Bioaugmentációs eljárások biológiai monitoringja

Átírás

1 SZENT ISTVÁN EGYETEM DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS Bioaugmentációs eljárások biológiai monitoringja Atzél Béla GÖDÖLLŐ 2008

2 A doktori iskola megnevezése: tudományága: mb. vezetője: témavezető: Környezettudományi Doktori Iskola Környezettudomány Dr. Barczi Attila Ph.D. Szent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi Kar Környezet- és Tájgazdálkodási Intézet Természetvédelmi és Tájökológiai Tanszék Dr. Kriszt Balázs Ph.D. Szent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi Kar Környezet- és Tájgazdálkodási Intézet Környezetvédelmi és Környezetbiztonsági Tanszék Az iskolavezető jóváhagyása A témavezető jóváhagyása 2

3 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS 5 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Szénhidrogének a környezetben Szénhidrogén vegyületek biológiai lebontása A biodegradáció fogalma Szerves anyagok biodegradálhatósága Szénhidrogén-bontó mikroszervezetek A biodegradációs eljárások csoportosítása Biológiai monitoring A monitoring vizsgálati tárgya Az élő környezet monitoringja, biomonitoring Polimeráz láncreakció (PCR) Mikroszervezetek környezeti kimutatása Mikroszervezetek faj szerinti besorolása Mikroszervezetek morfológiai vizsgálata Mikroszervezetek identifikálása Mikroszervezetek kockázati szint szerinti besorolása A Chryseobacterium nemzetség A Pseudomonas aeruginosa jelentősége azonosítására használatos módszerek ANYAG ÉS MÓDSZER Bioaugmentációs célra használt törzsgyűjtemény bemutatása A törzsgyűjtemény származása A törzsgyűjtemény ismert tulajdonságai Bioaugmentációs célra használt törzsek 16S rrns gén szekvencia vizsgálata DNS izolálás tiszta tenyészetből PCR reakció DNS szekvencia analízis Szekvencia hasonlóság elemzés Új baktériumfaj leírásához szükséges vizsgálatok Filogenetikai vizsgálatok Fenotípusos vizsgálatok Elektronmikroszkópos felvétel készítése Sejtmembrán-zsírsav analízis Respiratórikus kinon analízis Poláris lipidek vizsgálta Guanin-citozin arány vizsgálata DNS-DNS hibribizáció PCR alapú módszer fejlesztése a CHB-20p. törzs környezeti monitoringjához Fajspecifikus primerek tervezése DNS izolálás talajmintákból Nested PCR Nested PCR módszer érzékenységének tesztelése 43 3

4 3.5. Pseudomonas aeruginosa identifikálása fenotípusos módszerekkel Magyar Szabvány által előírt módszer (MSZ :1988) azonosítás ACGM agaros módszerrel API 20NE teszt Pseudomonas aeruginosa identifikálása molekuláris biológiai módszerekkel Exotoxin A gén kimutatása PCR technikával (ETA módszer) S rdns fajspecifikus génszakaszának kimutatása PCR technikával (PA-SS módszer) Részleges/teljes 16S rdns szekvencia analízis EREDMÉNYEK Bioaugmentációs célra használt törzsek identifikálása A CHB-15p. jelzésű törzs taxonómiai besorolása A CHB-20p. jelzésű törzs taxonómiai besorolása Az AK-35 jelzésű törzs taxonómiai besorolása Az AK-37 jelzésű törzs taxonómiai besorolása Az AK-40 jelzésű törzs taxonómiai besorolása A CHB-20p., mint új baktériumfaj részletes identifikációs vizsgálata Filogenetikai jellemzés Morfológiai jellemzés Fiziológiai és fenotípusos jellemzés Enzimatikus jellemzés Kemotaxonómiai jellemzés DNS-DNS hibridizáció Új baktériumfaj bemutatása CHB-20p. törzs fajspecifikus kimutatása környezeti mintából, DNS amplifikációs módszerrel Pseudomonas aeruginosa környezeti detektálására alkalmas módszerek kritikai összehasonlítása Azonosítás Magyar Szabvány (MSZ :1988) szerint Azonosítás Acetamid-Cetrimid-Glycerol-Mannitol (ACGM) agaron Azonosítás API 20NE biokémiai fingerprinting módszerrel Azonosítás ETA-PCR módszerrel Azonosítás PA-SS PCR módszerrel Identifikáció 16S rdns szekvencia-analízissel A vizsgált azonosítási módszerek eredményeinek összevetése KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK ÖSSZEFOGLALÁS ENGLISH SUMMARY 81 Mellékletek: -1. sz. MELLÉKLET: IRODALOMJEGYZÉK Köszönetnyilvánítás 4

5 1. BEVEZETÉS A hazai környezetvédelmi gyakorlat egyik leggyakoribb kihívása a földtani közeg szénhidrogén-szennyezettségek felderítése és megszüntetése. Magyarországon számos káreset került feltárásra, ahol szennyezőforrásként üzemanyag-töltőllomások, régi fűtőolaj tárolók, valamint kőolaj illetve földgáz termékvezetékek szerepeltek. Amennyiben műszakilag kivitelezhető, szénhidrogén szennyezettségek esetén a szakma gyakran választ megoldásként valamilyen biológiai kármentesítési módszert, hiszen ez költségtakarékos, környezetbarát és biztonságos. Ám ezeknek a kritériumoknak megfelelni, ráadásul jó hatékonysági szinten, csak jól megválasztott, egyedileg a kárhelyhez tervezett technológiával, valamint megfelelő kémiai- és biológiai monitoringgal lehet. A bioremediációs technológiák tervezése több részből tevődik össze, mely részfeladatok különböző képzettségű szakemberek bevonását igénylik. Meg kell tervezni a felhasznált biológiai ágens (oltóanyag) eljuttatását a kívánt helyre, ill. érintkeztetését a szennyezett közeggel. Szükséges gondoskodni a szennyezett közegben a megfelelő biodegradációs körülmények folyamatos jelenlétéről is. E mellet pedig, az egyik legfontosabb ilyen feladat az oltóanyag összetételének tudatos megtervezése. Az ilyen fajta tudatos oltóanyag használatot bioaugmentációnak hívja a szaknyelv, mely fogalom több kritériumot is támaszt annál, mint a tudatos tervezés. Szükséges még a felhasznált mikroszervezetek részletes biodegradációs képességének ismerete, faj szintű identifikációja, valamint nem patogén mivoltuk igazolása, Az első tulajdonság a lehető leghatékonyabb szennyezőanyag-lebontást, a második és a harmadik pedig az eljárás biológiai biztonságát szolgálja. Eme elvárások teljesülését azonban nem elég a tervezés szintjén vizsgálni, annak megfelelő ellenőrzéséről is gondoskodni kell. Ezt a célt szolgálja a bioaugmentációs eljárások biológiai monitoringja, mely a felhasznált mikroszervezetek megtelepedésének, populációjuk változásának vizsgálatát jelenti a szennyezett közegben, ezen kívül magába foglalja az esetlegesen a kárhelyen megjelenő fakultatív patogén fajok megfelelő kontrollját is. A fakultatív patogén baktériumok megjelenésének kockázata különösen nagy a szénhidrogénnel szennyezett területeken, ugyanis nagy számban vannak köztük, melyek hatékonyan tudják az ilyen szennyezőanyagokat kizárólagos szénforrásként hasznosítani. Ezáltal a kárhelyen felszaporodhatnak, mely környezetegészségügyi kockázatot jelent a kármentesítésben résztvevő dolgozók, valamint a környező lakosság számára. 5

6 Doktori kutatási témámban három célkitűzést fogalmaztam meg: -Bioaugmentációs célra felhasznált baktérium törzsgyűjtemény fenotípusos identifikálási eredményeinek felülvizsgálata 16S rrns gén szekvencia hasonlóság elemzés alapján. -A bioaugmentációs célra felhasznált törzsgyűjtemény egyik tagjának (CHB-20p) biológiai monitoringjára alkalmas, fajspecifikus molekuláris genetikai módszer fejlesztése. - A biológiai monitoringjára alkalmas azonosítási módszerek összehasonlító kritikai elemzése, mely a bioaugmentációs eljárások biológiai biztonságának viszonylatában az egyik leggyakrabban felmerülő, fakultatív humán-patogén baktérium. A magyarországi joggyakorlatban a környezetvédelmi célú biológiai készítmények felhasználását a 16/2002. (IV. 10.) EüM rendelet szabályozza. Ez vonatkozik a bioaugmentációs célra használt oltóanyagokra is. A rendelet előírja többek között a készítményben található mikroszervezetek legalább faj szintű megnevezését. Egy ilyen termék hatósági engedélyeztetéséhez tehát szükség van a felhasználandó baktériumok megbízható identifikációjára, a faj szerinti besorolás hitelességének felelőssége pedig az engedély kérelmezőjét terheli. Egy ilyen bioaugmentációs készítmény (törzsgyűjtemény) engedélyeztetésének előkészítésében vettem én is részt, mely korábban már rendelkezett az Országos Környezetegészségügyi Intézet által kiadott felhasználási engedéllyel, ám később a jogszabályok változása miatt szükség volt ennek megújítására. A törzseket korábban már faj szinten identifikálták hagyományos, tenyésztéses eljárásokon alapuló fenotípusos módszerekkel. Feltűnt, hogy a gyűjtemény egyik tagjának két lehetséges faji besorolása is volt, mely az alkalmazott identifikációs módszer bizonytalanságára utalt. Ezen kívül a korábbi felhasználási engedély kiadása óta a baktériumok rendszertana jelentősen átalakult, valamint a fajmeghatározás módszertana és eszköztára is jelentős fejlődésen ment keresztül. A bemutatott előzmények együttesen indokolták a törzsek korábbi identifikációs eredményeinek felülvizsgálatát, melyet munkám első célkitűzésének állítottam. A baktériumok környezeti kimutatására használt fenotípusos, vagy DNS alapú módszerek alkalmazhatóságával szemben sok kérdés merül fel. Második célkitűzésemnek állítottam egy olyan fajspecifikus molekuláris genetikai módszer kifejlesztését, mely alkalmas lehet az általam vizsgált törzsgyűjteményt egyik tagjának, a CHB-20p érzékeny környezeti kimutatására. A célkitűzés megvalósulása esetén a CHB-20p törzzsel végzett bioaugmentáció biológiai monitoringja előtt új távlatok nyílhatnak. 6

7 A fakultatív patogén baktériumok megjelenésére fokozottan számítani kell szénhidrogénnel szennyezett területeken, mivel az ilyen közegben jól megtalálják életfeltételeiket. Bioaugmentációs eljárások esetén - különösen vízbázisok, ill. azok védőterületein - ezért szükséges ezeknek az egészségügyi kockázatot hordozó biológiai ágenseknek a monitoringja. Az ilyen fajok környezeti-, klinikai- ill. élelmiszeripari kimutatásánál is kiemelt fontosságú a vizsgálati módszer gyorsasága valamint megbízhatósága. Harmadik célkitűzésemnek megfelelően ezért elvégeztem néhány P. aeruginosa azonosítási módszer összehasonlító vizsgálatát. Öt vizsgálati módszer eredményeinek egybehangzóságát vizsgáltam 43 db környezeti mintából származó izolátumon (ld. 1. sz. ábra). SZÉNHIDROGÉNEKKEL SZENNYEZETT TALAJMINTÁK Aszparaginos dúsítás (42 º C) Növekedés cetrimid agaron (37 º C) 43 KÖRNYEZETI IZOLÁTUM Fenotípusos módszerek Molekuláris biológiai módszerek MSZ : sz. ábra: környezeti API 20NE ACGM agar ETA PCR PA-SS AZONOSÍTÁSI EREDMÉNYEK EGYBEHANGZÓSÁGA kimutatására alkalmazott módszerek összehasonlítása Teszteltem a vonatkozó Magyar Szabvány (MSZ :1988) által előírt, az ACGM (acetamid-cetrimid-glicerol-mannitol) agaros, valamint az API 20NE módszert, mint fenotípusos módszereket, valamint két PCR alapú, fajspecifikus molekuláris biológiai technikát. Kísérleteim célja volt a két módszercsoport (fenotípusos és molekuláris biológiai) alkalmazhatóságának összehasonlítása, az előnyök és korlátozó tényezők feltárása. Doktori értekezésemben bemutatott eredményeimet, és ezekből fogalmazott téziseimet saját laboratóriumi kísérletek beállításával és értékelésével bizonyítottam, ill. támasztottam alá. 7

8 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Szénhidrogének a környezetben Szénhidrogén szennyezések közül a kőolajok és kőolajtermékek által okozott talajvíz- és talajszennyezések a leggyakoribbak közé tartoznak. Magyarországon a rendkívüli, különösen káros és nagy mennyiségű szennyezések több mint fele ezektől az anyagoktól származik. Tekintettel a széles körű ipari, mezőgazdasági és lakossági felhasználásra, megjelenésükre vizeinkben csaknem mindenütt számíthatunk, különösen, ha a pontszerű szennyezések mellett figyelembe vesszük a szállítás és a tárolás közbeni szóródás lehetőségét is (BARÓTFI, 2000). Összetételét tekintve a kőolaj (nyersolaj) különböző szerkezetű és molekulatömegű, nyílt szénláncú (alifás), ezen belül egyenes szénláncú, pl. normál (n-) paraffinok, elágazó szénláncú, pl. izo (i-) paraffinok, gyűrűs szénláncú (aliciklikus), pl. ciklo (c-) paraffinok és aromás gyűrűt tartalmazó (pl. a monoaromás benzol, toluol, etil-benzol, xilolok), valamint a több aromás gyűrűt magába foglaló poliaromás szénhidrogének (pl. benz(a)pirén) elegye. Ezen kívül nitrogén, oxigén és kéntartalmú vegyületek mellett egyes esetekben fém komponensek is előfordulhatnak benne. A lehetséges kőolajalkotó vegyületek száma több millióra tehető (SZABÓ, 1989). A különféle kőolaj-ipari termékek, mint többféle szénhidrogén vegyületek elegyei, önmagukban nem különösen mérgezőek, ugyanakkor erősen toxikusak lehetnek az egyes alkotó elemek, a termékekhez kevert adalékanyagok (pl. MTBE, ETBE, TAME, stb.), a lebomlási termékek, ill. azok a szennyeződések, amelyek az előírásszerű használat során keveredhetnek a kőolaj származékokba. A kőolajtermékek közül a gazolin, a benzin, a középpárlatok, a kenőolajok és a különböző tiszta anyagok, mint pl. a metil-terc-butiléter (MTBE) okozhatnak nagyobb mértékű talaj- és talajvíz-szennyezést. A folyékony gőzök, gázok ugyanis a beszivárgás előtt jórészt elpárolognak, a nehéz olajok és a bitumen pedig csak igen kis mértékben tudnak beszívódni a talajba, sok esetben impregnálják azt. A talaj és talajvíz szennyeződése gyakran előfordul a kőolaj kitermelése, feldolgozása, a kőolaj és az egyes termékek szállítása, szakszerűtlen tárolása folyamán. A káros hatás függ a környezetbe jutott szennyezőanyag mennyiségétől, tulajdonságaitól és a környezeti feltételektől (talajadottságok, talajvíz mélysége, csapadék mennyisége, éghajlati, időjárási tényezők). Az ásványolaj és származékainak vizeink minőségére gyakorolt káros hatása sokirányú. Már kis koncentrációban és Jellegzetes szagukról oldott állapotban is megkülönböztethetők az egyes termékek. A tiszta normál paraffinok szagukról alig ismerhetők fel; az illékonyabb homológok, mint a n-heptán, n-oktán és n-nonán inkább kellemes gyümölcsszerű 8

9 szaggal rendelkeznek, a magasabb forrpontúak pedig szintén szagtalanok. A tipikus benzinszagot túlnyomóan az izoparaffinok, naftének és az aromás összetevők adják. Tehát az egyes kőolajok és termékek szagküszöb értékei az előforduló szagrontók arányairól függően egymástól több nagyságrendben is eltérnek. A szénhidrogének mérgezőek a vízi életközösségekre. A mérgező hatás is különböző, nagymértékben függ a vízben való oldhatóságtól (BARÓTFI, 2000). A szénhidrogének környezetkárosító hatásai között leggyakrabban az alábbiak szerepelnek: A talajból, talajvízből kipárolgó szénhidrogének - a levegő oxigénjével tűz- ill. robbanásveszélyes elegyet alkothatnak, - bőrön át felszívódva daganatos betegségek indukálói lehetnek (pl. BTEX vegyületek: benzol, toluol etil-benzol, xilol; pentán, hexán, ciklohexán, metilciklohexán, n-heptán, izo-oktán, stb.), - gőzüket belélegezve a véráramba kerülnek, mely által akut toxikus reakciót, májkárosodást vagy teratogén hatást válthatnak ki. A talajba, talajvízbe beszivárgó szénhidrogének - hosszabb - rövidebb ideig perzisztálnak és terjednek a talajban, a közeg hidraulikus vezetőképessége, szerves anyag és agyagásvány tartalma, valamint mikrobiológiai aktivitása függvényében, - apoláros jellegük miatt a kapillárisokból a vizet, levegőt kiszorítják, emiatt azok az oxidatív folyamatok gátlódnak, amelyek a talajok biodegradációs öntisztulásához vezetnek, - hatásukra gátlást szenvedhetnek a biológiai anyagkörforgalmi rendszerek, így pl.: a cellulóz-, fehérje és kitinbontó mikroszervezetek száma és aktivitása csökken a talajban (), - az aromás és PAH vegyületek toxikusak, mutagének és karcinogének lehetnek, - potenciális élő- és talajvízszennyezők, a talajvízbe kerülve, azzal szétterjedve (migrálva) a szennyezőforrástól távolabb is kifejthetik környezetkárosító hatásukat (WALKER et al., 1975; NYER, 1993; WILSON & JONES, 1993; SZOBOSZLAY et al., 2002). 9

10 Magyarországon a 10/2000. (VI. 2.) KöM-EüM-FVM-KHVM együttes rendelet környezeti szempontból kockázatosnak határozza meg a következő szénhidrogén és szénhidrogénekből származtatható vegyületeket: -Alifás szénhidrogének, C 5 -C 40 (TPH) -Benzol és alkilbenzolok (BTEX vegyületek) -Fenolok -Policiklikus aromás szénhidrogének (PAH) -Halogénezett aromás szénhidrogének -Halogénezett alifás szénhidrogének -Klórfenolok -Poliklórozott bifenilek (PCB) -Poliklórozott-dibenzo-dioxinok és dibenzo-furánok (PCDD/F) -Bizonyos növényvédőszerek Szénhidrogén vegyületek biológiai lebontása A biodegradáció fogalma Biodegradáció alatt a mikroszervezetek biokémiai anyagcsere-folyamatain keresztül megvalósuló, lebontási (katabolitikus) ill. átalakítási (transzformációs) folyamatokat értjük. (SZOBOSZLAY et al., 1995; TÖRÖK et al., 1996). Energetikai szempontból a biodegradáció olyan elektronátadási folyamat, melyben a szerves anyagok táp- és energiaforrásként hasznosulhatnak, az oxidációjukból nyert energia pedig a sejtek felépítéséhez és azok fennmaradásához járul hozzá. Az elektronátadáshoz és az anyagcseréhez azonban szükség van terminális (végső) elektron-akceptorra is, mely az elektront fogadja (NÉMETH, 2004). Szerves szennyezőanyagok biodegradációja során maga a szennyezőanyag szolgál elektron donorként. Ilyen szennyezőanyagok esetén az aerob respiráció a leggyorsabb degradációs lépés, mely során a bontást aerob mikroorganizmusok végzik, és a végtermék CO 2, H 2 O és biomassza. Fakultatív anaerob mikroorganizmusok képesek O 2 -t felhasználni elektron-akceptorként, ha az jelen van, vagy képesek alternatív elektron-akceptort is használni, illetve fermentálni is. Ilyen alternatív elektron-akceptorok a nitrát, szulfát, redukált vas, mangán; CO 2 és szerves anyag, melyek felhasználásra kerülnek, ha nincs jelen oxigén. Oxigén hiányában az obligát anaerobok kerülnek túlsúlyba. A biodegradáció sebessége anaerob körülmények között viszonylag lassú, a bomlástermékek egyszerű szerves savak, CO 2, H 2 O, CH 4, H 2, N 2 és biomassza (sejtanyag) (NÉMETH, 2003). A szénhidrogének biodegradációjának ismerete 10

11 ., nem újdonság, több mint száz éve megfigyelték már ennek a vegyületcsoportnak a természetes lebomlását (MIYOSHI, 1895). A témakör mégis mind a mai napig sok titkot és tudományos kihívást rejt. Szénhidrogén szennyezettségek elhárítása esetén hatékony megoldás lehet a biodegradáció. A folyamatot környezetbarátnak tartják, hiszen optimális körülmények között a szennyezőanyag tényleges megsemmisülésére lehet számítani, a végtermékek között pedig veszélytelen anyagok szerepelnek (CO 2 és H 2 O). Ezzel szemben a fizikai vagy kémiai kármentesítési eljárások a szennyező anyag fő tömegét csak más közegbe (oldószer, abszorbens, levegő, szennyvíz) helyezik át, melyeknek további kezelése szükséges, ezzel növelve a szükséges műveletek számát. Problémát jelent még ezen kívül a technológia során keletkező hulladék, ill. veszélyes hulladék (SIMON, 1999). Az eddigi tudományos megfigyelések szénhidrogének anaerob degradációja esetében kivétel nélkül rendkívül lassú lebontásról számoltak be (MAIER, 2000). A leghatékonyabb szénhidrogénbontó enzimek ugyanis az oxigenázok, melyek működése kizárólag oxigén jelenlétében lehetséges. Több monoaromás és poliaromás vegyület biodegradációja végbemehet anaerob körülmények között, de ilyen esetekben a lebontás hatékonysága és sebessége csak töredéke az aerob,, biodegradációnál tapasztaltaknak (ARMON 2000; ATLAS, 1981; BREGNARD 1996; FENCHEL & FINALAY, 1995; FREIJER, 1996; HICKEY, 1995; LEAHY & COLWELL, 1990;, ROFFEY, 1994; SONG 1990; STROO, 1992; YAMANE 1999). Betonfelületek bitumen szigetelésének természetes lebomlását vizsgálva például a bontási intenzitás anaerob körülmények között csupán 0,3-0,6 g/m 2 /év, aerob viszonyok mellett viszont g/m 2 /év értéket mutatott (WOLF & BACHOFEN, 1991), ami szoros különbséget jelent. Más tanulmányokban is legalább szeres intenzitás különbségről számolnak be (ATLAS, 1981) Szerves anyagok biodegradálhatósága A biodegradálhatóság szerves vegyületek biológiai bonthatóságát jelenti, amely a környezetbe kerülésük és a való egy kölcsönhatásuk eredményeképpen nyilvánul meg. A szerves molekula komplexitásának csökkentését, vagy teljes lebontását, mineralizációját jelenti, melynek mértékét és sebességét a szerves vegyület biodegradálhatósága és a környezet biodegradáló képessége együttesen szabja meg. Egy szerves vegyület lebonthatóságát fizikai-kémiai tulajdonságai alapvetően meghatározzák., A vegyi anyagok lehetnek könnyen vagy nehezen bidegradálható, valamint azaz nem vel, biodegradálható vegyületek. A lebonthatóságot a bontáshoz szükséges idővel, ill. 11

12 val lehet ökoszisztémában folyó biodegradáció elsőrendű sebességi állandóit és a felezési időket mutatják ával ). A valamint a könnyen és nehezen bontható anyagokra (Európai Tanács, 1996). jellemezni. Az 1. és 2. sz. táblázat vízi Egy szerves molekula biodegradálhatósága egyértelmű összefüggésbe hozható illékonyságával, vízoldhatóságával, polaritásával, illetve biodegradálhatóság és a Kow összefüggését vegyülettípusonként eltérő egyenletekkel lehet leírni. A (Quantitative Structure Activity Relationship = a vegyi anyag szerkezetének és aktivitásának mennyiségi összefüggése) lehetővé teszi, hogy egy vegyi anyag biodegradálhatóságának mértékét kísérletek nélkül, pusztán a molekula szerkezete és ismert bonthatóságú vegyületekkel való összehasonlítása alapján, modellezés segítségével jellemezzük. A lebonthatóságot mérni is lehet, ún. biodegradálhatósági tesztekkel, melyeket standard körülmények között, ismert mikroorganizmusokkal, vagy kontrollált mikrobaközösségekkel (szennyvíziszap, talaj) végeznek. A biodegradálhatósági tesztek mérési végpontja lehet a vegyi anyag mennyiségének csökkenése, vagy a bontó közösség aktivitása, sejtszáma, légzése, általános, vagy specifikus enzimaktivitásai. A szennyezőanyagok biodegradálhatóságának nagy szerepe van a vegyi anyag környezeti kockázatában. A kockázat mértéke a biodegradálhatósággal fordítottan arányos: minél inkább lebontható egy szennyezőanyag, annál rövidebb ideig lesz jelen a környezetben és fejti ki káros hatását. A biodegradálhatóság csak a környezettel kölcsönhatásban értelmezhető, ahol a folyik. A 2. sz. táblázat a talajban és vízi üledékben érvényes felezési időket mutatja a biodegradálhatóság és vegyi anyag szilárd víz fázis közötti megoszlási hányadosa ( ) függvényében. Minél inkább hidrofób a vegyület, annál jobban kötődik a talaj (üledék) szilárd frakciójához, tehát annál kevesebb lesz a vizes fázisban biológiailag hozzáférhető állapotban. Emiatt a sebességi állandó ezeknél a vegyi anyagoknál nagyobb. A környezeti paraméterek (hőmérséklet, ph, redoxviszonyok, stb.) és főleg a mikrobiota összetétele, állapota és működőképessége nagyban befolyásolja a biodegradálhatóságot. A környezet ökoszisztémája képes alkalmazkodni, hozzászokni, ként elfogadni és hasznosítani a környezetbe kikerülő vegyi anyagokat még akkor is, ha azok természetidegen anyagok, ún. ok. s A környezet képessége mögött a környezetbe kikerült vegyi anyagok (szennyezőanyagok) által kikényszerített evolúciós folyamatok állnak, a mikrobiota genetikai és biokémiai potenciáljának növekedése. Környezetünkben a legintenzívebb biodegradáció a szennyvizekben, a talajban és a felszíni vizekben folyik (GRUIZ, 2001). A gondolkodás jegyében, a biodegradálható természetes anyagok és termékek gyártása és használata (papír, fa, stb.) ajánlott vagy, ha a termék speciális igényeinek ezek, nem tudnak megfelelni, akkor vagy használata. A peszticidek esetében is meg kell találni a kompromisszumot a hatás érdekében szükséges 12

13 és Tanács, 1996) a környezet általános terhelését csökkentő biodegradálhatóság között. (Európai A biodegradálhatóság a sebességi állandó és a felezési idő közötti összefüggést a következő egyenlet adja meg: k biodegradáció, talaj = ln 2/ DT 50 biodegradáció, talaj (DT: felezési diő) 1. sz. táblázat: Vízi ökoszisztémákban mért felezési idők biodegradációs tesztek alapján, a Kp (vegyi anyag szilárd víz fázis közötti megoszlási hányadosa) függvényében (GRUIZ, 2001). biodegradálhatóság: teszteredmény Sebességi állandó (1/nap) Felezési idő (nap) Könnyen biodegradálható 4, Könnyen, de nem 10 napon belül biodegradálható 1, Nehezen biodegradálható 4, Nem biodegradálható 0 2. sz. táblázat: Talajban és vízi üledékben mért felezési idők biodegradációs tesztek alapján, a Kp (vegyi anyag szilárd víz fázis közötti megoszlási hányadosa) függvényében (GRUIZ, 2001). Kp ( lit/kg) Felezési idő talajban = DT50 biodegradáció, talaj (nap) Könnyen biodegradálható Könnyen, de > 10 nap biodegradálható Nehezen biodegradálható > > stb. stb. stb. stb Szénhidrogén-bontó mikroszervezetek Régóta ismer tény, hogy bizonyos mikroszervezetek képesek a szénhidrogének lebontására, azok hasznosítására kizárólagos szénforrásként, ill. energiaforrásként (DAVIS, 1967). Nem egészen húsz évvel később már egyes szerzők a n-alkán, c-alkán, aromás és gáznemű szénhidrogének mikrobiológiai lebontásáról számolnak be, valamint vizsgálták a kőolajszármazékok sorsát a talajban és talajvízben, és a gyakorlati alkalmazások lehetőségeit (ATLAS, 1984). Egy szénhidrogén-bontó mikrobát két alapvető tulajdonság határoz meg: membrán-kötött, szénhidrogén-specifikus oxigenáz enzime, valamint a sejt és a vízoldhatatlan vegyület közötti kapcsolat kialakításának mechanizmusa (ROSENBERG & RON 1996). Ezen kívül azonban még több körülmény együttes megléte szükséges ahhoz, hogy ezek a vegyületek egy mikroszervezet anyagcseréjében szén-, ill. energia forrásként szerepeljenek (ld. 3. sz. táblázat). 13

14 3. sz. táblázat: Kőolajszármazékok biodegradációjához szükséges feltételek (ROSENBERG & RON, 1996) A. Mikroszervezet 1. Szénhidrogén-oxidáló enzim 2. Szénhidrogén molekulához tapadó képesség 3. Emulgeáló képesség 4. Deszorpciós mechanizmus szénhidrogénből B. Víz C. Oxigén D. Foszfor E. Hasznosítható nitrogén-forrás A nyers és a finomított kőolaj világszerte óriási méretű felhasználása, valamint a termékek sokfélesége miatt a szénhidrogének ma már egy fontos osztályát képezik a mikrobiális oxidáció potenciális szubsztrátjainak. Nem meglepő ezért, hogy szénhidrogén-oxidáló mikroszervezetek, a természetes szárazföldi és a vizes élőhelyek számtalan változatában, akár hévízforrásokban is, fellelhetőek (BAZYLINSKI 1989). Több tanulmány is rámutat az olajjal szennyezett területeken szénhidrogén-oxidálók magasabb arányára a teljes mikrobapopulációhoz képest. Eddig viszont nem sikerült összefüggést kimutatni a biodegradáló baktériumok száma, és a szennyezettség mértéke között (WALKER & COLWELL, 1976). Számos baktérium- és gombafaj képes szénhidrogén vegyületek lebontására. A folyamat specifitása összefügg a molekuláris oxigén szénhidrogénbe való beépítésére mutatkozó genetikai hajlammal, valamint néhány reakcióval, mely közti bomlástermékek keletkezéséhez vezet. Ezek a közti bomlástermékek később a sejtek számára hasznos energianyeréssel járó anyagcsere folyamatokban hasznosulhatnak. A különleges genetikai képesség az oxigenáz enzim vegyületspecifikusságában, valamint a biodegradációhoz szükséges enzimaktivitás indukálásának képességében expresszálódik. A fenti szempontok alapján az elmúlt évtizedekben szénhidrogénbontónak írták le a 4. sz. táblázatban feltüntetett mikroszervezeteket (ROSENBERG & RON, 1996; ASHOK et al., 1995; HARWATI et al., 2007; VOVERIENË et al., 2002; JOHNSON & HILL, 2003). 14

15 4. sz. táblázat: Gyakori szénhidrogén-bontó mikroszervezetek rendszertani csoportjai Taxon Taxon Értekezésemben részletesen foglalkozom a nemzetséggel a 2.5 és a 4.2 fejezetben. A genusz tagjainak szénhidrogén-bontó képességéről ma még nem sokat tud a tudomány. A szakirodalom részletes tanulmányozása után mindössze egy olyan publikációt. találtam, melyben egy faj szinten azonosítatlan izolátum metil-terc-butil-éter bontó képességéről számolnak be a szerzők (ZHANG et al., 2007) A biodegradációs eljárások csoportosítása A gyakorlati kármentesítések során alkalmazott biodegradációs eljárásokat a mikroszervezetek használata szerint két fő csoportra oszthatjuk. Az egyik fő csoportba a definiálatlan faji összetételű és tulajdonságú mikroszervezetekkel végzett technológiák tartoznak, amelyek további három alcsoportba sorolhatók: spontán biodegradáció vagy öntisztulás,, támogatott spontán biodegradáció és (ösztönös) talaj-, ill. talajvíz-oltás (SZOBOSZLAY 2002). A spontán biodegradáció (öntisztulás) során a szennyezett közegben megjelenő szénforráshoz alkalmazkodva (adaptálódva) a kárhelyen meglévő mikroszervezetek közül azok szaporodnak fel, amelyek képesek a szénhidrogén vegyületek hasznosítására. (McCLURE et al., 1989; NÜßLEIN et al., 1992; VAN DER MEER et al., 1998; WEBER et al., 1994). A szennyezés lassan és rossz hatásfokkal, magas koncentráció esetén pedig egyáltalán nem degradálódik. A folyamat végén gyakran nagy koncentrációjú (szennyezettségi határértéket 15

16 meghaladó) szénhidrogén vegyület marad a kárhelyen. Ez legtöbbször arra vezethető vissza, hogy a helyben lévő (bennszülött) mikroba populáció tagjai nem képesek a szennyező szénhidrogén vegyületek teljes spektrumát lebontani, abból csak a számukra viszonylag könnyen hasznosíthatóakat alakítják át. Ezen kívül limitáló tényezővé válhat (kimerül) a talaj ill. a felszín alatti víz szénhidrogén degradációhoz elengedhetetlen nitrogén-, foszfor-, káliumforrása (N, P, K) ill. elektron akceptor (pl. O 2, NO - 3, SO 2-4, CO 2, Fe 3+ ) szolgáltató képessége. A támogatott spontán biodegradációs eljárásokkal (biostimuláció) a talaj/talajvíz adott szénhidrogén bontó (CH-bontó) mikroszervezeteit tápanyag (N, P, K), nedvesség és főként oxigén vagy más, sejtlégzést támogató, fent említett elektron megkötő (redukálódó) anyagokat juttatnak a rendszerbe (BEDARD, 2003). Az oxigént nemcsak levegő áramoltatással vagy nyeletésével, hanem más anyagok pl. H 2 O 2 (hidrogén-peroxid)-nak a közegbe keverésével szokták pótolni. Ez utóbbi esetében semmi biztosíték sincs arra, hogy a H 2 O 2 a közegben kémiailag nem reagál az ott lévő szennyező anyagokkal vagy túlméretezett adagolás esetén nem tizedeli meg éppen a szénhidrogén bontó mikroba populációt. Különösen kevert (többkomponensű) szennyezések esetén a H 2 O 2 hatására, sok, részlegesen oxidált (átalakult) szerves vegyület keletkezhet, mind a szennyező anyagokból, mind a talaj adott szerves anyagából (humusz), amelyek egymással vagy a kiindulási anyagokkal reagálva ökotoxikológiailag kockázatos, időlegesen vagy véglegesen ellenőrizhetetlen és nehezen befolyásolható helyzetet teremthetnek a kárhelyen. Az (ösztönös) talaj- ill. talajvíz oltás során az adott kárhely mikroszervezetei közül kiemelik (pl. egy maréknyi szennyezett föld -del vagy laboratóriumi táptalajokon) azokat, amelyektől szénhidrogén-bontást várnak, majd lombikokban, tartályokban (fermentorokban) felszaporítják és visszajuttatják őket a talajba vagy talajvízbe (talaj-oltás vagy inokulálás), anélkül, hogy a mikroszervezetek tulajdonságait ténylegesen ismernék. A oltás vagy inokulálás azt jelenti, hogy valamilyen alkalmas technológiával, általában /ml élő sejtszámban mikroszervezeteket tartalmazó szuszpenziót (inokulumot vagy oltóanyagot) juttatnak a kezelendő közegbe. Az (ösztönös) talaj-oltás során a tápanyag, a nedvesség és oxigén kiegészítést is, rendszeresen alkalmazzák (SZOBOSZLAY 2002). Általában a támogatott spontán biodegradáció és a talaj- ill. talajvíz-oltások során gyakran ajánlanak, ill. alkalmaznak a szénhidrogén vegyületek biológiai elérhetőségét megnövelő szintetikus felületaktív anyagokat, detergenseket, amelyek emulgeálják ( oldatba viszik ) az apoláros, hidrofób vegyületeket. Ezek az anyagok többnyire szintetikus termékek és egyáltalán nem bizonyítottak környezetbarát tulajdonságaik, ill. a konkrét kárhelyeken való eredményes alkalmazhatóságuk. A biodegradáció során a mikroszervezetek is szintetizálnak ún. 16

17 biodetergenseket, amelyek segítik őket a szénhidrogén vegyületekhez való hozzáférésükben, (SZOBOSZLAY 2002). A biodegradációs eljárások másik fő csoportját a faj-szinten azonosított (identifikált), ismert tulajdonságokkal rendelkező, a kárhelyről vagy laboratóriumi törzsgyűjteményből származó mikroszervezeteket alkalmazó módszerek alkotják. Ezeket (tudatos) talaj- ill. talajvíz-oltásnak vagy bioaugmentációnak nevezik (MAYOTTE et al., 1996; DYBAS et al., 1998; WITT et al., 1999; ELLIS et al., 2000; SALANITRO et al., 2000; DYBAS et al., 2002; MAJOR et al., 2002; BEDARD, 2003; DA SILVA & ALVAREZ, 2004; QUAN et al., 2004). A felhasznált baktériumok lehetnek a kárhely szempontjából autochton, vagy allochton vadtípusú törzsek, vagy genetikailag módosított szervezetek (VAUTERIN et al., 1991). Bioaugmentáció az esetében megvan az esélye annak, hogy a talajba/talajvízbe juttatott, ismert tulajdonságú (pl. nem patogén, ismert szénhidrogén bontási spektrumú, szennyező anyag tűrésű), nagy számú ( élő sejt/g kezelt talaj) mikroszervezet viszonylag gyorsan és hatékonyan, sok esetben a helyi mikrobiota szénhidrogén bontó fajait háttérbe szorítva, elvégezze a kárhelyen a kívánt eredményű biodegradációt. A sikeres bioaugmentáció azonban nagymértékben függ a beoltott baktériumok viselkedésétől az új környezetben. Ezért az első kritérium a törzsek túlélése és megmaradása. A szaporodási rátájuk alacsonyabb lehet, mint mesterséges körülmények között, emellett még pédául különböző protozoák táplálékául is szolgálhatnak, ami tovább csökkenti a bevitt fajok sűrűségét (GOLDSTEIN et al., 1985; WATANABE at al., 1998). A sikeres bioaugmentáció másik kritériuma az inokulum megfelelő aktivitása. Több szerző szerint is, a célzott szennyezőanyag degradációjának csökkenése sok esetben az egyéb alternatív tápanyag források jelenlétének tudható be (BLUMENROTH et al., 1998; GOLDSTEIN et al., 1985; McCLURE et al., 1989; McCLURE et al., 1991; SCHMIDT et al., 1985; SCHWINDOLL et al., 1988). Fentiek miatt technológiai szempontból nagyon fontos a kárhely, a szennyezés összetételének, a használt mikroszervezetek származásának, tulajdonságainak a pontos ismerete. Emellett lényeges az oltás hatékonyságának a helyszíni nyomon követése a kármentesítés során (pl. a szénhidrogénbontó mikrobák számának és összetételének alakulása, a talajlégzés aktivitása, a szénhidrogén tartalom mennyiségi és minőségi változása), ill. az esetleges pótlólagos intézkedések megtétele (pl. a kiegészítő tápanyagok pótlása, a nedvességtartalom és az oxigén ellátottság javítása, a közeg újraoltása). A biodegradációs eljárások gyakran elérik a talajvíz-táblát is. Az módszerek esetében a leszivárgó csapadékvíz, a felszínen szétpermetezéssel, a talajba drénekkel vagy nyelető kutakkal visszavezetett talajvíz közvetve vagy közvetlenül a talajvíz-táblába juttathatja a szénhidrogénbontásra képes, helyben meglévő mikroszervezeteket. 17

18 Ezekben az esetekben, önmagában a nyeletett vízben megjelenő oxigén többlet is stimulálhatja a kétfázisú talajrendszer mikrobiális életét. Egyes vizsgálatok szerint pl. a o C hőmérsékletű talajvíz kitermelése, majd kilevegőztetéssel (sztrippeléssel) való tisztítása után a visszanyeletett vízben az oxigén koncentrációja 5-10-szerese is lehet az eredeti talajvízének. Bizonyos esetekben, - ha ezt a szennyezett talajvíz mikrobákra gyakorolt toxikus, gátló hatása már megengedi, - oltóanyagot, tápanyagokat, levegőt vagy oxigénképző vegyületeket (pl. H 2 O 2 ) is juttatnak a talajvíz táblába (SZOBOSZLAY et al., 2002) Biológiai monitoring A monitoring vizsgálat tárgya A felszín alatti környezetbe került szennyezőanyagok a talajban vagy a földtani közegben okoznak szennyezettséget, illetve a terjedési folyamatok által a felszín alatti és felszíni vizeket, a környezeti levegőt és az élő környezetet is veszélyeztethetik, károsíthatják. Ennélfogva a lehetséges szennyezőanyag terjedési útvonalak már a tényfeltárás kockázat felmérési fázisában felvett elméleti kockázati modell megalkotásakor kijelölik a monitoring során vizsgálandó környezeti eleme(ke)t, a monitoring vizsgálatok tágabb értelemben vett tárgyát. Az élettelen környezeti elemek (víz, levegő, földtani közeg) esetében a monitoring célja az alábbiak vizsgálata lehet: a szennyezőanyag koncentráció térbeli eloszlása, a szennyezőanyag koncentrációjának időbeli változása, a változásokat előidéző, illetve a változásokból eredően fellépő folyamatok mértékének és időbeli alakulásának nyomon követése (pl. bomlás- és anyagcseretermékek mérése, szorpció, hígulás, ioncsere, stb.), a folyamatok értékelése alapján prognózisok készítése. Az élő környezet monitoringja ezen túlmenően tartalmazhatja a szennyezettség élővilágra gyakorolt hatásának és a hatás változásának bemutatását és értékelését is (NÉMETH, 2003) Az élő környezet monitoringja, biomonitoring A környezetvédelmi gyakorlatban a biomonitoringot is használják a szennyezettség tényének megállapítására, illetve a szennyezés terjedésének vizsgálatára, de hazánkban ez az eljárás még nem 18

19 elterjedt. A biomonitoring célja a környezet állapotának megfigyelése és a környezet minőségének jellemzése. A biomonitoring segítségével a kockázatfelmérés során a felállított modell ellenőrizhető. A kémiai analitikával szemben a biológiai módszerekkel végzett vizsgálatokkal a tényfeltárás során figyelmen kívül hagyott (ismeretlen vagy régi eredetű) vagy együttesen előforduló kockázatos anyagok hatását is lehet mérni, megfigyelni. A laboratóriumi ökotoxikológiai tesztek a biomonitoring vizsgálatok legelterjedtebb módjai, amely vizsgálatok során a szennyezett területről származó talajminták extraktumaival, illetve közvetlen vízmintákkal végeznek hatásvizsgálatot a tesztorganizmusokon. Léteznek csak egy faj, vagy több faj egyedeit vizsgáló tesztek, és olyan vizsgálatok is, amelyek egy táplálkozási lánc egyes tagjait és a lánc egészét ért káros hatások becslésére alkalmasak (laboratóriumi, vagy terepi mikro-, mezo- vagy makrokozmosz tesztek). A terepi vizsgálatok esetén elképzelhető, hogy laboratóriumi körülmények között fenntartott kiválasztott fajok egyedeit, vagy a területen élő honos fajokat vizsgálják. A terepi vizsgálatok során vizsgálhatják a közösség összetételét és működését (kor eloszlás, egyedszám, egyedsűrűség, egészségi állapot, szaporodási ráta, stb.), valamint az életközösség genetikai jellegzetességeit (rezisztens fajok, genetikai jellemzők), a bioakkumulációt, biodegradációt és biomarkereket is. A biokoncentráció/biomagnifikáció monitorozásához az egyes élőlények, illetve táplálkozási láncok egymást követő tagjainak szöveteiben, vagy a kiválasztott testnedvekben felhalmozódott szennyezőanyag koncentrációt kell rendszeresen méréssel meghatározni. A biomarkerek monitoringja olyan jelző molekulák vizsgálatát jelenti, melyek környezeti hatásra jelennek meg válaszként a vizsgált szervezetben. A szennyezettség hatása az ökoszisztéma egyes tagjainak vagy részének tesztelése során nyert információkból, az ökoszisztéma egészére vonatkoztatott extrapoláció eredményéből ítélhető meg. A vizsgálat időtartamát tekintve akut, szubkrónikus és krónikus teszteket lehet megkülönböztetni. A biomonitoring vizsgálatokban előszeretettel alkalmaznak indikátorfajokat. A bioindikátor fajok egyes csoportjai a viselkedés, kor eloszlás megváltozásával jelzik a megváltozott környezeti körülményeket, míg mások olyan rezisztens fajok, melyek szennyeződés esetén előnybe kerülnek a többi fajjal szemben. Használhatók még bioindikátorként olyan fajok is, melyek sejtjeik szennyezőanyag-koncentrációjának változásával (biokoncentráció) tükrözik a biológiai hozzáférhetőség megváltozást, valamint olyanok, melyek nagy érzékenységüknél fogva elpusztulásukkal korai figyelmeztetőül szolgálnak. 19

20 Az ökológiai vizsgálatok során azonban tisztában kell lenni a korlátokkal. Például a szennyezőanyagnak tartósan kitett populáció tűréshatára jóval nagyobb a laboratóriumi körülmények között élő, illetve a szennyeződés által sohasem terhelt populációk toleranciájánál. Különösen igaz ez a toxikus nehézfémek esetén, mivel egyes fajok egyedeinél kialakulhat olyan szelekció, mely kisebb mértékű szennyezőanyag felvételt eredményez, vagy nagyobb szennyezőanyag felvétel mellett is normális növekedés és szaporodás tapasztalható (NÉMETH, 2003). Más definíció szerint környezet-monitoring céljára alkalmazott biológiai módszerek összességét értik biomonitoring alatt. Alapulhat egyetlen tesztorganizmust vagy életközösséget alkalmazó teszten, ilyenkor a környezeti mintát a laboratóriumba szállítás után vizsgálják. Alapulhat helyszíni, ún. biológiai vizsgálatokon (GRUIZ, 2001). Aktív biomonitoring során a kiválasztott fajok izoláltan és kontrolláltan felnevelt egyedeit helyezik a környezetbe, míg passzív biomonitoring esetén, a területen élő fajokat vizsgálják. Így: 1. a közösség összetételét és működését: fajösszetétel, fajsűrűség, érzékeny fajok kihalása, tápláléklánc, a teljes ökoszisztéma anyag- és energiaforgalma; 2. az életközösség genetikai jellegzetességeit: rezisztens fajok megjelenése, genetikai jellemzők, DNS ujjlenyomatok; 3. a bioakkumulációt; 4. a biodegradációt; 5. biomarkereket: stressz-fehérjék, metallotionein, citokróm P450. A biomonitoring előszeretettel alkalmaz bioindikátor fajokat: 1. őrző fajok: a vizsgált területre telepített, nagy érzékenységű fajok, amelyek elpusztulásukkal korai figyelmeztetőül szolgálnak; 2. detektor fajok: a vizsgált területen élő fajok, amelyeknek szennyezőanyag hatására megváltozik a viselkedésük, koreloszlásuk, esetleg elpusztulnak; 3. kiaknázó fajok: rezisztens fajok, amelyek szennyeződés esetén előnybe kerülnek a többi fajjal szemben. 4. akkumuláló fajok: felveszik és akkumulálják a szennyezőanyagot olyan mennyiségben, hogy a kémiai analízissel kimutathatóvá válik (GRUIZ, 2001). 20

21 Bioremediációs eljárások során a biológiai monitoring általában a kárhely mikroba populációjának változásainak vizsgálatát jelenti, beleértve felhasznált mikroszervezetek nyomon követését, visszaizolálhatóságát, valamint az esetleges fakultatív patogén baktériumok kontrollálását Polimeráz láncreakció (PCR) ) A polimeráz láncreakció (PCR: elve 1983 áprilisában, az északkaliforniai Kary Banks Mullis elméjében született meg,. A módszer elvét, egy gyakorlati eredmény bemutatásán keresztül, 1985-ben közölte le a magazinban (SAIKI et al., 1985.) Ettől az időponttól a PCR által, egy egyszerű elven alapuló, de zseniális technikával bővült a molekuláris biológia eszköztára. Ez a ciklikus, in vitro, enzimkatalizált, DNS-szintetizáló eljárás lehetőséget teremtett arra, hogy kimutatható szintre növeljék a vizsgálni kívánt DNS-szakaszt mennyiségét, lényegében megszüntetve így a DNS vizsgálatok mennyiségi korlátait. A módszer alkalmas a környezetben csak kis mennyiségben jelenlévő DNS amplifikálására, mely érzékeny detektálást tesz lehetővé. Például 100 db sejt kimutatása hagyományos módszerekkel, 1 g talajmintából nehézségeket okozhat. A 100 sejt egy bizonyos génjének ~10 6 nagyságrendben való amplifikálása azonban nagyban megkönnyíti a kimutatást (MAIER et al., 2000). A PCR egy viszonylag egyszerű enzimatikus reakciót jelent, mely DNS polimeráz enzimet használ a target DNS másolására, cikluson keresztül. A célszekvencia minden ciklus alatt duplikálódik, mely a DNS mennyiség exponenciális növekedéséhez vezet. Elméletileg egy 25 ciklusból álló reakció végén a kópiák száma 2 25, de a gyakorlatban csak kb szoros növekedéssel lehet számolni, ugyanis az amplifikáció hatékonysága nem tökéletes. Az amplifikáció végtermékét (amplikon, PCR termék) általában agaróz gél elektroforézis módszerrel teszik láthatóvá, az amplikon méretét standard DNS molekulákhoz (DNS marker, DNS létra ) hasonlítva lehet megbecsülni (MAIER et al., 2000). Az új módszer alkalmazásának következtében a publikációk száma e témában exponenciálisan növekedett ben a PCR motorja, a DNS-polimeráz enzim, elnyerte a Science magazin címét. E módszer kiemelkedő jelentőségének köszönhetően, Mullis 1993-ban kémiai Nobel Díjat kapott. Jelenleg az élettudományok szinte minden ágában, több mint kétszázezer tudományos közleményben alkalmazták az alapeljárásnak mintegy százféle speciális változataként ezt a technikát (DEZSŐ & NAGY, 2005). 21

22 A szokványos PCR reakció általában három lépésből áll. Az első lépés a denaturáció, mely során a kettős szálú target- vagy templát DNS (dsdns) két egy szálú molekulává (ssdns) válik szét. A reakcióhoz két kiválasztott, rövid, egy szálú DNS molekulát, azaz primereket adnak, melyeket hagyományos úton szintetizálnak. A primerek oligonukleotid szekvenciák, melyek bázissorrendje komplementer a target ssdns-hez, így azzal hibridizálnak, feltapadnak, meghatározva ezzel az amplifikálódó régiót. Az egyik primert forward primernek, a másikat reverz primernek hívják. Az elnevezés egyszerűen meghatározza, hogy az ssdns molekula melyik szálára tapadnak fel. A második lépés a primer feltapadás, mely a primerek hibridizációját jelenti a megfelelő célszekvenciához. A harmadik lépés az extenzió, ahol a DNS polimeráz enzim komplementer szálat szintetizál az eredeti ssdns-hez, a reakcióközegben lévő szabad nukleotid molekulák felhasználásával, a feltapadt primerektől elindulva. A ciklus végén az eredmény két kettős szálú DNS molekula lesz, mely az eredeti dsdns-sel teljesen megegyezik. A ciklusok ismétlése PCR amplifikációban exponenciálisan növeli az eredeti molekula másolatainak számát. Minden PCR ciklus kulcsa, hogy mindhárom lépés meghatározott hőmérsékleten és specifikus időintervallumban történjen. A megfelelő kópiaszám elérése érdekében a ciklusok általában szor ismétlődnek. Ezek a ciklusok automatizált thermocycler (PCR készülék) berendezésben történnek. A hőmérséklet a reakció kritikus eleme. A denaturációs ciklus nagyobb hőmérsékleten történik, mint a DNS olvadáspontja. A legtöbb PCR reakcióban ez 94 C 1-1,5 percig, mely garantálja a DNS molekula teljes denaturációját. A primer feltapadás alacsonyabb, általában C hőmérsékleten történik, 1 percig. Előfordulhat a primer feltapadása olyan szekvenciához, mely hasonlít a helyes célszekvenciához, de néhány hibás bázist is tartalmaz. Ilyenkor helytelen, ún. nem specifikus amplifikációról beszélünk, mely fals-pozitív reakciót eredményez. Minél magasabb a feltapadási hőmérséklet (Ta), annál specifikusabb a feltapadás, így a nem specifikus amplifikáció mértéke nagyban csökkenthető. Mindemellett a Ta növelésével a PCR érzékenysége csökken. Az extenziós lépés alapvető feltétele a polimeráz enzim, ilyen a Taq polimeráz, mely a templátnak megfelelően nukleotidokat köt a primerekhez. Az enzimet eredetileg a termofil baktériumból nyerték ki. A nagy hőstabilitása (akár 98 C) lehetővé teszi a több cikluson keresztül történő alkalmazását (MAIER et al., 2000). A specifikus DNS szekvencia sikeres amplifikációjának kritikus feltétele a primerek szekvenciájának megválasztása. Mint a génpróbák esetében is, a primer szekvenciára ismert DNS 22

23 szakaszokból lehet következtetni. A primer átfogó kiválasztását mindig a kutatás célja határozza meg. Ha egy fajra, vagy nemzetségre specifikus DNS szakasz detektálása szükséges, akkor kizárólag az unikális szakaszok megfelelőek az ennek megfelelő primerek tervezéséhez. Például az baktériumban a gén kódolja egy külső membrán-fehérje termelődését, és gén szekvenciájára tervezett primerek alkalmasak az specifikus kimutatására (JOSEPHSON et al., 1991). Egyes vizsgálatok ellenben olyan primereket igényelnek, melyek az ( eubaktériumokban konzervált szekvenciára lettek tervezve. Konzervált/konzervatív szekvenciáknak nevezik azokat a régiókat, melyek több baktériumfajban is hasonlóak vagy teljesen megegyeznek. Néhány konzervatív szekvencia pedig univerzális, vagyis egy nemzetségen belül minden fajban megtalálható. Például a gyakori (nitrogén fixáló) gén konzervált szekvenciájára ) tervezett primerek minden faj detektálására alkalmasak. Más univerzális szekvenciák, mint a 16S rdns (16S riboszómális RNS-t kódoló gén) viszont minden eddig ismert baktérium fajból kimutathatók. Mindezek ismeretében érthető, hogy a kísérlet célja mennyire meghatározza a célszekvenciát, amelyhez a primereket tervezni kell. A legtöbb primer általában bp hosszú, a két primer közti távolság a templát DNS molekulán pedig néhány 100 és néhány 1000 bp között alakul. A két primer közti távolság határozza meg az amplikon hosszát. Gél elektroforézissel, DNS markert alkalmazva hasonlítják össze a PCR termék elméleti hosszát az amplifikált szakasz valós méretével. Az amplifikált termék származásának további megerősítése génpróbákkal történhet, mely a PCR alapú kimutatás érzékenységét tovább növeli. Szintén alapvető követelmény, hogy a primerek tartalmazzanak olyan szekvenciákat, melyek megkülönböztetik őket egymástól, ezzel biztosítva, hogy különböző helyen tapadjanak fel a kromoszómán belül. Ha a primerek komplementer szekvenciákat tartalmaznak, akkor primer dimereket képezve egymással is hibridizálódhatnak. A legtöbb primernél ajánlott a magas (>50%) guanin-citozin (G-C) arány, mely a primer magasabb olvadási hőmérsékletét (Tm) eredményezi. A G-C párok ugyanis három hidrogén híddal kapcsolódnak egymáshoz, míg az adenin-timin (A-T) pároknál csak két ilyen kötés létesül (MAIER et al., 2000). Egy primer olvadási hőmérsékletének (Tm) kalkulálására a következő általános formula létezik: Tm = 4(G + C) + 2(A + T) o C. Ily módon a Tm alakulása közvetlenül függ a primer hosszától és nukleotid összetételétől. A feltapadási hőmérsékletet (Ta) általában célszerű 5 C-al a primerpár alacsonyabb Tm értéke alá helyezni (INNIS & GELFAND, 1990). 23

24 1996). 1994), Mint már az előző fejezetben szó volt róla, megfelelően tervezett primerekkel lehetséges a fajok ( vizsgálandó gén kimutatása gén a esetében). Másik hasonló példa lehet MARLOWE és munkatársainak (1997) munkája, akik génre specifikus primreket alkalmaztak tengervízből történő kimutatására. TSAI és mtsai (1993) az gén (β-d-glucoronidáz enzim termelődését kódoló gén) egy szakaszának amplifikálásához tervezetek primereket, szennyvízből és szennyvíz-iszapból történő kimutatásra. Mint az korábban szintén szerepelt már, a PCR alkalmas az eubaktériumokban konzervált, univerzális 16S riboszómális RNS génszekvenciájának detektálására is. A nevezett szekvencia külső régiói nagyon konzerváltak, míg a belső régiók egyedi fajbélyeget tartalmazhatnak egy bizonyos baktériumra nézve. Ezek a szekvenciák felhasználhatóak filogenetikai vizsgálatokhoz, melyek lehetővé teszik egy izolátum identifikálását. A 16S rdns szekvencia-analízis vizsgálat Ahol a kimutatni kívánt DNS nagyon kis mennyiségben van jelen, ott szükség lehet a PCR módszerének elterjedése nagy áttörést hozott a filogenetikai kutatásokban, mivel a módszer alkalmas környezeti minták teljes DNS állományának vizsgálatára, a baktériumok szeparált tenyésztése nélkül is (MAIER et al., 2000). technikák érzékenységének felerősítésére. Erre alkalmas speciális technika a nested (beágyazásos) PCR. Számos munkában alkalmaznak nested PCR-t, a kimutatási módszer érzékenységének növelésére. A módszer két amplifikációs reakcióból áll, ahol a második reakció templátja az első reakció amplifikációs terméke. A második PCR két indítószekvenciája az első PCR során amplifikálódott termék szekvenciáján belül helyezkedik el. A második amplifikációs lépésben használnak csoportspecifikus indítószekvenciákat (primereket) (LEE és univerzális indítószekvenciákat is (ALBANESE A termékek méretét tekintve, az első amplifikálás alatt felszaporított nagyobb DNS fragmentről a második lépésben egy kisebb, bennfoglalt szakaszt amplifikálnak (NAWA et al., 1993). Baktériumok környezeti kimutatásánál ez azt jelenti, hogy első lépésben felszaporítanak egy olyan általánosabb DNS szakaszt, amely minden baktériumban megtalálható. Ehhez univerzális primereket (ún. konszenzus primerpárt) használnak, amelyet a 16S rdns univerzális régióira terveztek. Ezek a külső primerek. A második lépésben a felszaporított fragmentről, a belső, specifikus primerpár segítségével amplifikálnak egy, a kimutatni kívánt baktériumfajra egyedien jellemző DNS szakaszt. 24