A növény inváziójában szerepet játszó bakteriális gének

Átírás

1 A növény inváziójában szerepet játszó bakteriális gének

2 merisztéma korai szimbiotikus zóna késői szimbiotikus zóna öregedési zóna gyökér keresztmetszet

3 NODULÁCIÓ növényi jel Rhizobium meliloti rhizobium jel lucerna INFEKCIÓ? gének

4 ph adaptáció - a pha régió története A fix-2 mutáns K + érzékeny wt fix-2 wt fla-1 Motilitási táptalaj Mutáció térképezése: a kromoszómán Komplementáló géntár klónok izolálása 0,1 % yeast extract 10 mm K-foszfát puffer (ph: 7,0) MgSO 4

5 E E E E E E E E E 1 kb Tn5 Inf fix-2 A fix-2 régió a K-transzportban és az invázióban is fontos K A régió új neve: pha a ph adaptáció után

6 Szekvencia meghatározás E B Sp Sp Sa phaa phab C E F G kb A pha régió membránfehérjéket kódol out PhaA in PhaB in out out out PhaC PhaD in in PhaE in out PhaF 46 out out PhaG in in

7 A pha gének szükségesek a megfelelő K + -kiáramlás és a ph egyensúly biztosításához A pha régió egy K/H antiportert kódol + + Cell K or Na (nmol/mg protein) K + Na Time (min.) 25 NADH 1 o H + NAD H + H + cytosol KHA medium K + ATP ADP K + - ATPase K +

8 A pha gének S. melilotiban a pha1 géncsoport K + /H + -antiportert kódol phaa1 C1 phad1 E1 F1 G1 NADH 1 o H + NAD H + cytosol K + ATP ADP K + - ATPase B. subtilisben található Na + /H + -antiportert meghatározó géncsoport hasonló szerkezetű H + KHA K + phaa2 phab2 C2 phad2 E2 F2 G2 medium genomszekvenálások Rhizobiumban és Agrobacteriumban, több más baktériumfajban is két pha géncsoport Feltételezhető: a pha1 K + /H + -, a pha2 Na + /H + -antiportert kódol

9 Feltételezhető, hogy a pha1 K+/H+-, a pha2 Na+/H+ -antiportert kódol. Atu: Agrobacterium tumefaciens, Bfi: Bacillus firmus, Bha: B. halodurans, Bsu: B. subtilis, Bme: Brucella melitensis, Lin: Listeria innocua, Lmo: L. monocytogenes, Sau: Staphylococcus aureus, Sme: S. meliloti, Vch:Vibrio cholerae. Az ábra nem a baktériumok rokonsági fokát tükrözi, mert a pha gének horizontális géntranszferrel is bekerülhettek az egyes törzsekbe

10 Az Agrobacterium fertőzés chv-gének: kromoszomális virulencia gének ozmotikus adaptáció sebzés vir gének aktiválása T-DNS átvitel hormon bioszintézis tumor és invázió

11 CÉLKITŰZÉSEK (1) Agrobacterium tumefaciens mutánsok létrehozása a pha1 és pha2 géncsoportokban (2) funkció vizsgálata: iontranszport, virulencia? phaa1 C1 phad1 E1 F1 G1 phaa2 phab2 C2 phad2 E2 F2 G2

12 A pha szekvenciák izolálása A. tumefaciens c58 törzsből PCR segítségével klónozás pbluescript vektorba ellenőrzés: restrikciós emésztés, szekvenálás

13

14 RANDOM MUTAGENEZIS in vitro, Eppendorf csőben tisztított plazmid DNS Entranceposon (KmR) Mu transzpozáz enzim TRANSZFORMÁCIÓ plazmid DNS miniprep INSZERCIÓ HELYZETE meghatározás restrikciós emésztésekkel, szekvenálással DIREKT MUTAGENEZIS TOVÁBBI SZEKVENCIA meghatározás, ha kell

15 Mutáció elhelyezése a pha szekvenciákban Mu entranszpozon mutagenezissel (B ábra) Inszerció helyzetének megállapítása (A ábra): PCR, BamHI emésztés Cél: mutáció a klónozott génszakasz közepén helyezkedjen el

16 A pha mutációk átklónozása konjugatív vektorba ppag160: konjugatív plazmid, nem képes replikálódni Agrobacterium törzsben ellenőrzés: EcoRI-KpnI kettős emésztés (A ábra)

17 Mutánsok előállítása homológ rekombinációval Egyszeres rekombináció: kointegrát képződik a mutációt hordozó szakasz és a plazmid is beépül A vad típusú szekvencia megmarad

18 Mutánsok előállítása homológ rekombinációval Kétszeres rekombináció: csak a mutációt hordozó szakasz integrálódik a plazmid és a vad típusú szekvencia elvész mutáns baktérium keletkezik

19 Az A. tumefaciens pha1 mutánsok előállítása Kointegrát származékok keletkeztek, nem kaptunk valódi mutánsokat! Táptalaj Telepek száma K-érzékeny telep Str R telep LBTA (Km) + NaCl 54 0/20 20/20 LBTA (Km) 48 0/20 20/20 LBTA (Km) + KCl 62 0/20 20/20 Plazmid szekvencia jelenléte: streptomicin rezisztens telepek PCR reakcióval a vektor jelenléte szintén kimutatható

20 Újabb pha1 mutációk előállítása A mutáció letális Na + ionok jelenlétében is, Új szekvenciák izolálása Mutáció elhelyezése: kanamicin rezisztenciagén irányított beépítése restrikciós hasítóhelyek segítségével Átklónozás ppag160 vektorba Mutáció bejuttatása a vad típusú törzsbe Str R telepek, PCR a vektor szekvencia jelen van, csak kointegrát származékok

21 A phaa2 mutánsok előállítása Mutáció bejuttatása a vad típusú törzsbe Táptalaj Telepek száma Na-érzékeny telep Str R telep LBTA (Km) +NaCl LBTA (Km) 85 20/20 0/20 LBTA (Km) + KCl 9 20/20 0/20 streptomicin érzékeny telepek PCR: vektor jelenléte nem mutatható ki vektor nem épült be Kétszeres rekombináció játszódott le, valódi mutánsok keletkeztek. A mutánsok Na-érzékenyek!

22 A phaa2 mutáns jellemzése I. A Na + gátolja a mutáns baktérium növekedését Na-mentes, alacsony tápanyag koncentrációjú táptalaj

23 A phaa2 mutáns jellemzése II. A Na + növekedést gátló hatása ph-függő. 1. ph sorozat : 5,6 8,8 Nincs különbség a vad típusú és a mutáns baktérium növekedésében. 2. ph sorozat + 10mM NaCl A mutáns savas és lúgos környezetben is érzékeny a Na + -ionok jelenlétére.

24 A phaa2 mutáns jellemzése I. A pha2 gének nem szükségesek a tumorképzéshez fertőzetlen Vad típusú baktériummal fertőzött phaa2::km R mutáns baktériummal fertőzött

25 A phaa2 mutáns jellemzése III. A pha2 gének nem szükségesek a tumorszövet inváziójához. Visszaizolálható a phaa2 mutáns a tumorból? A.tumefaciens törzs CFU/ml Kanamicin NaCl Vad típus x10 5 0/20 20/20 phaa2::kmr mutáns 2x /20 0/20 a vad típusú baktérium visszaizolálható a mutáns baktérium visszaizolálható (Na + -érzékeny, kanamicin-rezisztens)

26 A phaa2 mutáns S. meliloti 41 baktérium A pha2 gének Na + -transzportért felelősek, de nem szükségesek az invázióhoz. Fix - és Fix + gümők

27