Molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a biológiai környezeti kármentesítésben

Átírás

1 Molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a biológiai környezeti kármentesítésben Dr. Kovács Tamás, Kovács Árpád László Kármentesítés Aktuális Kérdései 2013 Budapest,

2 Bioremediáció során felmerülő kérdések Jelen vannak- e az ado; szennyezőanyag degradációjáért felelős természetes vagy inokulált mikroorganizmusok, ha igen, akkor megközelítőleg milyen arányban? Szükség van- e mikroorganizmusok inokulálására és/vagy tápanyag- utánpótlásra? 3. Milyen mértékben toxikus az ado; szennyezőanyag a mikroflórára? Olyan irányban folyik- e a 4. kármentesítési folyamat, mint amilyenben szükséges?

3 A molekuláris biológia definíciója A molekuláris biológia az élőlényekben található makromolekulákat és makromolekuláris mechanizmusokat tanulmányozza. (Stanford Encyclopedia of Philosophy, 2009). Nem technika, hanem inkább megközelítés (Astbury, Nature, 1961).

4 MFC Diagn Galváncella működési elve e - Zn Proton szelek^v membrán Cu ZnSO 4 Anód cella + CuSO 4 Katód cella

5 MFC Diagn MFC működési elve e- metabolizmus Grafit Proton szelek^v membrán Grafit + Anód cella Katód cella : mediátor

6 MFC Diagn Az áramerősség μa- es (általában 1-4 μa) tartományban mérhető. 0,004 0,003 0,0035 0,0025 0,003 0,0025 0,002 0,002 0,0015 0,0015 0,001 0,001 0, Acinetobacter baumannii , Escherichia coli ,004 0,003 0,0035 0,0025 0,003 0,0025 0,002 0,002 0,0015 0,0015 0,001 0,001 0,0005 0, Salmonella Typhimurium Streptococcus pneumoniae

7 MFC Diagn 0,004 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015 Nem toxikus E. coli gyep 0,001 0, ,004 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015 Enyhén toxikus 0,001 0, ,004 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015 0,001 Toxikus 0, óra 6 óra óra

8 Gyakorlati alkalmazás A műszaki beavatkozási terv készítésénél megvizsgálhatjuk, hogy az ado; szennyezés toxikus- e a mikroflórára, azaz van- e esélye annak, hogy a bioremediáció sikerre vezet.

9 Metagenom-szekvenálás Célja: egy ado; (környezeg) mintában meghatározni a mikroflóra összetételét Többféle megközelítés (shotgun, rrns) lehetséges Leggyakrabban a 16S rrns- t kódoló gén szekvenciája alapján történik

10 PCR reakció Primertervezés: nagyon lényeges, csak validált primert használjunk (Primerek: rövid DNS szakaszok, melyek komplementerek a felszaporítandó DNS valamely szakaszával. A primerpár 2 tagja közé eső szakaszt amplifikáljuka PCR során). Az általunk alkalmazo; validált primerpárokat egy bioinformagkusok és matemagkusok által fejleszte; célszoiverrel tervezzük, melyet egy együ;működés keretében használunk.

11 PCR elve Ábra forrása: Hajósné Dr. Novák Márta: Genegkai variabilitás a növénynemesítésben

12 PCR reakció Primertervezés: nagyon lényeges, csak validált primert használjunk (Primerek: rövid DNS szakaszok, melyek komplementerek a felszaporítandó DNS valamely szakaszával. A primerpár 2 tagja közé eső szakaszt amplifikáljuka PCR során). Az általunk alkalmazo; validált primerpárokat egy bioinformagkusok és matemagkusok által fejleszte; célszoiverrel tervezzük, melyet egy együ;működés keretében használunk.

13 Primertervező szoftver

14 DNS szekvenálás Leolvassuk az amplifikált DNS bázissorrendjét Lényeges: a read- hossz. Read: az ado; szekvenálási technológia által megszakítás nélkül leolvaso;, egymást követő nukleogdok száma. Példa: következő dia

15 DNS szekvenálás: read-hossz Megint elmúlt 2 év és Szövetségünk ismét megrendezi hagyományos konferenciáját KÁRMENTESÍTÉS témakörben. 104 karakter 25 karakterenként olvasva: Megint elmúlt 2 év és Szö megrendezi hagyományos ko Szövetségünk ismét megren és így tovább 104 vagy több karakterenként olvasva: Megint elmúlt 2 év és Szövetségünk ismét megrendezi hagyományos konferenciáját KÁRMENTESÍTÉS témakörben.

16 DNS szekvenálás: read-hossz Rövid read Hosszú read

17 DNS szekvenálás: read-hossz Rövid read- nél illeszteni kell, ekkor fennáll a tévedés lehetősége: nagyon hasonló szekvenciájú DNS molekulák keverékének szekvenálása történik. Hosszú readnél fizikailag kapcsolva van a variábilis régió egésze. Rövid readnél törzs vagy osztály szintű, hosszú readnél genus, de akár faj szintű azonosítás is lehetséges.

18 DNS szekvenálás: read-hossz Leghosszabb readdel a Roche 454 technológia rendelkezik. Bioinformatikai kiértékelés Nagyon lényeges pont, egymástól nagyban eltérő eredményeket kaphatunk.

19 Bioinformatikai kiértékelés Automata, nyilvános szerverek. Leggyakrabban használt: MG- Rast

20 Bioinformatikai kiértékelés Együ;működő partnereinkkel történt bioinformagkai kiértékelés során a Bacillus anthracis jelenlétét kizárha;uk a mintából. Eredmény A minta mikroflóra- összetétele faj vagy genus szinten, %- os összetételben

21 Gyakorlati alkalmazás Meghatározhatjuk az ado; területen a mikroflóra összetételét, ezáltal dönthetünk arról, hogy szükség van- e külső inokulum injektálására, vagy a lebontáshoz szükséges baktériumok a területen rendelkezésre állnak.

22 qpcr Megválaszolandó kérdés: egy ado; baktériumfaj jelen van- e a mintában, ha igen, milyen mennyiségben. A módszer előnye: gyors, nyomnyi mennyiségű baktérium kimutatására is alkalmas. Hátránya: sok esetben nehéz a PCR gátló anyagoktól megszabadulni, validálni kell.

23 PCR elve Ábra forrása: Hajósné Dr. Novák Márta: Genegkai variabilitás a növénynemesítésben

24 qpcr elve

25 CP qpcr - kalibráció y = ln(x) R² = E E E E E E E E+10 Titer (PFU/ml)

26 qpcr CP értékek

27 qpcr melting curve analízis

28 Baktériumfajok meghatározása P. Feladat: Talajvíz mintákból kelle; kimutatnunk Paenobacillus macerans és Achromobacter denitrificans jelenlétét. A megrendelő nem igényelte az aktuális sejtszám meghatározását, hanem az egyes mintákban lévő baktériumok rela^v aránya elegendő v o l t számára. macerans A. denitri- ficans Vizsgált minták száma Pozi^v minták száma Rela^v érték 1-445,7 3,2-724,1 Rela^v érték: a detektálási minimumot 1- nek véve, az ehhez viszonyíto; sejtszám- érték. A módszer rela^v géngyakoriság meghatározására is alkalmas!

29 Gyakorlati alkalmazás A qpcr- el a kármentesítés során nyomonkövethetjük, hogy az ado; szennyezőanyag bontásához szükséges baktériumok vagy enzimek génjei jelen vannak- e, ha igen, akkor milyen mennyiségben.

30 ÖSSZEFOGLALÁS Az ismertete; módszerek alkalmazásával a kármentesítés folyamata nyito;á, átláthatóvá válik, a szükséges beavatkozásokat időben meg tudjuk tenni. A kármentesítés időtartama jól tervezhetővé válik. Ezzel segítjük a kármentesítés kivitelezőjének és műszaki ellenőrének munkáját.

31 Kérdések? További információk? biotechnologia.enviroinvest.hu Enviroinvest Zrt 7632 Pécs, Kertváros u. 2.

32 KÖSZÖNJÜK A FIGYELMET!