Nosocomialis infekciókat okozó baktériumok tipizálásának jelentősége a kórházi járványok felderítésében

Átírás

1 Nosocomialis infekciókat okozó baktériumok tipizálásának jelentősége a kórházi járványok felderítésében Pászti Judit OEK Fágtipizálási és molekuláris epidemiológiai osztály

2 Tipizálás - általában Bakteriológiai tipizálási eljárások: előzetesen izolált és identifikált baktérium fajok speciesen belüli differenciálására szolgáló eljárások, melyek segítségével két vagy (több), azonos specieshez tartozó baktérium izolátum összehasonlítható Fenotipizálás Genotipizálás

3 Molekuláris tipizálás molekuláris epidemiológia alkalmazása Meghatározható baktérium speciesek egyes klónjainak elterjedése időben és térben; Elkülöníthetők járványosan és endémiásan előforduló baktérium klónok; fertőzés terjedésének módjának és útjának nyomonkövetése; Multirezisztens és fokozott virulenciájú veszélyes törzsek azonosítása, figyelem felhívása; Időben-térben elhúzódó sporadikus esetek Retrospektív vizsgálat Járvány kialakulása során beteg, hordozó, környezet real time vizsgálat Monitoring, speciesekre, genetikai klónokra, valamint rizikó osztályokra vonatkozóan

4 A tipizálási módszerek kritériumai Stabilitás Tipizálhatóság, diszkriminativitás Epidemiológiai adatokkal való összhang (sporadikus-járványos) Reprodukálhatóság Teszt anyag minimum mennyisége (n=100)

5 A megfelelés kritériumai Flexibilitás (széles species spektrum kis módosítással) Gyorsaság Műszer-reagens igény Kivitelezhetőség Ár Számítógépes értékelés adatbázis építés

6 A járványügyi tipizálás szintjei Lokális szint: kórház, egyes részlegek, hosszú ápolási intézmény, egészségügyi otthon, stb - fenotípusos jegyek (pl sajátos antibiotikum rezisztencia kép); Országos szint tipizáló laboratóriumok, referencia laboratóriumok adatbázisok-klónok azonosítása Globális szint nemzetközi munkacsoportok és adatbázisok nemzetközileg szélesen terjedő klónok azonosítása alert rendszerek

7 Tipizálási módszerek DNS alapú módszerek PCR alapú módszerek RAPD AP-PCR (ERIC1;2) Pl Enterobacter spp Nem-PCR alapú módszerek Plazmid tipizálás PFGE Klebsiella spp Saureus, MRSA, Pseudomonas spp, Acinetobacter spp, E coli, Citrobacter sp, Streptococcus spp Szekvencia alapú módszerek SLST (egy locus) MLST (háztartási gének) S pyogenes, N meningitidis, S aureus, Klebsiella spp,

8 Módszerek RAPD analízis: tetszőleges rövid primerek használata véletlenszerű (előre nem ismert) DNS szakaszok amplifikációjához nem túl szigorú PCR feltételek mellett ERIC primerek; PFGE: a teljes genom makrorestrikciós profilvizsgálata gélelektroforézissel, speciális, váltakozó irányú elektromos erőtér használatával; MLST: meghatározott számú háztartási gén (lassan változó gének, melyek nincsenek kitéve a szelekciós nyomásnak) allél variációi alapján szekvencia típusok (ST) meghatározása

9 Tipizálási módszerek Molecular concepts associated with genetic variability A van Belkum et al: Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology, Journal compilation 2007 Clinical Microbiology and Infectious Diseases, CMI, 13 (Suppl 3), 1 46

10 Módszerek összehasonlítása Módszer Diszkrimi nativítás Tipizál hatóság Reprodukál hatóság Idő Költség (%) PFGE jó 100 jó 2-4nap átlagos Ribotipizálás alacsony 100 jó 3-4nap átlagos RAPD átlagos alacsony <1nap alacsony AFLP jó 100 jó 2-3nap átlagos MLST Nagyon jó* 100 jó 2-3nap magas Szerotipizálás átlagos közepes <1nap alacsony *: species függő

11 Vizsgálataink területe - PFGE Acinetobacter spp Enterobacter spp Enterococcus spp Escherichia coli Legionella spp Pseudomonas spp Serratia marcescens koaguláz negatív Staphylococcus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Stenotrophomonas maltophilia Klebsiella spp nemzeti adatbázis MRSA nemzeti adatbázis

12 Vizsgálataink területe Szekvencia meghatározás Staphylococcus aureus törzsek spa gén tipizálása, MLST Klebsiella pneumoniae törzs MLST vizsgálata Streptococcus pyogenes törzs emm gén tipizálása Neisseria meningitidis PorA gén variábilis régióinak (VR1, VR2 és VR3 ) szekvenálása ESBL rezisztencia gének azonosítása Enterobacteriaceae törzseknél Klebsiella spp Escherichia coli, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis Antibiotikum rezisztencia típus meghatározása (több, mint 60 különböző rezisztencia determináns meghatározása)

13 A kórházi járványok felderítése, a járvány láncolatának nyomonkövetése, forrás azonosítás; kórházi flóra monitorozása; virulens klónok elterjedtségének vizsgálata; antibiotikumokkal szembeni rezisztencia és egyéb virulenciát fokozó markerek terjedésének nyomonkövetése korszerű országos adatgyűjtés és feldolgozás; molekuláris epidemiológiai (tipizálási) vizsgálatok nélkül nem valósíthatók meg! Időben (térben) elhúzódó sporadikus esetek Retrospektív vizsgálat Járvány kialakulása során beteg, hordozó, környezet real time vizsgálat virulens klónok monitorozása - rizikó osztályok

14 MBL (metallo-béta-laktamáz), termelő nosocomialis kórokozók MBL: enzimek csoportja, amelynek tagjai képesek hidrolizálni a penicillineket, cephalosporinokat és karbapenemeket; Integronok hordozhatják ezeket a géneket szerkezetükben, lokalizációjukban variabilitás In vitro igazolt a konjugációval történő átvitel horizontális terjedés lehetőségének bizonyítása Megfigyelhető terjedése világszerte Kapcsolódó multirezisztencia panrezisztencia Pseudomonas aeruginosa (O11 és O12 szerotípus) Libisch B et al Aeromonas hydrophila Libisch B et al Acinetobacter baumannii Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis

15 Multirezisztens Pseudomonas aeruginosa PFGE Kórházi (ITO) csaptelepek monitorozásából (szűrővel és szűrő nélküli használat) származó P aeruginosa törzsek PFGE vizsgálata (OKI Vízbakteriológiai osztállyal) /119x/352/M4+ Ps120/ Psa020 vízminta 99 44/119x/352/1214/M 4/C18+ NB32nb3 Ps143/2008 O6 Psa022 beteg 565/02/08 257/08 N t N t 43n 18k Ps116/2008 Ps63/2008 O Psa018 Psa018 vízminta vízminta 886 N t Ps118/2008 Nt Psa021 beteg 584/02/08 21/352 1c Ps111/2008 O10 Psa016 vízminta 584/01/08 100x21/119x 1c Ps64/ Psa016 vízminta 574/03/08 570/02/08 100x119x 21/119x 18x 18x Ps73/2008 Ps79/ Psa016 Psa016 vízminta vízminta 580/03/08 100x119x 1x Ps90/ Psa016 vízminta 580/01/08 100x119x 1c Ps57/ Psa016 vízminta /1/ /352 NB33d Ps132/2008 Ps66/ Psa019 Psa015 beteg vízminta x31/352/C 188 Ps107/ Psa015 beteg xC188+ Ps76/ Psa015 vízminta /C18 Ps131/ Psa015 beteg 118/03/08 571/01/08 (68)/352 7 Ps55/2008 Ps92/ Psa015 Psa015 vízminta vízminta 414/24 7/352/C 188+ Ps81/ Psa015 beteg 416/ Ps77/2008 (O1) Psa015 (A) beteg 594/ nb3 Ps110/2008 Polyaggl Psa017 beteg

16 Multirezisztens Acinetobacter spp törzsek retrospektív vizsgálata - PFGE Ac4/09-01 Ac13/09-01 Ac3/09-01 Ac22/08-07 Ac24/08-07 Ac28/08-07 Ac25/08-07 Ac30/08-07 Ac33/08-10 Ac21/08-07 Ac2/08-01 Ac5/08-01 Ac4/08-01 Ac1/08-01 Ac3/08-01 Ac6/08-01 Ac31/08-10 Ac34/08-10 Ac2/2007 KAIBO KAIBO KAIBO Intenzív Intenzív Intenzív Intenzív Sebészet Urológia Intenzív Anaszteziológia Sebészet Nefrológia Anaszteziológia Kardiológia Nefrológia KAIBO Érsebészet Független trachea bronchus trachea vér? m ellk as punk? seb seb vér agykamra drain seb trachea vizelet vér seb seb seb trachea -A1 -A1 -A2 AC004 AC005 AC ?

17 Legionella pneumophila PFGE vizsgálat eredményei Dice (Opt:100%) (Tol 10%-20%) (H>00% S>00%) [00%-1000%] Legionella_9812 Legionella_9812 Vizsgálati módszer: kromoszóma restrikciós enzim emésztést követő PFGE (pulzáltatott mezejű gél elektroforézis) «1251/1/1 1 N=27 «1258/2/1 «1251/1/2 «1254/2/2 «1253/2/2 «1258/1/ Lpn001 ESET 2 «198 l 1256/1/1 l 1250/1/1 t 732/1/ Lpn002 t 723/1/08 1 t t t 725/1/08 726/1/08 716/2/ ESET 1 t 734/2/08 1 t 711/2/08 1

18 Köszönöm a figyelmet Elérhetőségek: pasztijudit@oekantszhu wwwoekhu

19 Nosocomialis infekciókat okozó baktériumok tipizálásának jelentősége a kórházi járványok felderítésében Pászti Judit OEK Fágtipizálási és molekuláris epidemiológiai osztály 1

20 Tipizálás - általában Bakteriológiai tipizálási eljárások: előzetesen izolált és identifikált baktérium fajok speciesen belüli differenciálására szolgáló eljárások, melyek segítségével két vagy (több), azonos specieshez tartozó baktérium izolátum összehasonlítható Fenotipizálás Genotipizálás 2

21 Molekuláris tipizálás molekuláris epidemiológia alkalmazása Meghatározható baktérium speciesek egyes klónjainak elterjedése időben és térben; Elkülöníthetők járványosan és endémiásan előforduló baktérium klónok; fertőzés terjedésének módjának és útjának nyomonkövetése; Multirezisztens és fokozott virulenciájú veszélyes törzsek azonosítása, figyelem felhívása; Időben-térben elhúzódó sporadikus esetek Retrospektív vizsgálat Járvány kialakulása során beteg, hordozó, környezet real time vizsgálat Monitoring, speciesekre, genetikai klónokra, valamint rizikó osztályokra vonatkozóan 3

22 A tipizálási módszerek kritériumai Stabilitás Tipizálhatóság, diszkriminativitás Epidemiológiai adatokkal való összhang (sporadikus-járványos) Reprodukálhatóság Teszt anyag minimum mennyisége (n=100) 4

23 A megfelelés kritériumai Flexibilitás (széles species spektrum kis módosítással) Gyorsaság Műszer-reagens igény Kivitelezhetőség Ár Számítógépes értékelés adatbázis építés 5

24 A járványügyi tipizálás szintjei Lokális szint: kórház, egyes részlegek, hosszú ápolási intézmény, egészségügyi otthon, stb - fenotípusos jegyek (pl sajátos antibiotikum rezisztencia kép); Országos szint tipizáló laboratóriumok, referencia laboratóriumok adatbázisok-klónok azonosítása Globális szint nemzetközi munkacsoportok és adatbázisok nemzetközileg szélesen terjedő klónok azonosítása alert rendszerek 6

25 Tipizálási módszerek DNS alapú módszerek PCR alapú módszerek RAPD AP-PCR (ERIC1;2) Pl Enterobacter spp Nem-PCR alapú módszerek Plazmid tipizálás PFGE Klebsiella spp Saureus, MRSA, Pseudomonas spp, Acinetobacter spp, E coli, Citrobacter sp, Streptococcus spp Szekvencia alapú módszerek SLST (egy locus) MLST (háztartási gének) S pyogenes, N meningitidis, S aureus, Klebsiella spp, 7

26 Módszerek RAPD analízis: tetszőleges rövid primerek használata véletlenszerű (előre nem ismert) DNS szakaszok amplifikációjához nem túl szigorú PCR feltételek mellett ERIC primerek; PFGE: a teljes genom makrorestrikciós profilvizsgálata gélelektroforézissel, speciális, váltakozó irányú elektromos erőtér használatával; MLST: meghatározott számú háztartási gén (lassan változó gének, melyek nincsenek kitéve a szelekciós nyomásnak) allél variációi alapján szekvencia típusok (ST) meghatározása 8

27 Tipizálási módszerek Molecular concepts associated with genetic variability A van Belkum et al: Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology, Journal compilation 2007 Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 9 CMI, 13 (Suppl 3), 1 46

28 Módszerek összehasonlítása Módszer Diszkrimi nativítás Tipizál hatóság (%) Reprodukál hatóság Idő Költség PFGE jó 100 jó 2-4nap átlagos Ribotipizálás alacsony 100 jó 3-4nap átlagos RAPD átlagos alacsony <1nap alacsony AFLP jó 100 jó 2-3nap átlagos MLST Nagyon jó* 100 jó 2-3nap magas Szerotipizálás átlagos közepes <1nap alacsony *: species függő 10

29 Vizsgálataink területe - PFGE Acinetobacter spp Enterobacter spp Enterococcus spp Escherichia coli Legionella spp Pseudomonas spp Serratia marcescens koaguláz negatív Staphylococcus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Stenotrophomonas maltophilia Klebsiella spp nemzeti adatbázis MRSA nemzeti adatbázis 11

30 Vizsgálataink területe Szekvencia meghatározás Staphylococcus aureus törzsek spa gén tipizálása, MLST Klebsiella pneumoniae törzs MLST vizsgálata Streptococcus pyogenes törzs emm gén tipizálása Neisseria meningitidis PorA gén variábilis régióinak (VR1, VR2 és VR3 ) szekvenálása ESBL rezisztencia gének azonosítása Enterobacteriaceae törzseknél Klebsiella spp Escherichia coli, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis Antibiotikum rezisztencia típus meghatározása (több, mint 60 különböző rezisztencia determináns meghatározása) 12

31 A kórházi járványok felderítése, a járvány láncolatának nyomonkövetése, forrás azonosítás; kórházi flóra monitorozása; virulens klónok elterjedtségének vizsgálata; antibiotikumokkal szembeni rezisztencia és egyéb virulenciát fokozó markerek terjedésének nyomonkövetése korszerű országos adatgyűjtés és feldolgozás; molekuláris epidemiológiai (tipizálási) vizsgálatok nélkül nem valósíthatók meg! Időben (térben) elhúzódó sporadikus esetek Retrospektív vizsgálat Járvány kialakulása során beteg, hordozó, környezet real time vizsgálat virulens klónok monitorozása - rizikó osztályok 13

32 MBL (metallo-béta-laktamáz), termelő nosocomialis kórokozók MBL: enzimek csoportja, amelynek tagjai képesek hidrolizálni a penicillineket, cephalosporinokat és karbapenemeket; Integronok hordozhatják ezeket a géneket szerkezetükben, lokalizációjukban variabilitás In vitro igazolt a konjugációval történő átvitel horizontális terjedés lehetőségének bizonyítása Megfigyelhető terjedése világszerte Kapcsolódó multirezisztencia panrezisztencia Pseudomonas aeruginosa (O11 és O12 szerotípus) Libisch B et al Aeromonas hydrophila Libisch B et al Acinetobacter baumannii Klebsiella pneumoniae 14 Proteus mirabilis

33 Multirezisztens Pseudomonas aeruginosa PFGE Kórházi (ITO) csaptelepek monitorozásából (szűrővel és szűrő nélküli használat) származó P aeruginosa törzsek PFGE vizsgálata (OKI Vízbakteriológiai osztállyal) /119 x/3 52 /M4 + Ps1 20 / Psa02 0 vízmin ta /1 1 9x/35 2/121 4/M 4/C1 8+ NB3 2nb 3 Ps1 43 /20 08 O6 Psa02 2 be teg 5 65/02 /08 N t 43 n Ps1 16 /20 08 O1 0 Psa01 8 vízmin ta 2 57/08 N t 18 k Ps6 3/ Psa01 8 vízmin ta 8 86 N t Ps1 18 /20 08 Nt Psa02 1 be teg 5 84/02 /08 2 1/ c Ps1 11 /20 08 O1 0 Psa01 6 vízmin ta 5 84/01 / x21/119 x 1c Ps6 4/ Psa01 6 vízmin ta 5 74/03 / x119 x 18 x Ps7 3/ Psa01 6 vízmin ta 5 70/02 /08 2 1/1 1 9x 18 x Ps7 9/ Psa01 6 vízmin ta 5 80/03 / x119 x 1x Ps9 0/ Psa01 6 vízmin ta 5 80/01 / x119 x 1c Ps5 7/ Psa01 6 vízmin ta NB3 3d Ps1 32 / Psa01 9 be teg 1 818/1 /08 7 /35 2 Ps6 6/ Psa01 5 vízmin ta x31/352 /C 18 8 Ps1 07 / Psa01 5 be teg xC1 88+ Ps7 6/ Psa01 5 vízmin ta /C18 Ps1 31 / Psa01 5 be teg 1 18/03 /08 (68 )/352 Ps5 5/ Psa01 5 vízmin ta 5 71/01 /08 7 Ps9 2/ Psa01 5 vízmin ta 4 14/24 7 /35 2/C 188+ Ps8 1/ Psa01 5 be teg 4 16/ Ps7 7/ (O 1) Psa015 (A) be teg 5 94/ nb3 Ps1 10 /20 08 Po lyag gl Psa01 7 be teg 15

34 16 Multirezisztens Acinetobacter spp törzsek retrospektív vizsgálata - PFGE Ac4/09-01 Ac13/09-01 Ac3/09-01 Ac22/08-07 Ac24/08-07 Ac28/08-07 Ac25/08-07 Ac30/08-07 Ac33/08-10 Ac21/08-07 Ac2/08-01 Ac5/08-01 Ac4/08-01 Ac1/08-01 Ac3/08-01 Ac6/08-01 Ac31/08-10 Ac34/08-10 Ac2/2007 KAIBO KAIBO KAIBO Intenzív Intenzív Intenzív Intenzív Sebészet Urológia Intenzív Anaszteziológia Sebészet Nefrológia Anaszteziológia Kardiológia Nefrológia KAIBO Érsebészet Független trachea bronchus trachea vér? mellkas punk? seb seb vér agykamra drain seb trachea vizelet vér seb seb seb trachea -A1 -A1 -A2 AC004 AC005 AC ?

35 Legionella pneumophila PFGE vizsgálat eredményei Dice (Opt:100%) (Tol 10%-20%) (H>00% S>00%) [00%-1000%] Legionella_9812 Legionella_9812 Vizsgálati módszer: kromoszóma restrikciós enzim emésztést követő PFGE (pulzáltatott mezejű gél elektroforézis) N=27 «1251/1/1 «1258/2/1 «1251/1/2 «1254/2/2 «1253/2/2 «1258/1/08 «198 l 1256/1/1 l 1250/1/1 t 732/1/08 t 723/1/08 t 725/1/08 t 726/1/08 t 716/2/08 t 734/2/08 t 711/2/ Lpn001 Lpn002 ESET 2 ESET 1 17

36 Köszönöm a figyelmet Elérhetőségek: pasztijudit@oekantszhu 18 wwwoekhu