NAGY ÁTERESZTŐKÉPESSÉGŰ MOLEKULÁRIS BIOREMEDIÁCIÓS CENTRUM LÉTREHOZÁSA DR. KOVÁCS TAMÁS VEZÉRIGAZGATÓ-HELYETTES BUDAPEST,

Átírás

1 NAGY ÁTERESZTŐKÉPESSÉGŰ MOLEKULÁRIS BIOREMEDIÁCIÓS CENTRUM LÉTREHOZÁSA DR. KOVÁCS TAMÁS VEZÉRIGAZGATÓ-HELYETTES BUDAPEST,

2 A PROJEKT Az Enviroinvest Zrt és az MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont támogatást nyert a Norvég Alap Zöldipari Innováció programján. Összes költségvetés: 175 MFt; támogatás: 123 MFt Befejezési határidő: február A projekt célja egy olyan molekuláris biológiai laboratórium létrehozása, melyekkel megválaszolhatóak az alábbi kérdések:

3 MEGVÁLASZOLANDÓ KÉRDÉSEK 1. Jelen vannak-e az adott szennyezőanyag degradációjáért felelős mikroorganizmusok, ha igen, akkor megközelítőleg milyen arányban? Szükség van-e mikroorganizmusok inokulálására és/vagy tápanyagutánpótlásra? Olyan irányban folyik-e a kármentesítési folyamat, mint amilyenben szükséges? Milyen mértékben toxikus az adott szennyezőanyag a mikroflórára?

4 K+F: A PROJEKT ELEMEI Beruházás: Melléképület felújítása Illumina MiSeq újgenerációs DNS szekvenáló beszerzése Szuperszámítógép beszerzése CLC Genomics Workbench szoftver beszerzése Mintavételi protokoll kidolgozása Metagenom analízis Etidium-monoazid előkezeléses qpcr MFCDiagn Kidolgozott szolgáltatáscsomag validálása

5 MINTAVÉTELI PROTOKOLL Kim et al., FEMS Microbiol. Ecol., 2014:

6 METAGENOM-ANALÍZIS Mi a metagenomika? A DNS direkt (klónozás nélküli) izolálása környezeti mintákból. Vizsgálható a nem tenyészhető mikroorganizmusok jelenléte is. Jo Handelsman (2004): Metagenom a genomok összessége, mintha a közösség egyetlen szervezet lenne, és a genomok alkotnák a kromoszómáit, melyből a metagenom épül fel.

7 METAGENOM-ANALÍZIS A környezeti mintából izolálható baktériumok csupán 1%-a tenyészthető laboratóriumban

8 METAGENOM-ANALÍZIS Mi a metagenomika? A DNS direkt (klónozás nélküli) izolálása környezeti mintákból. Vizsgálható a nem tenyészhető mikroorganizmusok jelenléte is. Jo Handelsman (2004): Metagenom a genomok összessége, mintha a közösség egyetlen szervezet lenne, és a genomok alkotnák a kromoszómáit, melyből a metagenom épül fel.

9 METAGENOM-SZEKVENÁLÁS Célja: egy adott (környezeti) mintában meghatározni a mikroflóra összetételét Többféle megközelítés (shotgun, rrns) lehetséges Leggyakrabban a 16S rrns-t kódoló gén szekvenciája alapján történik

10 PCR ELVE Hajósné Dr. Novák Márta: Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

11 PCR REAKCIÓ Primertervezés: nagyon lényeges, csak validált primert használjunk (Primerek: rövid DNS szakaszok, melyek komplementerek a felszaporítandó DNS valamely szakaszával. A primerpár 2 tagja közé eső szakaszt amplifikáljuka PCR során). A projekt során standardizálni fogjuk a primertervezés elveit.

12 2-metil-naftalin (µg/l) 1-metil-naftalin (µg/l) 2,3-dimetilnaftalin (µg/l) 1,3-dimetilnaftalin (µg/l) 1,6,7-trimetilnaftalin (µg/l) 2,6,10-trimetilpentadekán (mg/l) 2,6,10,14- tetrametil- DNS TISZTÍTÁS Nehéz a gátlóanyagoktól megszabadulni KH-1 TR-1 TK-1 991,7 165,9 dha 1292,2 371,0 dha 1450,9 592,2 dha 774,3 205,8 dha 768,9 196,1 dha KH-1 TR-1 TK-1 20,1 5,7 dha 34,8 10,0 dha

13 DNS TISZTÍTÁS Nehéz a gátlóanyagoktól megszabadulni Negatív Negatív TK-1 TR-1 KH-1

14 DNS SZEKVENÁLÁS Leolvassuk az amplifikált DNS bázissorrendjét Lényeges a read-hossz Read: az adott szekvenálási technológia által megszakítás nélkül leolvasott, egymást követő nukleotidok száma

15 READEK A projekt célja egy molekuláris biológiai laboratórium létrehozása, mely alkalmas arra, hogy a szennyezett területek bioremediációja 132 karakter 25 karakterenként olvasva: ológiai laboratórium létr A projekt célja egy molek laboratórium molekuláris biológiai létrehozása, lab és így tovább 132 vagy több karakterenként olvasva: A projekt célja egy molekuláris biológiai laboratórium létrehozása, mely alkalmas arra, hogy a szennyezett területek bioremediációja

16 READ-HOSSZ Rövid read Hosszú read

17 READ-HOSSZ Rövid read-nél illeszteni kell, ekkor fennáll a tévedés lehetősége: nagyon hasonló szekvenciájú DNS molekulák keverékének szekvenálása történik. Hosszú readnél fizikailag kapcsolva van a variábilis régió egésze. Rövid readnél törzs vagy osztály szintű, hosszú readnél genus, de akár faj szintű azonosítás is lehetséges.

18 PLATFORMOK DNS SZEKVENÁLÁS: READ- HOSSZ Leghosszabb readdel a Roche 454 technológia rendelkezik. DNS szekvenálás: adatmennyiség Shot gun szekvenálás: A DNS-t random darabokra törjük Funkcionális információt nyerhetünk (pl. metabolizmusban résztvevő enzimeket kódoló génekről). Legtöbb értelmes adatot az Illumina technológia szolgáltatja

19 BIOINFORMATIKAI KIÉRTÉKELÉS Eredmény A minta mikroflóra-összetétele faj vagy genus szinten, %-os összetételben, illetve funkcionális adatok. Fontos a kiértékelő szoftver és a számítógép gyorsasága és memóriája

20 QPCR (ETIDIUM-MONOAZID ELŐKEZELÉSSEL) Megválaszolandó kérdés: egy adott baktériumfaj jelen van-e a mintában, ha igen, milyen mennyiségben, illetve milyen az adott szennyezőanyag lebontásáért felelős enzimeket kódoló gének relatív géngyakorisága. Olyan PCR reakció, melynek során valós időben monitorozzuk az amplifikált DNS mennyiségét (fluorescens festékkel).

21 QPCR (ETIDIUM-MONOAZID ELŐKEZELÉSSEL) A módszer előnye: gyors, nyomnyi mennyiségű baktérium kimutatására is alkalmas, kvantitálható. Hátránya: sok esetben nehéz a PCR gátló anyagoktól megszabadulni, validálni kell, a nem élő baktériumokból

22 QPCR (ETIDIUM-MONOAZID ELŐKEZELÉSSEL) Az etidium-monoazid csak az elpusztult sejtek károsodott membránján keresztül tud penetrálni. Kovalensen köt a DNS-hez, melynek gátolja a PCR reakcióban való amplifikációját. Eredmény: csak az élő sejtekből származó DNS-t fogjuk kimutatni.

23 Grafit Proton szelektív membrán Grafit MFCDIAGN e- metabolizmus + Anód cella Katód cella : mediátor

24 MFCDIAGN Az áramerősség μa-es (általában 1-4 μa) tartományban mérhető. 0,004 0,003 0,0035 0,0025 0,003 0,0025 0,002 0,002 0,0015 0,0015 0,001 0,001 0, Acinetobacter baumannii , Escherichia coli ,004 0,003 0,0035 0,0025 0,003 0,0025 0,002 0,002 0,0015 0,0015 0,001 0,001 0,0005 0, Salmonella Typhimurium Streptococcus pneumoniae

25 MFCDIAGN 0,004 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015 Nem toxikus E. coli gyep 0,001 0, ,004 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015 Enyhén toxikus 0,001 0, ,004 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015 0,001 Toxikus 0, óra 6 óra óra

26 ÖSSZEFOGLALÁS A metagenom szekvenálással meghatározhatjuk a minta mikroflóra-összetételét, és a taxonok egymáshoz viszonyított arányát A qpcr-el meghatárohatjuk a mintában az általunk kívánt mikroorganizmus mennyiségét, illetve meg tudjuk határozni a szennyezőanyag lebontásáért felelős enzimeket kódoló gének relatív géngyakoriságát. Az MFC Diagn alkalmas toxicitás-vizsgálatok gyors elvégzésére E molekuláris biológiai módszerekel megválaszolhatóak a

27 TOVÁBBI INFORMÁCIÓK Projekthonlap

28 KÖSZÖNJÜK A FIGYELMET!