Molekuláris diagnosztika

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Molekuláris diagnosztika"

Ottó Bogdán
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 CE-IVD LightCycler System Real-time PCR - as flexible as you are Molekuláris diagnosztika Becságh Péter Roche Magyarország Kft MOLSZE

2 BIOKÉMIA: az élet molekuláris logikája MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA: (biokémia + genetika +sejtbiológia) koncepció, stílus, "az amivel a molekuláris biológusok foglalkoznak" (F. Crick) Az élet bonyolultságát (komplexitás) az információs makromolekulák adják.

amivel a molekuláris biológusok foglalkoznak" (F.

4 DNS mint örökítıanyag (RNS vírusok, prionok) Információáramlás: DNS «RNS fehérje ( centrális dogma ) Lineáris információ térbeli szerkezet specifitás, funkció

5 VIZSGÁLATI SZINTEK Fehérjék szerkezet és funkció összefüggései; molekuláris kölcsönhatások: szerkezeti biológia Az élı rendszert fenntartó fluxusok; metabolizmus, biokatalízis, reguláció: bioenergetika, anyagcsere biokémia,enzimológia Információ tárolása és feldolgozása: molekuláris biológia Teljes genomok, fehérje készletek, molekuláris interakciós hálózatok: genomika, proteomika, bioinformatika

bioenergetika, anyagcsere biokémia,enzimológia Információ tárolása és feldolgozása: molekuláris

6 Molekuláris vizsgálati területek DNS minıségi, mennyiségi RNS minıségi, mennyiségi Fehérje, minıségi, mennyiségi

7 DNS (genomi RNS) A természetben elıforduló Legspecifikusabb biomarkere minden élı szervezetnek

8 Molekuláris Diagnosztika Molekuláris diagnosztika a klinikai laboratóriumi diagnosztika azon ága, amely biológiai markerként DNS-t és RNS-t használ a klinikai vizsgálatokhoz.

9 DNS, RNS, Fehérje vizsgálati eljárások ELISA FACS PCR RT PCR Fehérje chip Western blot Chromogene Assay RTS RAPD AFLP LC, GC - MS PCR ELISA Fehérje szekvenálás NMR RTG Kristallográfia RFLP CobasAmplicorPCR Fragment Analízis, Real time PCR Génexpresszió, allél azonosítás, PFGE Microsatellita vizsgálat Northern blot Linear array DDPCR SAGE Southern blot GenChip pyroszekvenálás szekvenálás Micro array

CobasAmplicorPCR Fragment Analízis, Real time PCR Génexpresszió, allél azonosítás, PFGE

10 Northern, Suthern, Western Blot Real time PCR Differential Display Microarrays Singleplex Multiplex

11 CE-IVD LightCycler System Real-time PCR - as flexible as you are Gyors, valós-idejő PCR rendszer, szepszist okozó mikróbák azonosítására

12 Nukleinsav célpontok baktériumok identifikálásához Virulencia gének toxin gének specifikus genom fragmentek 16S vagy 23S rdns hsp65 gén gyrb gén 16S-23S rdna spacer

13 Ribosomális RNS operon Általános A transzkriptumok a riboszóma fuknkciójához nélkülözhetetlenek Többszörös kópiaszámban fordul elı struktúra : 16S-spacer-23S-spacer-5S trns gének a spaceren helyezkednek el

Többszörös kópiaszámban fordul elı struktúra :

14 16S-23S rdns spacer tulajdonságai Amplicon hossz : bp általában 500 bp Csoport és/vagy species specifikus különbségeket hordoz

15 Konzervált területek az rrns operonon belől A B C D E F G H I J trns ile trns ala S rrns spacer 23S rrns Gürtler et al., 1996

16 rdns spacer nukleinsav szekvencia illesztés * * * * * * * * * * * * * * LMOB.SEQ TAAGGAAAAGGAAACCTGTGAGTTTTCGTTCTTCTCTATTTGTTCAGTTTTGAGAGGTTACTCTCTTTTATGTCAGATAAAGTATGCAAGGCACTA--TGCT-TGAAGCATCGCGCCACTACATTTTTGACGGGCCTATAGCTCAGCTGG LMOC.SEQ LMOF.SEQ LINB.SEQ...C...G...C...AC G...A... LIVB.SEQ...G...C...AG...C...C...G.GT--...C-.TGG...AA.A...A... LSEB.SEQ...G...G...C...C...GT--...C-.TGG...AA.A...A... LSEC.SEQ...T...G...G...C...C...GT--...C-.TGG...AA.A...A... LWEB.SEQ...T...G...C...TAC.--...C..G...A.T...A... LGRB.SEQ...T...T..C.-T...A C.C..TA...G.-A T..TAT.T..-.T..--..G.GCAGC.A.TC.G.AAA.T... LGRC.SEQ...T...T..C.-T...A C.C..TA...G.-A T..TAT.T..-.T..--..G.GCAGC.A.TC.G.AAA.T... LMUB.SEQ...T...T..C.-T...A C.C..TA...G.-A T..TAT.T..-.T..--..G.GCAGC.A.TC.G.AAA.T * * * * * * * * * * * * * * * LMOB.SEQ TTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCGAGTCCATTTAGGCCCACTTTTTCTTTCTGACATAAGAAATACAAATAATCATA-CCCTTTTAC---GGGG-CCTTAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGGA LMOC.SEQ...GC...-T...T LMOF.SEQ LINB.SEQ...CG.AG..A...TTC...TTA.-TT.C...TA LIVB.SEQ...G...C..----TG.ATA.-..TA...A LSEB.SEQ...G...---C..TTG..C.-T...A...ATAA LSEC.SEQ...G...---C..TTG...-A...A...TTAA LWEB.SEQ...C..AG..A...AT..T..TT...C..A---...G... LGRB.SEQ...A TC.TT..-TATC...T LGRC.SEQ...A TC.TT..-TATC...T LMUB.SEQ...A TC.TT..-TATC...T * * * * * * * * * * * * * * LMOB.SEQ GGTCAGCGGTTCGATCCCGCTAGGCTCCACCAAAATTGTTCTTTGAAAACTAGATAAGAAAGTTAGTAAAGTTAGCATA---GATAATTTAT-TATTTATGACACAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATCTTTCATCTGATTGGA LMOC.SEQ LMOF.SEQ LINB.SEQ...G A... LIVB.SEQ...---A...GG.A.C-... LSEB.SEQ...---AG..G.A..AC...A...C.. LSEC.SEQ...---AG..G.G..AC...A...C.. LWEB.SEQ G.A..-...A... LGRB.SEQ T..C.AGT..A..C..G.-A A.G...A...CG LGRC.SEQ T...T..C.AGT..A..C..G.-A A.G...A...CG LMUB.SEQ T..C.AGT..A..C..G.-A A.G...A...CG * * * * * * LMOB.SEQ AGTA-TCATCGCTGATACGGAAAATCAGAAAAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATT LMOC.SEQ T LMOF.SEQ LINB.SEQ C... LIVB.SEQ A...A.C... LSEB.SEQ C A..C...T...AC... LSEC.SEQ C A..C...T...AC... LWEB.SEQ CA.CG..T...T... LGRB.SEQ...GG...-C..C.G..GA..C...AG GCAA.C.-C...-. LGRC.SEQ...GG...-C..C.G..GA..C...AG GCAA.C.-C...-. LMUB.SEQ...GG...-C..C.G..GA..C...AG GCAA.C.-C...-.

SEQ...C...G...C...AC.--...-..G...A... LIVB.SEQ...G...C...AG...C...C...G.GT--...C-.TGG...AA.A...A... LSEB.SEQ...G...G...C...C...GT--...C-.TGG...AA.A...A... LSEC.SEQ...T...G...G...C...C...GT--...C-.TGG...AA.A...A... LWEB.

17 Szekvencia illesztés Chlamydia trachomatis és más Chlamydia fajok plasmid szekvenciái Azonos fajba tartozó törzsek vagy izolátumok szekvenciái Közeli fajok szekvenciái

18 Jellemzı Nukleinsav szakasz felsokszorozása, PCR A nukleinsav izolátum kettıs szálú DNS termékének denaturálása hıvel 2. Annealing, rövid, mesterséges nukleinsav darabok (Primerek) bekötıdése a megfelelı, specifikus DNS szakaszra Lánchosszabítás(de novo synthesis)a Taq-Polymerase enzim meghosszabítja a bekötıdött primereket 4. Detektálás specifikus, mesterséges nukleinsav darabokkal a PCR-t követıen (AMPLICOR, COBAS AMPLICOR) vagy a PCR alatt ciklusról ciklusra (LighCycler, COBAS TAQMAN48)

Lánchosszabítás(de novo synthesis)a Taq-Polymerase enzim meghosszabítja a bekötıdött primereket 4.

19 P r o b e F x Template x Nukleinsav próba bekötése x 5 x = G:T mismatch = A:C mismatch Temperature ( C)

20 PCR technikával felsokszorozott jellemzı nukleinsav szakasz A specifikus nukleinsav próba lehetıséget ad a PCR végén a keletkezı jellemzı termék rögzítésére és elválasztására, másrészt valós idejő technika alkalmazása esetén a PCR során keletkezı termékek mennyiségének és minıségének folyamatos követésére. conservative high variability Lb2 conservative Lb1 low variability Probe low variability

valós idejő technika alkalmazása esetén a PCR során keletkezı termékek mennyiségének és

21 Spacer Technológia 16S ITS (Spacer) 23S Generikus Primerek ( pan bacteria ) Amplifikációs görbe Group (e.g. Enterobacteriaceae) Specifikus nukleinsav próba Olvadáspont analízis E. coli Ent.bacter cloacae Ciklusok Tm

22 Olvadáspont analízis

23 Munkafolyamat

24 Fertızés kimutatása 6 órán belől Minta Teljes Vér (EDTA) Minta Elıkészítés Lízis, Nukleinsav kivonás PCR Analízis Gram (-) Escherichia coli Klebsiella (pneumoniae, oxyt.) Serratia marcescens Enterobacter (cloacae, aerog.) Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumanii Stenotrophomonas maltophilia Gram (+) Staphylococcus aureus CoNS Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp. Enterococcus faecium Enterococcus faecalis MRSA (meca) VRE (van A, B) Fungi Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida krusei Candida glabrata Aspergillus fumigatus

25 Hagyományos és Molekuláris Diagnosztika összehasonlítása A PCR korábban ad használható eredményt 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap 2-3 nap kezelés hemokultúra Gram Species rezisztencia tenyésztés kezelés 6 h PCR Gram, Species, Rezisztencia (VRE & MRSA) PCR

26 Our approach: PCR speeds up microbiology Példa: Intenz Sepsis in Intensive Care Medicine Expected medical benefit: Improved initial antibiotics therapy Decreased Sepsis severity Reduced resistance of nosocomial pathogens Benefit for the patient: Less risk of complications Economic benefit: Shorter stay in intensive care * Enhanced competitiveness (lower DRG case cost; improved infection statistics) Freed ICU beds available for elective surgery * 26% had incorrect initial empiric antibiotic therapy, with 3,1 additional ICU days on average: Source: M.H.Kollef et al, Inadequate Antimicrobial Treatment of Infections, CHEST 1999, 115:

Hasonló dokumentumok

Nosocomialis infekciókat okozó baktériumok tipizálásának jelentősége a kórházi járványok felderítésében

Nosocomialis infekciókat okozó baktériumok tipizálásának jelentősége a kórházi járványok felderítésében Pászti Judit OEK Fágtipizálási és molekuláris epidemiológiai osztály Tipizálás - általában Bakteriológiai