Immunlabor vizsgálatok szerepe a szisztémás autoimmun betegségek diagnosztikájában

Átírás

1 Immunlabor vizsgálatok szerepe a szisztémás autoimmun betegségek diagnosztikájában Dr. Németh Julianna Laboratórium KFT Budapest

2 Immunológiai vizsgálatok szisztémás autoimmun kórképekben ANA (antinukleáris antitestek) ENA (Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, RNP) ds-dna / chritidia ss-dna hiszton elleni AAT nukleoszóma elleni AAT centromer elleni AAT riboszóma RNP anti-c1q ANCA MPO / PR3 RF / RF izotípusok, (WR) anti-ccp, anti-mcv foszfolipid antitestek C3, C4,(C2), CIC, CH50 cryoproteinek immunglobulinok, elektroforézis süllyedés, CRP

3 Autoantitest diagnosztika helye és szerepe betegség diagnózisa differenciáldiagnózis: autoimmun májbetegség, glomerulonephritis, M. Basedow, myopathiák, arthropathiák betegség aktivitásának követésére aktivitási markerek: anti-c1q, ds-dna, ASCA korrelál a betegséggel: ANCA, ds-dna, nukleoszóma, EMA nem korrelál: AMA, ANA, pajzsmirigy autoantitestek betegségcsoportokon belüli felosztás: prognosztikai és terápiás:myositis Mi2/SRP, riboszóma elleni antitest, centromer antitest terápia hatékonyságának követésére eltűnő antitestek: cöliakia specifikus antitestek perzisztáló antitestek: AMA2 PBC-ben, ANCA PSC-ben korai diagnosztika tünetmentes állapotban: RF, nukleoszóma, CCP, anti- C1q (terápiás siker!) rizikó felmérés: családvizsgálat, gestációs diabetes overlap szindrómák (nem teljesen karakteres kórképek): autoimmun májbetegség, myositis, MCTD autoantitest keresés patológiai eltérés alapján

4 ARA kritériumok 1971 klinikai adatok szerodiagnosztika: Ø LE-sejt pozitivitás ARA kritériumok kritérium immunfluoreszcens teszttel vagy ezzel equivalens teszttel kóros ANA titer, vizsgálat idején DIL kizárható immunológiai eltérés: LE-sejt vagy natív DNA kóros titerben vagy Sm pozitivitás vagy 6 hónapig poz. syphilis teszt, ami TPIT neg. ARA kritériumok kritérium változatlan immunológiai eltérés: natív DNA kóros titerben vagy Sm pozitivitás vagy kóros anticardiolipin IgG vagy IgM érték vagy kóros LA

5 Antinukleáris antitestek metodikái Metodikák:LE-sejt kimutatás (1948) Agglutináció (SLE-latex) antigén: DNP Immundiffuzió: polivalens ENA extractum Indirekt immunfluoreszcencia: Hep-2 sejtvonal ELISA: Hep-2 lizátum, tisztított és rekombináns antigének keveréke BLOT: tisztított és/ vagy rekombináns antigének keveréke?

6 ANA gyűjtőfogalom= minden autoantitest, amelyik konzervált (bármely sejtben előforduló) sejtmag antigénnel reagál, lehet IgG / A/ M ANA = minden olyan autoantitest, amelyik indirekt immunfluoreszcens módszerrel szövetmetszeten (rágcsáló máj / vese) vagy tenyésztett humán tumorsejt-lemezen (pl. Hep-2) nukleáris fluoreszcenciát mutat ANA= minden olyan antitest, amelyik a sejtmag oldható ill. struktúra fehérjéivel reagál LE-sejt, SLE-latex teszt, ANF, ANA, antinukleáris antitestek, ANA screen, ANA detect, ANA-6, -8, -10, -12, ANA-panel, ANA subset, FANA, CTD ANA ANA lelet: negatív / pozitív, titer / koncentráció, ++, <> mag, magburok, ms apparátus, nukleoplazma, citoplazma

7 ANA, mint laboratórumi teszt IIF ELISA szenzitivitás: 64-90% 72-90% SLE: 98% specificitás: % 50-62% SLE:49% - prediktív érték: 93-95% 94-96% + prediktív érték : % 33-36% ANA vizsgálat jó a szisztémás autoimmun betegség kizárására, kevésbé jó a betegség igazolására ANA pozitivitás sokkal gyakoribb, mint a szisztémás autoimmun betegség

8 homogén szemcsés PCNA 5-10% riboszóma P <10% gyűrűs ds-dna ss-dna hiszton

9 Anti-kromatin antitestek LE sejt faktor, SLE-latex, anti-nukleoszóma, anti-dnp, H2A-H2B-DNA kromatin: hisztonok natív komplexe DNS-sel tartalma: 40% DNS 40% hiszton 20% non-hiszton fehérje más makromolekula antikromatin antitestek: anti-nukleoszóma (4) anti-ds-dna (6) anti-ss-dna anti-hiszton (5)

10 Anti-ds-DNA metodikák METODIKA ELŐNY HÁTRÁNY Farr assay CLIFT assay immunoblot magas specificitás, mindhárom izotípus magas specificitás csak intakt duplaszálú DNS-t mutat ki egyszerű kivitel antigén megválasztása alacsony szenzitivitás radioaktív módszer alacsony szenzitivitás IF mintázat értékelése szemikvantitatív nem kvantitatív ELISA magas szenzitivitás nagy széria izotípus specificitás alacsony specificitás alacsony és magas aviditású antitestet is méri

11 ds-dna metodikai problémái heterogén autoantitest család, nem SLE specifikus SLE-ben:22-94% pozitivitás irodalom és metodika függő nem korrelál mindig a betegség aktivitásával ds-dna pozitivitás ANA pozitivitás nélkül laboratóriumi tesztek és az antitest probléma köre: antigén tisztaság antigén specificitás (borjú thymus, lazac spermium plazmid DNA, humán rekombináns DNA ) kitapasztott antigén (megváltozó struktúra, más kötési viszonyok, antigén intaktsága) antigén keresztreakcó készség (ss-dna) antitest alosztály (protektív IgM antitest) aviditás (ELISA) affinitás RF és CIC pozitivitás

12 ANA diagnosztika algoritmusa IIF-val mag fluoreszcencia ANA szűrés Hep-2 IIF citoplazma fluoreszcencia granuláris és homogén magfluoreszcencia kromoszóma pozitív finom szemcsés durva szemcsés vagy szálas ENA screen ds-dna, hiszton, nukloeszóma Rib. Jo-1 AMA, simaizom ENA azonosítás SS-A, Jo-1!

13 ANA diagnosztika algoritmusa ELISA-val ANA screening ELISA pozitív határérték negatív Hep-2 IIF? ENA screen, ENA azonosító: U-RNP, Sm, SS-A, SS-B, Scl, Jo-1 ds-dna, hiszton, nukleoszóma ritka antigén valóban negatív

14 Foszfolipid antitestek

15 APS nemzetközi konszenzus kritériumai Miyakis és mtsai 2006 Laboratóriumi kritériumok 12 héten belül legalább 2 alkalommal pozitívnak talált plazma lupus antikoagulans (az LA mérést az International Society on Thrombosis and Hemostasis előírásai szerint kell végezni) 12 héten belül legalább 2 alkalommal mért pozitív kardiolipin IgG és / vagy IgM koncentráció közepes vagy magas titerben, (>40 GPL, / >40 MPL) standardizált ELISA-val mérve 12 héten belül legalább 2 alkalommal pozitívnek talált β2-gpi IgG és / vagy β2-gpi IgM standardizált ELISA-val mérve APS valószínű, ha legalább egy laboratóriumi és egy klinikai kritérium egyidejűleg fennáll

16 APS diagnosztikai problémái 12 héten belül megismételt vizsgálat kardiolipin IgG infekciókban álpozitiv lehet: TBC, mycoplasma, HIV, malaria, borrelia, lepra, streptococcus, coli, chlamydia, salmonella malignus betegségek mikor történjen az antitest vizsgálat foszfolipid antitestek értékeinek ingadozása LA és / vagy antifoszfolipid pozitivitás primer szekunder APS 2 lépcsős diagnosztika 1. kardiolipin / β2-glikoprotein I komplex 2. ritka autoantitestek

17 Laboratóriumi eltérések APS-ban Autoantitest pozitivitás: Anti-prothrombin Anti-foszfatidil-szerin Annexin V Anti-foszfatidil-kolin Anti-foszfatidil-inozitol Anti foszfatidil-etanolamin Kóros APTI Thrombocytopenia Coombs pozitivitás VDRL, TPHA pozitivitás

18 RA laboratóriumi diagnosztika Metodika RF (IgM) (1937) WR (1948) APF (1964) AKA (1979) Filaggrin (filament aggregating protein) Szenzitivitás (%) ~ 75 % ~ 50 % % % Specificitás (%) < 65 % ~ 87 % % % Anti-CCP 1 (1998) % % Anti-CCP 2 -CCP % % CCP IgG/IgA Egyéb citrunillált fehérjék (MCV)

19 ANCA diagnosztika Diagnosztikai ajánlás ANCA antigén (major) Proteináz-3 Myeloperoxidáz Elasztáz Katepszin G Laktoferrin Lizozim BPI IIF mintázat canca, ritkán panca panca, ritkán canca panca panca panca panca atípusos canca vagy panca új beteg laboratóriumi vizsgálatánál csak mindkét metodika kombinált eredménye alapján szabad(na) leletet adni (IIF, ELISA) a kétféle vizsgálat (IIF és ELISA) sorrendje is fontos: az IIF történjen előbb IIF mintázat nem elég specifikus a diagnózis felállításához, ezért terápiás döntéshez az ANCA ELISA leletre is szükség van minden nem c mintázat esetén ANA vizsgálata is ajánlott mindkét teszt forma quantitatív végzése ajánlott

20 Cutan vasculitis esete 50 éves férfi beteg térdizületi arthrosis súlyos tüdőgyulladás ( klíma berendezéstől) RF: IU/ml, minden egyéb laboratóriumi paraméter normális kullancs csípés után Borrelia infekció lábán petechiaszerű bőrelváltozások, melyek összefolynak, havonta 1x megjelennek, majd eltűnnek, barna bőrelszíneződéssel gyógyulnak Kb.1999-től visszatérő boka-, térdizületi fájdalmas duzzanat, mozgáskorlátozottság Salmonella, Chlamydia, Yersinia negatív szerológia ellentmondó Borrelia szerológiai leletek 2003 enyhén emelkedett transzamináz érték A bőrjelenség miatt többszörös átvizsgálás, gócot nem találnak: 2 bőrgyógyász, 2 belgyógyász, angiológus, rheumatológus, infektológus Diagnózisok: purpura vasculitis Schönlein-Henoch purpura

21 IgG: 14.9 g/l, IgA:1.0 g/l, IgM: 1.94 g/l, IgE:217 IU/ml C4:0.1 g/l, C3:1.29g/l, CH50: 59 E/ml, RF: 891 IU/ml, RF-IgM és IgA emelkedett, Waaler-Rose:1:128, CCP:neg, ANA, ENA, ds-dna: neg Borrelia szerológia: IgG negatív, IgM kissé emelkedett, BLOT: Flagellin IgG és IgM gyengén poz IFE: negativ, szérum kappa: 3.77g/l, lambda:1.05 g/l kappa / lambda: 3.59 II. típusu kryoglobulinaemia, IgM kappa monoklonális és IgG poliklonális gammopathia anti-hcv pozitivitás

22 Autoantitestek, mint diagnosztikai kritériumok SLE:ANA, ds-dna, Sm, foszfolipid antitestek Neonatalis lupus: ANA / SS-A, SS-B MCTD: ANA / U1-RNP CREST szindróma: ANA/ centromer Sjögren szindróma: ANA/SS-A, SS/B PM/DM: ANA /Jo-1, Mi-2, Ku, SRP, OJ, EJ, PM/Scl RA: RF, citrunillált peptid M. Wegener: canca/pr-3

23 SLE MCTD SjS PM/DM ds-dns, hiszton SLE SS-A, SS-B, Sm, RNP centromer CREST Scl-70, PM-scl SS PCNA SLE Jo-1 PM/DM