Korszerű identifikálási módszerek a mikrobiológiai gyakorlatban

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Korszerű identifikálási módszerek a mikrobiológiai gyakorlatban"

Tamás Hegedűs
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 Korszerű identifikálási módszerek a mikrobiológiai gyakorlatban Mráz Balázs 1, Zoller Linda 1, Fodor Andrea 1, Szántó-Egész Réka 2, Tabajdiné Pintér Veronika 1 1 Wessling Hungary Kft. Mikrobiológiai Laboratórium FoodMicro 2 Biomi Kft.

1, Szántó-Egész Réka 2, Tabajdiné Pintér Veronika 1 1

2 Van-e benne...? Mennyi van benne? Salmonella Campylobacter Listeria monocytogenes Escherichia coli O157:H7 Enterobacteriaceae Escherichia coli Mezofil aerob mikroba Brochotrix thermosphacta Pseudompnas sp. Bacillus subtilis Tejsavbaktériumok Lactobacillus sp. Bifidobacterium sp. Élesztőgombák Hungalimentaria

Enterobacteriaceae Escherichia coli Mezofil aerob mikroba Brochotrix

3 Jelenlét kimutatás Szelektív/differenciáló tápközegek Műszeres vizsgálatok (PCR, VIDAS) Hungalimentaria

4 Hagyományos azonosítási módszerek, lépések Tiszta tenyészet készítése Mikroszkópos vizsgálat (sejtforma, mozgás) Gram-festés Biokémiai vizsgálatok Hungalimentaria

5 Kereskedelmi biokémiai tesztek Enterotube II (Enterobacteriaceae) ~80 baktérium Oxi/Ferm Tube II ~70 baktérium Oxidáz próba Pozitív Negatív Oxi/Ferm Tube II Anaerob glükóz hasznosítás Enterotube II Aerob glükóz hasznosítás Pozitív Negatív Pozitív Negatív Aeromonas spp., Plesiomonas shigelloides, Vibrio spp. Achromobacter spp., Alcaligenes spp., Bordetella bronchiseptica, Moraxella spp., Pasteurella spp. Enterobacteriaceae Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia Hungalimentaria

Negatív Aeromonas spp., Plesiomonas shigelloides, Vibrio spp. Achromobacter spp., Alcaligenes spp.

6 Kereskedelmi biokémiai tesztek BBL Crystal (GramPositive, E/NF, RG+, Anaerobe) ~450 mikroba API teszt ~600 mikroba Értékelés: pozitív/negatív,? Hungalimentaria

7 Genom szintű azonosítási módszerek, lépések Tiszta tenyészet készítése óra (Gram-festés) DNS alapú technikák Szekvenálás ~5-9,5 óra Ribotipizálás ~8 óra Hungalimentaria

8 Szekvenálás I. A DNS-t alkotó bázisok sorrendjének meghatározása a 16S rdns bp hosszúságú szakaszán PCR (1.): bp DNS fragment felsokszorozása Jelölő PCR (2.): ddntp beépítése Kapilláris gélelelektroforézissel történő szétválasztás Hungalimentaria

9 Szekvenálás II. Fluoreszcensz jel detektálása Összehasonlítás adatbázissal bázispár elhelyezkedés, hibák (N) helyzete/száma BLAST, RDP ingyenes MicroSeq library gyártói adatbázis ~2000 mikroba Hungalimentaria

10 Ribotipizálás I. Southern-blotting alapú molekuláris ujjlenyomat vizsgálata DNS emésztése restrikciós enzimekkel (EcoRI, PvuII) Fragmentek elválasztása gélelektroforézissel Fragmentek membránra vitele és rögzítése DNS jelölése Detektálás Adatbázisban szereplő mintázatokkal történő összehasonlítás ~1400 mikroba, ~7000 mintázat Akár törzs szintű meghatározás is lehetséges! Hungalimentaria

(EcoRI, PvuII) Fragmentek elválasztása gélelektroforézissel Fragmentek membránra vitele és

11 RiboPrinter Mintaelőkészítés ~30 perc/8 minta Teljesen automatizált folyamat Eredmény: 8 óra múlva Folyamatos üzemeltetés mellett egy munkanap alatt 32 minta futtatható. Hungalimentaria

12 Ribotipizálás elve I. Próba Törzs #1 Próba Törzs #2 Hungalimentaria

13 Növekvő fragment méret Mikrobiológiai Laboratórium - FoodMicro Ribotipizálás elve II. Törzs #1 Törzs #2 B D C B } D C Konzervatív fragmentek A E A E } Eltérés Azonos 16S szekvencia, eltérő RiboPrint TM mintázat Hungalimentaria

14 Adatbázis A folyamat végén a rendszer automatikusan létrehozza a RiboPrint TM mintázatot Konzervatív régió Az adatbázis folyamatosan frissül (ATTC, DSMZ, Riken) Felhasználás során automatikusan bővül+önállóan bővíthető Hungalimentaria

adatbázis folyamatosan frissül (ATTC, DSMZ, Riken)

15 Másodlagos csoportosítás RiboCsoport Amennyiben a hasonlóság >90% Forrás Mikroba azonosítása Hungalimentaria

16 Másodlagos csoportosítás RiboCsoport Amennyiben a hasonlóság >90% Az adatbázisban nem szereplő mikrobák is besorolhatók. Forrás Mikroba azonosítása Hungalimentaria

17 Köszönöm megtisztelő figyelmüket!

Hasonló dokumentumok

Hogyan segíti a MALDI-TOF MS az aerob baktériumok gyors species identifikálását. Kardos Gábor DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézet

Hogyan segíti a MALDI-TOF MS az aerob baktériumok gyors species identifikálását Kardos Gábor DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézet Módszerek Biokémiai profil csöves biokémia ID kitek (API, Cristal, Biolog,