SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST PCR. Vannay Ádám st Department of Pediatrics; vannay@gyer1.sote.hu

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST PCR. Vannay Ádám 2011. 1 st Department of Pediatrics; vannay@gyer1.sote.hu"

Alexandra Fehér
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 PCR Vannay Ádám 2011

2 Definíció A PCR során a DNS/cDNS egy relatív kis darabkáját sokszorozzuk meg.

3 Miért, illetve mire jó a PCR? Egyszerű Nagyon érzékeny Olcsó Klónozás Genotipizálás (szekvenálás, RFLP, allélspecifikus PCR) mrns expresszió meghatározása (real time RT-PCR)

4 Mi történik a PCR során

5 Kiindulási minta: DNS; mrns/cdns FR: A gének két végén elhelyezkedő, RNS-re át nem íródó DNS szakasz. Ez a DNS régió tartalmazza a gének promoterét. UTR: az mrns fehérjére át nem íródó szakasza. DNS mrns/cdns Fehérje

6 DNS, Plazmid, RNS izolálás Tiszta felület: DNS, RNS, Pazmid mentes, DNáz, RNáz - mentes felület és eszközök. Kesztyű, maszk, sapka, köpeny γ - és UV-besugárzás és rekombináns hő-instabil dupla szálú DNS specifikus DNase DNase AWAY Decontamination Reagent for DNA - Sigma-Aldrich RNaseZap RNase Decontamination Solution - Ambion

7 DNS, Plazmid, RNS izolálás

8 Reverz Transzkripció Puffer (5X) - 4 µl dntp (10mM) - 1 µl DTT (0,1M) - 2 µl Oligo dt (0,5 µg/ µl) - 1 µl 42 C, 50 min RNA 1 µg - 10 µl RNase inh (40 U/ml) - 1 µl H 2 O - 20 µl-ig

9 Hagyományos PCR Alacsony szenzitivitás Kis dinamikus tartomány Kis feloldóképesség Nem automatizálható Toxikus nyersanyagok (ethidium bromid)

10 Hagyományos PCR Puffer (10x) - 5µl dntp mix (2,5 mm) - 5µl MgCl 2 - (25mM )- 5µl Enzim - 0,5 µl S primer (10pmol/µl) - 1µl AS Primer (10pmol/µl) - 1µl DNS - 1µl H 2 O - 50 µl-ig Beállítandó ciklus 95 C 95 C 5 min 15 sec 72 C 95 C 50 C 30 sec 7 min 15 sec 4 C

11 Taq Polimeráz

12 Hagyományos PCR Kiértékelés 1) Futtatás, emésztés, szekvenálás 2) Denzitometrálás

13 Real Time PCR Real-time PCR során a reakció során keletkező fluoreszcenciát detektáljuk. A PCR termékek detektálhatóvá válásának ciklusa arányos a kiindulási mintában lévő templát DNS mennyiségével.

14 Real Time PCR Nincs post PCR procedura, komputerizált kiértékelés Nagyon gyors (25 min) Nagy dinamikus tartomány Sokkal érzékenyebb (1000 x kevesebb RNS-ből) Reprodukálhatóbb Real time monitorizálás Melting analízis

15 Real Time PCR Enzim mix - 10 µl S primer - 1 µl AS Primer - 1µl DNS - 1µl H 2 O - 20 µl-ig 95 C 95 C 5 min 5 sec 50 C 5 sec 72 C 10 sec 95 C 10 sec 45 C 10 sec 4 C

16 Real Time PCR Enzimek: extenzió 60 vagy 72 C, 5 exonuclease vagy Sybr green

17 Real Time PCR Jelölések Hydrolízis próba (TaqMan) Hibridizációs próba (FRET) DNS kötő festékek (Sybr Green)

18 Real Time PCR Hidrolízis próba: A próba egy riporter és egy quencher a riporter fluorescenciáját elnyelő fluorochrommal konjugált. Az amplifikáció során Taq polimeráz hidrolizálja a próbát. Ez azt eredményezi, hogy a próba riporter és quencher fluorochromja szeparálódik egymástól és a fluoreszcens jel detektálhatóvá válik.

19 Hibridizációs próba (FRET) Real Time PCR Az egyik próba a 3 végén egy donor a másik az 5 végén egy akceptor fluorochrommal jelölt. Amikor a fluorochromok elég közel kerülnek egymáshoz (1-5 nukleotid) a donor fluorochrom által emittált fény excitálja az akceptort ami aztán fluorescens fényt emittál.

20 Real Time PCR SYBR Green A fluoreszcencia mértéke abnormálisan megnő ha a festék dupla szálú DNShez köt.

21 Real Time PCR Előnyők hátrányok: TaqMan - FRET - Sybr Green TaqMan/FRET könnyű beállítani Sybr Green nehezebb beállítani FRET/ Sybr Green melting analízis TaqMan nincs melting analízis

22 Real Time PCR Kiértékelés 1) Ellenőrzés futtatás, emésztés, szekvenálás 2) Melting analízis 3) Ct meghatározás

23 Fluoreszcencia Fluoreszcencia Kiértékelés Melting: ne hidd el! A B Hőmérséklet ( C) Hőmérséklet ( C)

24 Kiértékelés ciklus (db) ciklus (db) DC T = target referencia = 4 DC T = target referencia = 2 Különbség =DC T - DC T = DDC T DDC T =4-2=2 A különbség 2 2, azaz 4x-es

25 Egyéb Belső kontroll Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Beta-actin MHC I Cyclophilin mrnas for ribosomal proteins (ribosomal protein, large, P0) 28S or 18S rrna Negatív kontroll (nyersanyagok tisztasága) Pozitív (technikai) kontroll (természetes/mesterséges)

26 Primer tervezés Primer Length: bp. This length is long enough for adequate specificity and short enough for primers to bind easily to the template at the annealing temperature. Primer Melting Temperature (Tm): primers with melting temperatures in the range of C generally produce the best results. Primer annealing temperature (Ta): primer melting temperature is the estimate of the DNA-DNA hybrid stability and critical in determining the annealing temperature. Too high Ta will produce insufficient primer-template hybridization resulting in low PCR product yield. Too low Ta may possibly lead to non-specific products caused by a high number of base pair mismatches. Ta = 0.3 x Tm(primer) Tm(product)

27 Primer tervezés Szoftverek segítik: DNA star: Primer 3 plus: LightCycler Probe Design2:

28 Primer tervezés DNS mrns

29 Primer tervezés asma tgctccagctatgtgtgaagaggaagacagcacagccctggtgtgcgacaatggctctgggctctgtaaggccggcttcgctggtgatgatgctcccagggctgttttcc catccatcgtgggacgtcccagacatcagggagtaatggttggaatgggccaaaaagacagctatgtgggggatgaagcccagagcaagagagggatcctgacgct bactin tgctccagctatggatgacgatatcgctgcgctggtcgtcgacaacggctccggcatgtgcaaagccggcttcgcgggcgacgatgctccccgggctgtattcccctcca tcgtgggccgccctaggcaccagggtgtgatggtgggaatgggtcagaaggactcctatgtgggtgacgaggcccagagcaagagaggtatcctgaccctgaagtacc gactin tgctccagctatggaagaagaaatcgccgcactcgtcattgacaatggctccggcatgtgcaaagccggctttgctggcgacgacgcccccagggccgtgttcccttcca tcgtagggcgcccccgacaccagggcgtcatggtgggcatgggccagaaagactcatacgtgggtgacgaggcccagagcaagaggggtatcctgaccctgaagta

30 Primer tervezés E1-E5 E8 VEGF 120 E1-E5 E6a E8 VEGF 144 E1-E5 E7 E8 VEGF 164 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 188 E6a E6b? E8 E1-E5 E7 VEGF 205

31 Primer tervezés E1-E5 E8 VEGF 120 E1-E5 E6a E8 VEGF 144 E1-E5 E7 E8 VEGF 164 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 188 E6a E6b? E8 E1-E5 E7 VEGF 205

32 Primer tervezés E1-E5 E8 VEGF 120 E1-E5 E6a E8 VEGF 144 E1-E5 E7 E8 VEGF 164 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 188 E1-E5 E6a E6b? E7 E8 VEGF 205 VEGFK/120/188/205 a VEGF minden izoformában közös szakasza E 5 E 8 E 6a E 7 E 6b VEGFK/144/164/205 a VEGF minden izoformában közös szakasza E 6a E 8 E 5 E 7 E 6b

33 Összegzés A PCR egy igen szenzitív módszer egy gén expressziójának vagy mutációjának vizsgálatára. Sarokpontok: A primer tervezésnél fontos, hogy pontosan tudjuk, hogy mit is akarunk detektálni. Helyes enzimválasztás. Körültekintő értékelés.

Hasonló dokumentumok

Új temékek az UD-GenoMed Kft. kínálatában!

Új temékek az UD-GenoMed Kft. kínálatában! Új temékek az UD-GenMed Kft. kínálatában! Műanyag termékek: SARSTEDT műanyag termékek teljes választéka Egyszer használats labratóriumi műanyag eszközök szövet és sejttenyésztéshez Vérvételi és diagnsztikai