NITROGÉNKÖTŐ ENDOSZIMBIÓZISOK 1

Átírás

1 NITROGÉNKÖTŐ ENDOSZIMBIÓZISOK 1 Frankia baktériumfajok (Actinomycetales) filamentumok v. fonalak, (Streptomyces rokonok) növények: Alnus (Alnus glutinosa lásd a képet) Casuarina mediterrán fajok Eleagnus - ezüstfa pionir fajok kevés kötött N esetén nitrogénkötő gyökérgümők (actinorhizae)

2 NITROGÉNKÖTŐ ENDOSZIMBIÓZISOK - 2 Rhizobium baktériumfajok (Rhizobiales) alfa-proteobaktériumok, Gram (-) növények: Fabales, pillangósok borsó, bab, bükköny, lucerna, szója, here... stb nagyon sok faj minden égövben nitrogénkötő gyökérgümők

3

4 Rhizobiales (rhizobacteria) Bradyrhizobiaceae Bradyrhizobium B. japonicum B. lupini obradyrhizobium sp. ORS1832 obradyrhizobium sp. ORS1838 obradyrhizobium sp. ORS1844 obradyrhizobium sp. ORS1896 obradyrhizobium sp. ORS196 Rhizobiaceae Rhizobium/Agrobacterium group Agrobacterium Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium tumefaciens Rhizobium Rhizobium arachis orhizobium etli orhizobium etli bv. phaseoli Rhizobium galegae orhizobium leguminosarum or. leguminosarum bv. phaseoli or. leguminosarum bv. trifolii or. leguminosarum bv. viciae orhizobium lupini orhizobium sp. NGR234 orhizobium sp. NHG3 orhizobium sp. NK-4 orhizobium sp. NK32

5 Rokonsági összefüggések a rhizobium baktériumok és a velül rokon fajok között molekuláris elemzések alapján.

6 Fabaceae szimbiózisok növényei (példák) Papilionaceae Pisum sativum Vicia faba Phaseolus vulgaris Trifolium repens Medicago sativa Ulex Lupinus corniculatus Melilotus officinalis trópusiak Glycine max Arachis hypogea Cicer arietinum borsó lóbab bab lóhere lucerna somkóró szója földimogyoró chick-pea Mimosaceae Acacia Xilia Mimosa Cesalpinaceae Cassis fistula Tamarindus induca Cercis silicastrum júdásfa

7 Rhizobium genetika Hogyan épül fel a rhizobium genom? Hol vannak és melyek a nitrogénkötésért felelős gének? Milyen bakteriális gének kellenek a szimbiózis létrejöttéhez? Hogy néz ki az a folyamat, amit genetikai eszközökkel (is) meg akarunk ismerni?

8 A szimbiotikus gümő lucerna / S. meliloti

9 A szimbiózis kialakulása Kétféle gümő van morfológiai, fejlődési szempontból: indeterminált (Medicago truncatula) -a gümőmerisztéma folyamatosan működik sok hétig determinált (Lotus japonicus) a gümőmerisztéma működése rövid ideig tart általános fejlődési lépések: -kemotaxis - gyökérszőrön csoportosulás -fertőzési fonal kifejlődése - gümőmerisztéma indukció -fertőzési fonal elágazások - a gümősejtek inváziója - bakteriod átalakulás és nitrogénkötés -öregedés

10 Gyökérszőrsejt invázió A rhizobium közönséges talajbaktérium, szabadonélő formáját exopoliszacharid burok veszi körül. Kemotaxis a gazdanövény gyökere felé - specifikus Rhizobium baktériumok egy gyökérszőrsejt csúcsán. Növényi fehérjék, lektinek segítik a specifikus kitapadást A gazdaspecifitásban is szerepük lehet.poliszacharid felszín felismerése. Cellulóz mikrofibrillumok rögzítik a sejteket a fertőzés kezdetén.

11 Az infekciós fonal (a) A baktériumok a gyökérszőrsejten specifikusan megtapadnak (lektinek) (b) Ezt követi a gyökérszőrsejt deformálódása, görbülése (pásztorbot szerkezet), és a hajlat belső oldalán megkezdődik az infekciós fonal kialakulása. (c) Az infekciós fonal (poliszacharid cső, a sejtfal betüremkedése) a gyökérszőrsejt alapja felé nő, és átlép a következő sejtbe. Elágazik a fertőzési zónán belül és szállítja az egyes sejtekhez a benne szaporodó baktériumokat.

12 A gümőmerisztéma indukciója Az infekciós fonal növekedésével egyidőben, a fertőzés kezdetén a gyökér kéregsejtjei (belső kortex) visszanyerik osztódóképességüket és létrehozzák a gömőmerisztémát. A folyamathoz nem kell a sejteknek baktériumokkal érintkeznie diffúzibilis szignál molekulák Nem kell a baktérium jelenléte kívül sem. A megfelelő gazdanövény gyökerének tápoldatában (gyökér exudátum) növesztett baktériumok szűrlete is kiváltja a kezdeti reakciókat. Diffúzibilis és a szimbiózisra jellemző szignálmolekula termelődik. kék: epidermisz, gyökérszőrsejt fertőzése sárga: protoxylem sejtek is osztódnak zöld: belső kortex sejt osztódása gümő primordium narancs: külső kéregsejtek, infekciós fonal

13 M, merisztéma ES, korai szimbiotikus zóna LS, késői szimbiotikus zóna S, öregedési zóna gyökér keresztmetszet

14 szimbiotikus gümő szimbiotikus gümősejtek infekciós fonal (IF) bakteroid baktériumok peribakteroid membrán (PBM)

15 P: polihidroxibutirát szemcsék B: bakteroid Y: peribakteroid tér M: peribacteroid membrán W: sejtfal S: keményítőszemcse

16 A BAKTÉRIUMGENETIKA fejlődése A Az 1970-es években az E.coli genetika már jelentős fejlődést tudhat maga mögött. - ismert a konjugáció (A), az F-plazmid és az R-plazmidok, a genetikai térképezés - számos bakteriofág megismerése és alkalmazása elkezdődött: lambda (B), speciális transzdukció, P1, általános transzdukáló fág, térképezés Mu, mutagenezis a transzpozonok alkalmazása előtt Tn7, Tn5 transzpozonok (C) B C - elkészült az E. coli cirkuláris genetikai térképe (D) KIALAKULT A BAKTÉRIUMGENETIKA ALAPVETŐ ESZKÖZTÁRA, ALKALMAZÁS MÁS ÉRDEKES FAJOK MEGISMERÉSÉRE (patogének, itrogénkötők, szimbioták, extremofilek...) D (lásd még: Genetika és Baktériumgenetika kurzus)

17 A nitrogénkötés genetikája - a Klebsiella rendszerben A genetikai munka kezdete: a folyamatban hibás mutánsok izolálása A Klebsiella pneumoniae coliform (Enterobacteriaceae) baktérium, az Escherichia coli közeli rokona, jó kísérleti alany (fakultatív anaerob, N-mentes táptalajon növekszik, sok E. coli módszer használható) Nitrogénkötésben hibás mutánsok izolálása és jellemzése A mutagének: kémiai mutagének, pl. NG (nitrozoguanidin, metilálószer), Mu fág (mutátor fég, random integrálódik a genomba 36 kb) transzpozonok Tn5, Tn7, Tn10 A mutáns és a mutáció: fentípus Nif +, Nif -, (nem képes a nitrogénkötésre) genotípus és gén: nif -, nifh (ismert a mutáns gén) Genetikai térképezés: a his és shia lokuszok között P1 transzdukció, Mu fág, F plazmiddal térképezés, R plazmidok alkalmazása

18 prd1 : a nif géneket is hordozó his + plazmid izolálása E. coli his - törzs segítségével A prd1 (R prime) plazmidot tartalmazó E. coli képes a nitrogénkötésre! Deléciós és pontmutánsok térképezése, komplementációs tesztek, kétdimenziós fehérje gélelektroforézis (2D), biokémiai komplementációs kísérletek. Néhány kezdeti eredmény több száz mutáns elemzése révén 14 nif gén, 9 fehérje azonosítható a 2D gélen (indukáló körülmények között) nifkd FeMo fehérje (I-es komponens) alegységeit kódolják nifh Fe fehérje (II-es komponens) nifbne FeMoCo szintézis, beillesztés nifa reguláció, a nifa mutánsban minden nif fehérje eltűnik

19 Genetikai eszközök kifejlesztése rhizobiumokban (R. meliloti rendszer) mutánsok izolálása mutációk térképezése szimbiotikus gének izolálása és analízise (A) MUTÁCIÓK IZOLÁLÁSA A hagyományos kémiai mutagének (salétromossav, NG) mellett gyorsan elterjedtek a transzpozonok (Tn5). Kémiai mutagén hátránya: pontmutáció ált. (nem látható ) több mutáció egy törzsben (Klebsiella példa) hosszadalmas vizsgálat (screen) a mutáns izolálásáig Transzpozon előnye: inszerció (több kilobázisnyi DNS beékelődés, látható hibridizációval, fizikai térképezéssel antibiotikum rezisztencia (genetikai térképezést segíti) mutánsok izolálásakor csak a rezisztenseket kell átvizsgálni Auxotróf mutánsok izolálása lehetséges komplett és minimál táptalajon való teszteléssel TA (komplett) nő, GTS (minimál) nem nő, GTS+ aminosavak v. vitaminok v. bázisok a hibás bioszintézis út pontosítása cys, met, ade AZ ELSŐ MUTÁCIÓK SEGÍTSÉGÉVEL KROMOSZÓMATÉRKÉP SZERKESZTÉSE

20 A kromoszóma térképezése: Nem alkalmazható az F plazmid R faktorok. Pseudomonas aeruginosa törzsből izolált P1 inkompatibilitási csoportba tartzozó R68.45 plazmiddal készítették az első R. meliloti kromoszómatérképet (SzBK, Kondorosi csoport, Nature cikk 1977.) A térképezés konjugáción alapul, de nem perctérképezés, mert az R-plazmidok nem egy helyről indítják a kromoszóma transzferét. Kapcsoltság: az esetek hány százalékában öröklődik egy szelektált markerral egy nem szelektált marker (v. markerek) Minél nagyobb az értéke, a két marker annál közelebb van egymáshot. Nem additív.

21 Az ade1, cys46 és ura29 markerek térképezése. keresztezés I. szelekció ade + Rekombinánsok: ade+, cys+ és ura29-42 ade+, cys46 és ura29-8 ade+, cys+ és ura29-50 ade+, cys+ és ura+ - 0 ade1-cys46 58/100-58% ade1-ura29 50/100-50% (ellenszelekció a nem rekombináns donor baktériumok megölése pl Str) Emlékeztető: konjugációnál parciális diploid állapot, 2 rekombináció kell a rekombináns kialakulásához, a 4x crossing over ritka, ezért ez a rekombináns kategória ált nem jelenik meg. (Ha egy rekombináns kategória nincs, akkor valószínű, hogy 4x rekombináció kell a kialakulásához.) lásd: Genetika anyag

22 A R. meliloti 41 első kapcsoltsági térképe Nincsenek szimbiotikus mutációk a térképen! Miért?

23 Szimbiotikus mutációk Probléma: a szimbiotikus hibák csak növényi tesztben látszanak. Minden mutagenezis után minden egyes mutáns-jelöltet le kel ellenőrizni a fenotípusra növényi tesztben. (4-8 hét) Két fő fenotípus: Nod - (nincs gümő) - a nodulációs v. nod gének hibásak Fix - (a gümő nem működik ) a fixációs v. fix gének hibásak

24 Mutagenezis a Tn5 transzpozonnal E. coli baktériumban konjugatív plazmid (pjb4ji) a Tn5 transzpozonnal. Keresztezés után szelekció Km R rhizobiumokra (ellenszelekció minimál táptalaj vagy megfelelő antibiotikum) Mivel a pjb4ji nem tud replikálódni rhizobiumban, ezért csak akkor lesznek a sejtek Km rezisztensek, ha a transzpozon ugrott valahova a rhizobium genomba (10-5 ). Minden Km R telep potenciális mutáns, melyeket egyenként le kell vizsgálni. (Ez jóval kevesebb munka, mint a kémiai mutagenezisnél. Ott nem tudjuk, ki szenvedett mutációt, ki nem.) A szimbiotikus mutációnak nincs (ált.) szabadonélő fenotípusa, ezért nem lehet térképezni, csak növényi teszt segítségével. Az antibiotikum rezisztenciagént hordozó transzpozonok pozíciója térképezéssel könnyen megállapítható. A Nod- vagy Fix- fenotípust növényi tesztben határozzuk meg. Igazolni kell, hogy a Km R és a szimbiotikus fenotípus 100% kapcsoltak!

25 fix gének helyzete a kromoszómán DE HOL VANAK A nod GÉNEK?

26 A szimbiotikus megaplazmidok A legtöbb rhizobiumban nagyon nagy ún. megaplazmidok találhatóak. Kimutatásuk az Eckhardt-technikával vált lehetővé. Genetikai, molekuláris biológiai kísérletek révén bizonyították, hogy ezeken helyezkedik el a szimbiotikus gének jelentős része. Plazmid kúrálás 42 o C szimbiotikus mutánsok hibridizáció nif génekkel, konjugáció Agrobacterium törzsbe és hibridizáció (ábra) noduláció! (E. coli, Agrobacterium)

27 A nod-nif régió felbontása Deléciós származékok, nif, nod vagy fix gének hiányoznak deléciók térképezése géntár klónok segítségével (nem konjugatív klóntárak) plasmid, kosmid, kostramid A nod gének behatárolása közös (common) nod gének gazdaspecifitási nod gének (hsn)

28 Klóntárak, génizolálás, irányított mutagenezis Az E. coli genetika alkalmazása nincs más út géntranszfer: transzformáció, transzdukció, konjugáció Vektorok, géntár készítés, tesztelés, génizolálás géntárakból

29 Klóntárak I: VEKTOROK Mi számít? cos régió nagyság transzfer inkompatibilitás, antibiotikum rezisztencia stabilitás, (helper)

30 Klóntárak VEKTOROK

31 Klóntárak II: génizolálás, irányított mutagenezis géntár készítés inszert mérete (20-30 kb, plafr1) klón in vitro pakolás klónok tárolása (egyenként?, kupacokban, egybemosva? felhasználástól függ jellemzés menyi az inszert és milyen nagy, komplementációs tesztek használat: mutánsok komplementálása auxotrófia szimbiotikus mutáció Nod és Fix mutánsok esetében milyen szelekció lehetséges?