140) (JDM, kalcinózis) MYOSITIS ASSZOCIÁLT antitestek: PM Scl* (PM, DM, Scleroderma overlap) Ku (Scleroderma overlap) U1 snrnp* (MCTD) SSA (Ro 52, Ro 60)* Minta IFA képe (Citoplazma neg!!!)?? ASS: anti szintetáz szindróma, CDM: tumor asszociált DM, C ADM: amyopathiás DM, JDM: juvenilis DM *ELISA teszt is elérhető

19 Vizsgálati algoritmus Szisztémás Vasculitis ANCA IIF / ELISA pozitív További vizsgálatok: ANA IIF C3/C4 RF Kryoglobulin CRP We C ANCA PR3 Wegener gran. Mikroszk. Poliang. Churg Strauss sy. Atípusos ANCA P ANCA MPO Mikroszk. Poliang. Wegener gran. Churg Strauss sy. Etanollal fixált granulocitákon Formalinnal fixált granulocitákon

20 Vizsgálati algoritmus APS CL (G/M), Β2GPI (G/M), LA mind negatív CL gyengén + legalább 1 + CL (A) / Β2GPI (A)? CL (G/M), Β2GPI (G/M), LA ismétlés 3 hónap múlva negatív negatív gyengén + pozitív további PL at.? legalább 1 + CL (A) / Β2GPI (A) további PL at.? negatív legalább 1 + Nem APS APS lehetséges? Követés APS

21 MCTD DIAGNÓZIS: Immunológiai vizsgálatok Antinukleáris antitest (ANA) ENA U1 snrnp Kémiai, hematológiai vizsgálatok Vérkép Vizelet CRP JUVENILIS IDIOPÁTHIÁS ARTHRITIS (JIA) Immunológiai vizsgálatok Antinukleáris antitest (ANA), pozitivitás esetén ENA RF, CCP AST, TB szűrés (Quantiferon) Kémiai, hematológiai vizsgálatok CRP, We Genetikai vizsgálatok HLA B27

22 TNF gátló terápia laboratóriumi vonatkozásai látens TB szűrés Mycobacterium tuberculosis fertőzés kimutatása IGRA teszttel (IFN release assay) Quantiferon teszt bevezetése Szenzitív: látens és aktív TB fertőzés kiszűrése Specifikus: BCG oltás vagy más, nem tuberkulózis Mycobacterium al való fertőzés nem befolyásolja Biztonságosabb interpretáció (pozitív / negatív kontroll) % negatív pozitív nem értékelhető ,8 RB ED H 46, ,5 Quantiferon eredmények % os megoszlása a reumatológiai betegek (RB), hajléktalanok (H), és az őket ellátó egészségügyi dolgozók (ED) csoportjában (saját adatok) Gyártó szerint: TBAg Cut Off: 0,35 IU / ml Mitogén (PK) Cut Off: 0,5 IIU/mL Saját tapasztalat alapján: TBAg szürke zóna: 0,300 0,800 IU / ml Mitogén (PK): 0,5 2 IU / ml nem egyértelmű

23 TNF gátló terápia laboratóriumi vonatkozásai Gyógyszer és ellenanyag szint meghatározása Ajánlott algoritmus primer vagy szekunder hatásvesztés esetén Terápiára nem reagálók Gyógyszer és EA szint meghatározása Optimális gyógyszerszint, Nincs EA Optimális gyógyszerszint, Van EA Szuboptimális gyógyszerszint, Nincs EA Szuboptimális gyógyszerszint, Van EA Nem TNF mediált gyulladásos folyamat? Más terápiás lehetőség mérlegelése Álpozitív teszt, funkc. inaktív / kis avidit. EA? (Funkcionális, neutralizációs teszt) Nem EA mediált farmakokinetikai foly. Nagyobb dózis / gyakoribb adagolás Gyógyszert neutralizáló specifikus EA TNF gátló váltás Bendtzen, K., Discovery Medicine,, 2013, 15 (83),

24 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!