AZ IBUPROFEN AEROB ÉS ANAEROB

Átírás

1 AZ IBUPROFEN AEROB ÉS ANAEROB MIKROBIÁLIS LEBONTÁSÁNAK VIZSGÁLATA HAGYOMÁNYOS TENYÉSZTÉSES ÉS MOLEKULÁRIS UJJLENYOMAT TECHNIKÁKKAL Készítette: Hatos Zsófia környezettudomány szakos hallgató 2012

2 Gyógyszermaradványok

3

4 Gyógyszermaradványok körforgása fogyasztó gyógyszerek szennyvíz felszín alatti vizek trágya talaj szennyvíztisztító telep felszíni vizek + szediment iszap tisztított víz

5 Ibuprofen élettani hatása (RS)-2-[4-(2-metilpropil)fenil]propánsav NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs metabolitok: hidroxi-ibuprofen, karboxi-ibuprofen, fenilpropionát 1,2-dihidroxi-ibuprofen, ibuprofenol, ibuprofenol-acetát, izobutilkatekol COX gátló prosztaglandin szintézis gasztrointesztinális vérzés vese- és májkárosodás ökotoxikológiai hatások akut és krónikus tesztek kockázatbecslés - 93/67EGK Európai Uniós Biztonsági Irányelv biodegradáció Nocardia sp. Sphingomonas sp. Trametes versicolor

6 Célkitűzéseink kísérleti rendszer gyógyszerek aerob és anaerob lebontása különböző közösségek biodegradációs potenciálja ibuprofen közösség átalakító hatása ibuprofent lebontó mikroorganizmus azonosítása

7 Kísérleti rendszer összeállítása [1] mintavétel: zöld növényi komposzt VÜSZI komposztáló telep eleveniszap Észak-pesti Szennyvíztisztító Telep rothasztott iszap - Észak-pesti Szennyvíztisztító Telep Duna iszap Soroksári Dunaág, parttól 5 m, 50 cm-es magmintavevő aerob és anaerob kísérletek sterilizált eszközök és vegyszerek hőlégsterilizáló, autokláv, égetés 3 párhuzamos mérés

8 Kísérleti rendszer összeállítása [2] AEROB: eleveniszap I, II; zöld növényi komposzt DSMZ 465 ásványi médium (teflon-szilikon kupakos 1 l-es Schott üvegekben) 50 ml inokulum eleveniszap I, eleveniszap II 73 mg/l és 300 mg/l ibuprofen koncentráció biotikus kontroll inokulum, ibuprofen abiotikus kontroll inokulum, ibuprofen hetente mintavétel, 2. kísérletnél naponta 1. kísérlet 1 hónapig; 2. kísérlet 2 hétig

9 Kísérleti rendszer összeállítása [3] Aerob eleveniszapos és zöld növényi komposztos kísérleti rendszer

10 Kísérleti rendszer összeállítása [4]

11 Kísérleti rendszer összeállítása [5] ANAEROB: Duna iszap (22 C); rothasztott iszap (35 C) Ramm médium (teflon-szilikon kupakos 1 l-es Schott üvegekben) 50 ml inokulum anaerob indikátorként 20 l 1%-os rezazurin oldat kupakok - méhviasz-paraffin keverékkel zárás biotikus kontroll inokulum, ibuprofen abiotikus kontroll inokulum, ibuprofen hetente mintavétel anaerob körülmények között

12 Vizsgálati módszerek {1} DUNA ISZAP ELEVENISZAP ROTHASZTOTT- ISZAP ZÖLD NÖVÉNYI KOMPOSZT

13 Vizsgálati módszerek {1} 2 kísérleti rendszer és tenyésztés DUNA ISZAP ELEVENISZAP szekvencia analízis T-RFLP klónkönyvtár DNS izolálás, PCR reakciók kémia ROTHASZTOTT- ISZAP ARDRA ZÖLD NÖVÉNYI KOMPOSZT

14 Vizsgálati módszerek {2} 2 kísérleti rendszer és szekvencia analízis ELEVENISZAP T-RFLP klónkönyvtár tenyésztés kémiai analízis kémia elektrospray ionizációs DNS izolálás, PCR reakciók LC-ESI-MS/MS BME - Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar folyadékkromatográfia kapcsolt tandem tömegspektrometria DUNA ISZAP ROTHASZTOTT- ISZAP ARDRA ZÖLD NÖVÉNYI KOMPOSZT

15 Kutatás lépései

16 Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Kémiai analízis eredményei (1) eleveniszap - átlag abiotikus aerob kontroll komposzt - áltag abiotikus aerob kontroll Mintavételek időpontja Mintavételek időpontja Duna iszap - átlag abiotikus anaerob kontroll rothasztott iszap - átlag abiotikus anaerob kontroll Mintavételek időpontja Mintavételek időpontja

17 Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Kémiai analízis eredményei (1) eleveniszap I eleveniszap - átlag abiotikus aerob kontroll >95%-os csökkenés zöld növényi komposzt 25%-os csökkenés komposzt - áltag abiotikus aerob kontroll Mintavételek időpontja Mintavételek időpontja Duna iszap rothasztott iszap %-os csökkenés Duna iszap - átlag abiotikus anaerob kontroll <5%-os csökkenés rothasztott iszap - átlag (szórás, abiotikus kontroll) abiotikus anaerob kontroll Mintavételek időpontja Mintavételek időpontja

18 Ibuprofen koncentráció [mg/l] Kémiai analízis eredményei (2) ibuprofen visszapótlás abiotikus kontroll eleveniszap II - átlag én indított eleveniszapos kísérlet kémiai analízisének eredményei

19 Ibuprofen koncentráció [mg/l] Kémiai analízis eredményei (2) eleveniszap I ibu. visszapótlás 400 >95%-os csökkenés hét alatt 5 napos lag fázis visszapótlás után 2 nap alatt abiotikus kontroll eleveniszap II - átlag én indított eleveniszapos kísérlet kémiai analízisének eredményei

20 Genusok jelenlétének realtív aránya [%] Tenyésztéses vizsgálatok eredményei Pseudomonas, Flavobacterium, Aeromonas, Comamonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Shewanella, Wautersiella spp. 60 Flavobacterium sp napi minta 1. kísérlet 21 db izolátum 6. napi minta 2. kísérlet 36 db izolátum Pseudomonas sp. Aeromonas sp. Comamonas sp. Stenotrophomonas sp. Acinetobacter sp. Shewanella sp. Wautersiella sp.

21 Genusok jelenlétének realtív aránya [%] Tenyésztéses vizsgálatok eredményei Pseudomonas, Flavobacterium, Aeromonas, Comamonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Shewanella, Wautersiella spp Flavobacterium sp. 50 Pseudomonas sp ,70 Aeromonas sp ,7 17,3 21,6 13 4,3 Comamonas sp. Stenotrophomonas sp. Acinetobacter sp. Shewanella sp napi minta 1. kísérlet 6. napi minta 2. kísérlet Wautersiella sp.

22 Klónkönyvtár eredményei kiindulási minta 6. napi minta % 42% Flavobacteria Sphingobacteria % 27% 18% 19% 19% Betaproteobacteria nem osztályzott, kitenyésztetlen Alphaproteobacteria % Gammaproteobacteria % 1% Planctomycetacia Spartobacteria 56 db klón 91 db klón

23 T-RFLP analízis eredményei [1] eleveniszap kiindulási minta eleveniszap 6. napi minta ibuprofennel kezelt (300 mg/l)

24 T-RFLP analízis eredményei [2] eleveniszap kiindulási minta eleveniszap 6. napi minta Na-acetátos biotikus kontroll

25 Ibuprofen koncentráció [mg/l] T-RFLP analízis eredményei [3] ibuprofen visszapótlás Irodalmi adatok abiotikus kontroll eleveniszap II - átlag Az ibuprofen lebontása egy Sphingomonas törzs által. (Forrás: Murdoch, R. W. Hay, A. G., 2005)

26 Összefoglalás ibuprofen lebontása csak aerob körülmények között jelentős eleveniszapban ibuprofen teljes eltávolítása 300 mg/l-es ibuprofen koncentráció mellett is voltak mikroorganizmusok, melyek szaporodtak és az ibuprofen általi szelekciós nyomás hatására a közösség domináns tagjává váltak T-RFLP és klónkönyvtár segítségével Sphingomonas sp. kimutatása

27 Jövőbeli célkitűzések komposzt további vizsgálata más szennyvíztisztító telepek és további környezeti minták közössége ibuprofen bomlástermékeinek detektálása funkciógének meghatározása Sphingomonas sp. kitenyésztése - egyéb gyógyszerek lebontásának vizsgálata a törzzsel a kísérleti rendszerben más gyógyszermaradványok biodegradációja

28 Köszönetnyilvánítás Mohr Anita - konzulens ELTE Mikrobiológiai Tanszék Környezettudományi Kooperációs Kutatóközpont Tóth Blanka BME, Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar

29 Köszönöm a figyelmet!

30 ~

31 Metabolitok /1/ ibuprofen karboxi-ibuprofen hidroxi-ibuprofen fenilpropionát Az ibuprofen humán metabolitjai (Forrás: Zwiener, C. et al., 2002)

32 Metabolitok /2/ ibuprofen 2-hidroxi-ibuprofen 1-hidroxi-ibuprofen 1,2-dihidroxiibuprofen Az ibuprofen lebontása egy Nocardia sp. által (Forrás: CHEN, Y. ROSAZZA, J. P. N., 1993) Az ibuprofen T. versicolor általi lebontási útvonala (Forrás: Marco-Urrea, E. et al., 2008)

33 Metabolitok /3/ Az ibuprofen lebontása egy Sphingomonas törzs által. a ibuprofen; b izobutilkatekol; c 5-formil-2-hidroxi-7metilokta-2,4-dienoik sav; d 2-hidroxi-5-izobutilhexa-2,4-dienedoik sav (Forrás: (MURDOCH, R. W. Hay, A. G., 2005)

34 Vizsgálati módszerek {1} kémiai analízis LC-ESI-MS/MS cél: ibuprofen koncentrációjának meghatározása BME - Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar mintaelőkészítés: homogenizálás, centrifugálás automatikus mintaváltóval direkt injektálás eluens: acetonitril, ammónium-acetát elektrospray ionizáció tripla kvadrupol analizátor MRM üzemmód m/z szerint szétválasztás

35 Vizsgálati módszerek {2} DNS izolálás cél: sejtalkotók és környezeti minta mátrixának eltávolítása és DNS kivonása a baktérium sejtekből közösségi minták Ultraclean Microbial DNA Isolation Kit tenyésztett törzsek - G-spin Genomic DNA Extraction Kit PCR reakciók cél: DNS szálak amplifikálása 16S rrns gén primerek: 27f, 27f-hex, 519r, 1492r, M13

36 Vizsgálati módszerek {3} T-RFLP terminális restrikciós fragmenthossz polimorfizmus cél: közösségi mintázatok léterehozása fluoreszcens primerrel jelölt DNS restrikciós endonukleázokkal emésztés detektálás kapilláris elektroforézisben közösségben elváló csoportok felismerése és osztályozása, populációk azonosítása, mikrobiális változatosság és környezeti tényezők közötti összefüggés feltárása

37 Vizsgálati módszerek {4} T-RFLP ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) elektrokinetikus injektálás Elválasztás: 30 perc, POP-4 polimer TAMRA 500, formamid GeneMapper v3.7 szoftver

38 Vizsgálati módszerek {5} ARDRA amplifikált riboszomális DNS restrikciós analízis PCR reakció restrikciós enzimekkel emésztés etanol precipitálás elválasztás agaróz gélelektroforézissel klónok, tenyésztett törzsek csoportosítása

39 Mikrobiológiai vizsgálatok {1} tenyésztéses vizsgálat és ei minták párhuzamosak összekeverése 3 x 1 ml + 27 ml fizsó hígítási sorozat 73 mg/l koncentrációjú ibuprofent tartalmazó R2A és nutrient táplemez 100 µl szélesztés tisztítási sorozat kolóniák izolálása DNS izolálás ARDRA - T-RFLP - szekvenciaanalízis

40 Mikrobiológiai vizsgálatok {2} közösségi vizsgálat minták: , 14., 16., 17., 19., 21. közösségi DNS izolálás [Ultraclean Microbial DNA Isolation Kit (MoBio)] PCR: 27f-hex-519r primerek restrikciós emésztés: Alu, Bsh etanol precipitálás T-RFLP analízis

41 Mikrobiológiai vizsgálatok {3} klónkönyvtár készítés és minták pgem-t Easy Vector Systemmel (Promega) r PCR, tisztítás, ligálás, transzformálás, tenyésztés, kék-fehér próba, klónok felszedése, M13 PCR ARDRA T-RFLP szekvenciaanalízis

42 Klónkönyvtár eredményei /1/ RDP Classifier internetes adatbázissal azonosítás klónkönyvtár készítése során kapott eredmények: db klón db klón genus szintű besorolás 500 bp tenyésztésbe nem vont törzsek kimutatása szennyvíztisztító telepekről izolálás kiindulási és 6. napi minta összehasonlítása diverzitás változás új osztályok megjelenése

43 Klónkönyvtár eredményei /2/ Csoportreprezentánsok % Azonosítás [RDP adatbázis] hasonlóság % Osztály (classis) [RDP adatbázis] Alu Bsh K-1 16 Flavobacterium sp. 100 Flavobacteria 235,94 102,37 K-3 9 Flavobacterium sp. 100 Flavobacteria 66,99 és 232,13 103,98 K-6 11 Pedobacter sp. 91 Sphingobacteria 67,4 106 K-8 2 Thauera sp, 100 Betaproteobacteria K-9 11 Sediminibacterium sp. 100 Sphingobacteria K Flavobacterium sp. 97 Flavobacteria 67,71 103,82 K-21 5 Zoogloea sp. 98 Betaproteobacteria 69, K-30 4 Bacteroidetes phylum 95 Flavobacteria 146, K-37 2 Flavobacterium sp. 100 Flavobacteria ,92 K-44 2 Simplicispira sp. 90 Betaproteobacteria 146, K-51 2 Hydrogenophaga sp. 90 Betaproteobacteria 69,97 193,7 K-5, kitenyésztetlen törzs P K-27 2,5 kitenyésztetlen törzs K-55 2,5 kitenyésztetlen törzs nem azonosítható

44 Klónkönyvtár eredményei /3/ Szekvenált Azonosítás hasonlóság Osztály (classis) % klónok [RDP adatbázis] % [RDP adatbázis] Alu Bsh K-1 37,4 Sphingobacteriales rend 97 Sphingobacteria 237,53 389,48 K-2 4,4 Zoogloea sp. 100 Betaproteobacteria 68,22 383,64 K-3 3,3 Comamonas sp. Betaproteobacteria 152,23 383,34 K-4 1,1 Prosthecobacter sp. 100 Spartobacteria 383,34 228,12 K-5 2,2 Thaurea sp. Betaproteobacteria 150,11 203,67-204,69 K-6 3,3 Pseudomonas sp. 100 Gammaproteobacteria 67,91 383,98 K-8 18,7 Sphingomonadaceae család 100 Alphaproteobacteria 206,65 92,14 K-9 4,4 Gammaproteobacteria osztály 94 Gammaproteobacteria 231,47 62,08 K-10 8,8 Acinetobacter sp. 100 Gammaproteobacteria 82,24 387,09 K-14 4,4 Chitinophagaceae család 95 Sphingobacteria 67,64 388,09 K-35 1,1 Achromobacter sp. 100 Betaproteobacteria 150,22 143,23 K-41 4,4 Comamonadaceae család 100 Betaproteobacteria 147,12 202,53-203,8 K-47 3,3 Planctomycetaceae család 97 Planctomycetacia 423,68 136,45 K-54 2,2 Methylotenera sp. 95 Betaproteobacteria 185,65 385,96 K-83 1,1 Xanthomonadaceae család 100 Gammaproteobacteria 242,

45 Klónkönyvtár eredményei /4/ Flavobacterium sp. 5% 3% 2% 2% 2% 2% 16% kitenyésztetlen törzsek "P" Flavobacterium sp. Pedobacter sp. 5% Sediminibacterium sp. 9% 13% Flavobacterium sp. nem azonosítható Zoogloea sp. 11% 9% kitenyésztetlen törzsek 1, 2 Bacteroidetes phylum Thauera sp, 11% 10% Flavobacterium sp. Simplicispira sp. Hydrogenophaga sp.

46 Klónkönyvtár eredményei /5/ Sphingobacteriales order 3% 4% 3% 3% 2% 2% 1% 1% 1% 37% Sphingomonadaceae family Acinetobacter Zoogloea sp. Gammaproteobacteria class Chitinophagaceae family 5% Comamonadaceae family Comamonas sp. 5% Pseudomonas sp. 5% Planctomycetaceae family Thaurea sp. 9% Methylotenera 19% Prosthecobacter sp. Achromobacter Xanthomonadaceae family