Mutáció létrehozása a Sinorhizobium meliloti baktérium phaa2 génjében

Átírás

1 Mutáció létrehozása a Sinorhizobium meliloti baktérium phaa2 génjében Készítette: ACKERMANN ANDREA Biológia-kémia szakos hallgató Témavezetı: Pálvölgyi Adrienn, Dr. Putnoky Péter Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék PÉCS,

2 Tartalomjegyzék 1. Irodalmi áttekintés Bevezetés Rhizobiumok A szimbiózis kialakulása A szimbiózis genetikai háttere Sejtfelszíni poliszacharidok Exopoliszacharidok Kapszuláris poliszacharidok Lipopoliszacharidok Gének a környezeti adaptációhoz A pha-gének 9 2.Célkitőzések Alkalmazott anyagok és módszerek Baktériumok és plazmidok A baktériumok növesztése Totál DNS izolálása Plazmid DNS izolálása Fragment izolálás DNS polimeráz láncreakció DNS ligálás és transzformálás Emésztés restrikciós endonukleázokkal DNS agaróz gélelektroforézis Transzpozonos mutagenezis Eredmények és megvitatásuk A pha2 génszakasz izolálása Mutagenezis PCR I fragmenttel A phaa2 mutánsok átklónozása konjugatív vektorba További eredményeink 24 5.Összefoglalás Irodalomjegyzék Köszönetnyilvánítás 29 2

3 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. Bevezetés A légköri nitrogén megkötése és ammóniává alakítása fontos szerepet tölt be az ökoszisztémában (Burns and Hardy, 1975). A talajba került szerves nitrogénvegyületek a lebontó szervezetek segítségével elıször ammóniává alakulnak. Ezt a folyamatot ammonifikációnak nevezzük. A nitrogénkötı baktériumok a légköri nitrogént megkötik és nitrogenáz enzim hatására, ammóniává redukálják. Az ammóniát a nitrifikáció folyamata során a talajban élı nitrifikáló baktériumok nitritté majd nitráttá alakítják. A nitrát denitrifikáció során újra nitrogéngázzá alakul át és visszakerül a Föld légkörbe, melynek 78%-át teszi ki. A növények számára felvehetı tápanyagforrás a baktériumok által megkötött, átalakított nitrogén (nitrát, nitrit, ammónia) ill. a szerves anyagok lebontásából származó kötött formában felvett nitrogén. A nitrogén megkötésére és átalakítására képes baktériumok az úgynevezett diazotróf baktériumok, amelyek között léteznek szoros kapcsolatot kialakító fajok is. Ezek növényekkel endoszimbiózist alakítanak ki, így biztosítva a nitrogén utánpótlást. Ilyen kapcsolat alakul ki például a pillangósvirágúak és a Rhizobium baktériumok között A rhizobiumok A rhizobiumok elnevezés egy győjtınév, amelybe több nemzetség, mint az Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Sinorhizobium, Rhizobium tartoznak. Ezen nemzetségek a Rhizobiaceae családba és Eubacteriales rendbe sorolhatók. A fent említett talajbaktériumok a szimbiózis révén képesek átprogramozni a növény differenciálódási és anyagcsere folyamatait. Az átprogramozás következtében a gazdanövény gyökérzetén új szerv, a szimbiotikus gümı alakul ki. A gümı védelmet biztosít a benne élı 3

4 baktériumok számára. A szimbiózisban résztvevı baktériumok tápanyagot kapnak, amiért cserébe a légköri nitrogént ammóniává redukálják. Ez a nitrogénforrás már felhasználható a növény számára A szimbiózis kialakulása A szimbiózis kialakulása összetett, molekuláris jelcserék sorozatának segítségével jön létre. Elıször a gazdanövény flavonoid típusú vegyületeket bocsájt ki a talajba (Redmond et al., 1986), amely a baktériumokban pozitív kemotaxist vált ki, ennek következtében a gazdanövény rhizoszférájában megnı a baktériumok száma. (Currier and Strobel, 1974). A fajspecifikus molekulaszerkezető flavonoidok (Bladergroen and Spaink, 1998) segítik a baktériumok nodulációs génjeinek (nod) kifejezıdését, aminek hatására a baktérium egy Nod faktort termel (Scultze et al., 1994). A Nod faktor indukálja a szimbiotikus gümı kifejlıdését a gazdanövény gyökerén. A gümı kialakulása a baktériumok behatolásával kezdıdik. A baktériumok a fertızési folyamat (invázió) során specifikusan tapadnak a gyökérszır sejtjeihez (Mills and Bauer, 1985). A megtapadást a növényi lectinek biztosítják (Diaz et al., 1989). Ezután a növényi gyökérszırsejt a megtapadt baktériumokkal ellentétes oldalon növekedésnek indul és a növekedés hatására, jellegzetesen meggörbül. A baktérium az enzimjeivel a sejtfalat feloldja és újonnan kialakuló belsı, csıszerő képletet hoz létre, ez az infekciós fonal. Az infekciós fonalon keresztül jutnak el a baktériumok a gyökérszırsejt belsejébe, majd késıbb a gümısejtekbe, ahol a növényi sejt citoplazmájába endocitozissal lépnek be. A fertızési ponttól több sejtrétegnyi távolságra az osztódóképes sejtek egy részébıl kialakul a gümıprimodium, amibıl a gümımerisztéma fejlıdik ki. Néhány nappal késıbb mikroszkóppal már jól látható a kialakuló gümı ill. az infekciós fonalhálózat, amelyen keresztül tömegesen jutnak a baktériumok a gümısejtbe. A gümı kéregrészében húzódó szállítónyalábokon keresztül jutnak a gümısejtekig a kész, szerves tápanyagok ill. a gümıbıl, ezen keresztül szállítódik a növénybe a megkötött nitrogén. 4

5 Egy vagy több baktériumot növényi sejtmembrán vesz körbe, lefőzıdnek és a sejtbe bejutva vezikulumként jelennek meg (Mellor and Werner, 1987). A peribakteriális membránnal rendelkezı baktériumok osztódásnak indulnak. Az osztódás következtében fellépı fiziológiai és morfológiai változások hatására bakteroiddá alakulnak, majd megindul a nitrogenáz enzimkomplex kódoló régiójának expressziója. (Newcomb, 1981) A szimbiózis genetikai háttere A szimbiózis kialakulásához számos bakteriális és növényi gén összehangolt mőködésére van szükség. Ennek elengedhetetlen feltétele egy állandó kommunikáció a partnerek között. A szimbiózist kialakító gének tanulmányozásához hatékony génátviteli rendszerre és szimbiózisban hibás mutánsokra van szükség. Megjelenésüket tekintve a mutánsok két csoportját különböztethetjük meg. Azon mutánsok, amelyek a nodulációs (nod) génekben hibásak, azaz nem képesek a gümıt létrehozni, Nod mutánsoknak nevezzük. Ugyanis a Nod faktornak fontos szerepe van a szimbiotikus gümı kialakításában. Hatására a gyökér belsı kéregsejtjei között egy új osztódószövet, a gümımerisztéma alakul ki (Dudley et al., 1987), valamint a gyökérszırök görbülését (Catoira et al., 2001) és az infekciós fonal növekedését is elıidézi (Gage and Margolin, 2000). A mutánsok másik csoportjánál a gümı ugyan kifejlıdik, de képtelen a légköri nitrogént megkötni (Fix - mutánsok). Az érintett géneket fixációs géneknek (fix) nevezték el. Az elmúlt évtizedekben több rhizobiumnak is elkészült a kromoszómatérképe. Az elkészült kromoszómatérkép alapján megfigyelték, hogy egyes rhizobiumok genomjában gyakori a 1000 kilobázis (kb) nagyságot is meghaladó plazmid. A vizsgálatok során az is kiderült, hogy egyes baktériumokban a nod és fix gének egy része extrakromoszómálisan helyezkedik el Sejtfelszíni poliszacharidok 5

6 A rhizobiumok sejtfelszíni poliszacharidjai kulcsfontosságú szereppel bírnak a szimbiózis kialakulásának több lépésében is. A poliszacharidok fı feladata a baktériumok védelme a külsı környezeti hatások ellen, de a felismerésben is jelentıs funkciót töltenek be (Reuhs et al., 1998). A baktériumok sejtfelszíni poliszacharidjainak három típusát különítjük el. Ezek a lipopoliszacharidok (LPS), a kapszuláris poliszacharidok (KPS vagy CPS) és az exopoliszacharidok (EPS) Exopoliszacharidok A sejtfelszíni poliszacharidok elsı csoportja az exopoliszacharidok, melyeket a baktérium a környezetébe szekretál. A különbözı felszínekhez való tapadást segítik elı és megvédik a baktériumot a környezeti stressz ellen. Az exopoliszacharidok a szimbiotikus kapcsolatok létrejöttét, a gümı normális fejlıdését és az infekciós fonal kialakulását biztosítják.(cheng and Walker, 1998; Gonzáles et al., 1998). A Sinorhizobium meliloti hét glükóz és egy galatózmolekulából felépülı szukcinoglükánt választ ki a környezetébe (Reuber and Walker, 1993), ami az EPS I heteropolimer (savas EPS) része (Fraysse et al., 2003). A molekula alegységein szukcinil, acetil és piruvil oldalláncok fedezhetık fel, amelyek savas tulajdonságot kölcsönöznek a molekulának. Ismeretes egy másik típusa is az exopoliszacharidoknak: az úgynevezett EPS II, mely glükóz és galaktóz tartalmú diszacharid egységekbıl álló galaktoglükán. 6

7 Kapszuláris poliszacharidok A poliszacharidok második csoportját a kapszuláris poliszacharidok (KPS) adják. A baktériumsejtet körülvevı KPS védelmet nyújt mind a bakeriofágok, mind az abiotikus tényezıkkel szemben. A KPS szorosan kötıdik a baktériumsejt felszínéhez, ezért erıs immunogéneknek tekinthetjük, a K-antigén elnevezést kapta. Rhizobiumban elsıként a S. fredii USDA205 és a S.meliloti 41 törzsébıl R.Carlson mutatta ki (Reuhs et al., 1993). Felfedezték, hogy az EPS és a KPS helyettesíthetik egymást az invázió folyamatában. Vagyis, ha nem termelıdik exopoliszacharid, akkor is szimbiózis kialakítására képes a baktérium. Ilyen baktériumtörzs a S. meliloti 41 törzs exob mutánsa. ( Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990).Ugyanis ez a rhizobium olyan rhizobiális kapszuláris poliszachariddal (KPS) rendelkezik, amely a hiányzó exopoliszacharidot pótolta Lipopoliszacharidok Az utolsó sejtfelszíni poliszacharid csoport a lipopoliszacharidok. Lipopoliszacharidok a Gram-negatív baktériumok sejtfelszínét alkotják, a külsı membránhoz kapcsolva fordulnak elı és szerkezetileg három különbözı egységre osztjuk (Reuhs et al., 1998): a külsı foszfolipid membránba ágyazott lipida, a hozzákapcsolódó core oligoszacharid rész és az ismétlıdı oligoszachadid egységekbıl álló O-antigén (Kannenberg and Brewin, 1994). Habár a S. meliloti törzs LPS mutánsai a szimbiózisra képesek, mégis a szimbiózis kialakulása lassabban megy végbe, mint a vad típusú baktériumoknál (Lageres et al., 1992). Elıfordulnak olyan rhizobium fajok, amelyeknél az LPS kulcsfontosságú a szimbiózis kialakulásában (Kannenberg and Brewin, 1994). De léteznek olyan baktériumok is, mint például a S.meliloti 41 törzse, ahol az LPS nem játszik szerepet a szimbiózisban. 7

8 Gének a környezethez való alkalmazkodáshoz Vannak olyan gének, amely egyértelmően a környezethez való alkalmazkodást segítik elı a szimbiózisban és szimbiózison kívül. A gének meghibásodása a mutáns fertızıképességét csökkenti. Két ilyen géncsoportot is ismerünk, amelyek a környezethez való adaptációt segítik. Ezek közül az egyik az ndvab, melyrıl bebizonyosodott, hogy szerepük van a növény-baktérium kapcsolat létrejöttében. Ezeket a géneket az Agrobacterium kromoszómális virulenciagénjein keresztül azonosították (chvab). Ha a géncsoportot elrontjuk, akkor a S. meliloti Inf mutánsokat ad, és nem képes termelni erre a baktérium családra jellemzı ciklikus ß-1,2-glükánt. Ez a molekula a periplazmatikus térben jelenik meg nagy koncentrációban. Az ndvab géncsoport által kódolt fehérjék közül az NdvB a ciklikus ß-1,2-glükán szintézisében, míg az NdvA a transzportban vesz részt. Dylan és munkatársai izoláltak ndv mutánsokból olyan pszeudorevertánsokat, amelyek visszanyerték ozmotikus alkalmazkodó- és szimbiotikus képességüket, mégsem termeltek ß- glükánt. Ez azt mutatja, hogy a fertızéshez nem a ß-glükán jelenléte a szükséges, hanem a baktérium megfelelı adaptációja ahhoz, hogy el tudja viselni az infekciós fonalban uralkodó fiziológiai körülményeket (Dylan et al., 1990b) A pha gének A másik, környezethez való alkalmazkodásban és szimbiózisban egyaránt fontos géncsoport a pha géncsoport. A S. meliloti kromoszómáján található egy fix-mutáció, amely az inváziót szintén gátolja (Putnoky et al., 1988). Ennek segítségével azonosították a pha régió phaabcdefg génjeit. A fix-2 géncsoportnak a növényi invázióban betöltött szerepe nyilvánvalóvá vált, amikor igazolták, hogy a pha génekben mutáns baktérium képtelen behatolni a létrejövı gümı belsejébe. A másik meghatározó felismerés a gén funkciójának megértése szempontjából az, hogy a mutáns baktériumok K + ionra érzékenyek. A K + érzékenység lúgos környezetben erıteljesebbé válik, 8

9 vagyis ezek a gének is a környezethez való adaptációban játszanak kulcsfontosságú szerepet. A fiziológiai kísérletek alapján valószínősíthetı, hogy ezek a gének egy K + -efflux rendszer felépítését határozzák meg (Putnoky et al., 1998). Kísérleti körülmények között a mutánsokra már 10 mm KCl is letálisnak hatott, míg a kontroll sejtek akár 500 mm KCl koncentrációnál is osztódásra képesek voltak. A kísérleti tapasztalatok arra utalnak, hogy a mutáns baktériumok hibásak valamilyen K-transzportot érintı ill. a környezet kémhatásához való alkalmazkodást kialakító és elısegítı mechanizmusban. Ez a génszakasz a pha elnevezést kapta, amely egyben utal a funkciójára, ami nem más, mint a phadaptáció. Kísérletek eredményei alapján azt feltételezik, hogy a pha géneknek a K-transzportban van szerepe és feltehetıen transzmembrán fehérjéket kódolnak. A feltételezés bizonyításához alkalikus foszfatáz (phoa) transzlációs fúziókat kellett megalkotni TnphoA transzpozon segítségével. A fehérjék szerkezetét akkor ismerték meg, amikor meghatározták a régió nukleotidszekvenciáját és a TnphoA fúziós pontok szekvenciáját. A pha gének fizikai-genetikai vizsgálatai megmutatták, hogy hét cisztronból épülnek fel (phaabcdefg), amelyek feltételezett termékei transzmembrán doméneket hordozó fehérjék. A régió által kódolt leghosszabb fehérje a PhaA, ez 17 domént, amíg a PhaD fehérje13 transzmembrán domént tartalmaz. Az iontranszport-kísérletek arra mutattak rá, hogy a géncsoport valóban egy ph szabályozásban szerepet játszó K + -efflux rendszer elemeit kódolja, amely valószínőleg egy K + /H + antiporter (Putnoky et al., 1998). A transzport folyamatok vizsgálatának kezdeti eredményei kimutatták, hogy azon hibás baktériumokban, ahol csak a K + transzport sérült a Na + forgalom változatlan maradt. Vad típusú S.meliloti esetében megfigyelték, ha a környezet lúgos ph-értéket vesz fel, akkor a sejtek belsı phja is a lúgos tartomány felé tolódik el, ezért a sejt a környezetébıl protonokat vesz fel és növeli a belsı H + -koncentrációt, ezzel helyreállítva az optimális belsı ph-értéket. Cserébe a sejt K + ionokat ad le a környezetébe, ezzel biztosítva az ionegyensúlyt a sejt külsı és belsı oldalán. Ez az ioncsere 9

10 a pha gének által kódolt K + /H + antiporteren keresztül megy végbe, ezért a pha génekben mutáns baktériumok esetében ez a mechanizmus sérül. A teljes S. meliloti 1021 genom nukleotidszekvenciájának meghatározása alapján egy további pha géncsoportot azonosítottak, mely a pha2 ( phaa2 B2 C2 D2 E2 F2 G2) elnevezést kapta. Ezen gének feltételezhetıen a S.meliloti 41 törzsben is fellelhetık, azonban bizonyíték erre még nem volt. 1. ábra: S.meliloti 1021 törzs pha2 régiójának felépítése. A fent említett alegységek szekvenciája hasonlóságot mutat még a Bacillus subtilis Na + /H + antiporter elemeinek szekvenciájával (Hamamoto et al., 1994; Krulwich et al., 1994; Seto et al., 1994). Ugyancsak hasonlóság figyelhetı meg a PhaA és PhaD fehérjék valamint az eukarióták NADH-ubiquinon oxidoreduktáz (komplex I) a mitokondrium genomjában kódolt ND4 és ND5 alegységei között. A komplex I-nél úgyszintén hét alegység különíthetı el a membránban, úgy ahogy a Pha komplex esetében (Friedrich et al., 1995). Minthogy mindkét esetben a funkció protontranszlokáció és a nagyobb alegységek homológok, feltételezhetjük, hogy a komplex I membránba ágyazott része egykoron antiporterbıl alakult ki (Friedrich and Weiss, 1997). A pha1 és pha2 géncsoport által kódolt fehérjék nem mutatnak erıs homológiát, és mutánsaik fenotípusai is azt bizonyítják, hogy e két géncsoport eltér egymástól. Az Agrobacterium tumefaciens c58 teljes DNS-szekvenciájának meghatározása alapján fedezték fel, hogy ebben a baktériumban is két pha géncsoport található. A két géncsoport több más baktériumban is elıfordul. A fehérjeszekvenciák összehasonlítása alapján ezek nem rendezhetık a funkciót tükrözı, két elkülönülı csoportba, de feltételezhetı, hogy bármely baktériumban megjelenı egyik pha géncsoport egy Na + /H +, míg a másik egy K + /H + antiporter kialakulásáért 10

11 felelıs. A pha gének különbözı baktériumokban való megjelenéséért feltehetıen a horizontális géntranszfer felelıs (Koonin et al., 2001). 11

12 2. CÉLKITŐZÉS Feltételeztük, hogy a S. meliloti 41 törzsben is megtalálható a pha2 géncsoport, és az egy Natranszportban szerepet játszó komplexet kódol. Munkánk célja az volt, hogy 1) Polimeráz láncreakció (PCR) segítségével igazoljuk a pha2 gének jelenlétét az S. meliloti 41 törzsben. 2) Izoláljuk a phaa2 szekvenciát és elkészítsünk egy olyan plazmid konstrukciót, amely segítségével létrehozható a phaa2 génben hibás baktérium. A mutáns vizsgálatával a késıbbiekben elvégezhetık a feltételezett funkció igazolására tervezett fiziológiai kísérletek. 12

13 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Baktériumok, plazmidok Munkánk során használt baktériumok és plazmidok jellemzıit az 1. táblázat tartalmazza. 1. táblázat: Baktériumok, plazmidok TÖRZS JELLEMZİK FORRÁS Sinorhizobium meliloti RM 41 S.meliloti vad típusa (Exo +, Nod +, Fix + ) Szende K. Escherichia coli PP4349 XL1Blue pbsecorv/t::pcri. pha2 Amp R Ez a munka PP4350 XL1Blue pbsecorv/t::pcri. pha2 Amp R Ez a munka AA4460 XL1Blue pbsecorv::pha2 PCRI::Km(F-779) Ez a munka Km R, Amp R AA4461 XL1Blue ppag160ecori-kpni::pha2 PCRI Ez a munka (AA4460)::Km(F-779) Km R, Spc R AA4462 XL1Blue pbsecorv::pha2 PCRI::Km(F-779 Ez a munka Km R, Amp R AA4463 XL1Blue ppag160ecori-kpni::pha2 PCRI Ez a munka (AA4462)::Km(F-779) Km R, Spc R PP4430 XL1Blue pbsecorv::pha2 PCRI Amp R Ez a munka XL1Blue Plazmidok RecA1, enda1, gyra96, thi-1, hsdr17, supe44, rela1, lacz M15 Tc R Bullock et al., 1987 pbs Klónozó vektor Amp R Stratagen, USA ppag160 Konjugatív vektor, psem155 származéka Str R / Sp R Transzpozon származék Papp Péter ET-Kan R -3 Mu Entarnceposon - Kan R 3 (F-779), TGS-II.kit FINNZYMES, Fi 13

14 3.2. A baktériumok növesztése A S.meliloti törzseket TA (Orosz et al., 1973) 32 C-on (Kiss et al., 1979), míg az Escherichia coli baktériumokat LB (Sambrook et al., 1989) tápközegben 37 C-on növesztettük. A táptalajokhoz megfelelı koncentrációjú antibiotikumot adtunk ( 2. táblázat). 2. táblázat: Alkalmazott antibiotikumok és koncentrációjuk (µg/ml) Antibiotikum E.coli S.meliloti Ampicillin Kanamicin Spectinomycin Totál DNS izolálása 1,5 ml egész éjszakán át növesztett baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük és 300 µl TE oldatban (50 mm TrisHCl, 20 mm EDTA, ph 8,0) szuszpendáltuk fel. 100 µl 5 % SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 µl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk hozzá. 1-3 órás 37 C-os inkubálás után 500 µl fenollal ráztuk össze, majd centrifugálás után a felülúszót Eppendorf-csıbe pipettáztuk át. 500µl fenol:kloroform oldattal (25 térfogat fenol:24 térfogat kloroform:1térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze. Centrifugálás után a felülúszóhoz 500 µl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform:1 térfogat izoamil-alkohol) adtunk, összeráztuk és ismét lecentrifugáltuk. A vizes fázisból a DNS-t 2térfogat etanollal kicsaptuk. A kocsonyás csapadékot új, 500 µl 70%-os etanol tartalmú Eppendorf csıbe tettük át. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítva, a DNS csapadékot 100 µl steril desztillált vízben oldottuk fel (Meade et al., 1982). 14

15 3.4. Plazmid DNS izolálása 3-3 ml folyékony LB táptalajba a megfelelı antibiotikum jelenlétében egész éjszaka növesztett sejtekbıl Ish-Horowicz és Burke módszer szerint alkalikus lízissel preparáltuk (Ish- Horowicz and Burke, 1981). 1,5 ml felnövesztett baktériumkultúrát Eppendorf csıben 20 másodpercig centrifugáltuk, majd a leülepedett sejteket 100 µl TEG oldatban (50 mm glükóz, 25 mm Tris, 10 mm EDTA, ph 8) felszuszpendáltuk. A feltárást 200 µl NS oldat (0,2 N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük, majd óvatosan összekevertük. A mintákat 5 percig 0 C-on inkubáltuk és 160 µl NaAc (3 M NaAc, ph 4.8) bemérése után erıteljesen összeráztuk, amíg pelyhes csapadék keletkezett. Ezt követıen megismételtük az elıbbi inkubálást. A kivált SDS-es csapadékot lecentrifugáltuk 5 percig, majd a felülúszót (kb. 400 µl) i-propanollal csaptuk ki. Újabb 5 perces centrifugálás után a csapadékot 75%-os etanollal mostuk és szárítottuk. Ezt követıen a csapadékot 100 µl TRIS-Ac oldatban (50 mm Tris, 100 mm NaAc, ph 8.0) feloldottuk, majd 200 µl 96% etanollal ismét kicsaptuk. Ezt követıen 5 percig 0 C-on inkubálátuk, majd lecentrifugáltuk. A centrifugálást követıen a csapadékot az elızıhöz hasonlóan mostuk, szárítottuk. Az így maradt DNS-t 30 µl RNase ( µg/ml) enzimet tartalmazó steril desztillált vízben feloldottuk Fragment izolálás Az izolálni kívánt fragmenteket agaróz gélelektroforézis segítségével választottuk el. Alacsony feszültségen hosszan futtatott fragmentek elé a gélbe Whatman DE 81 papírt helyeztünk, amit elızıleg sterilen méretre vágtunk. Ezek után 20 percig 60 V feszültség mellett az elektroforézis során a fragment a papírra futott rá. A papír óvatosan eltávolítottuk a gélbıl, Eppendorf csıbe helyeztük és a DNS-t kétszer egymás után 50 µl 1 M NaCl oldattal kimostuk a papírból. A DNS kicsapása 0,1 tf 3 M Na-acatát oldattal (ph 7.0) és 0,6 tf izo-propanollal történt. A csapadékot 20 percen át -20 C-on inkubáltuk, centrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl steril desztillált vízben feloldottuk. 15

16 3.6. DNS polimeráz láncreakció A pha2 géncsoport egy részét magába foglaló DNS-szakaszt polimeráz láncreakcióval sokszoroztuk fel. A felhasznált PCR programot és a primereket a 3. és 4. táblázat mutatja. 3. táblázat: Alkalmazott primerek és jellemzıik. Primer Régió Bázissorrend PCR termék a2-13 phaa2 (S.meliloti) GCAGGCCGCCGAGCTTCGTCAG 1410 bp a2-15 phaa2 (S.meliloti GTCAGCGCTGCCCGCCACTCCTC 1410 bp a2-23 phaa2 (S.meliloti) AAGCGACAGCGCGATCGAACTGAT 1495 bp a2-25 phaa2 (S.meliloti) TCGGCTTCGCGATCGCTCTAAAAC 1495 bp MuEnd GTTTTTCGTGCGCCGCTTCA változó pucrev TTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT változó 4. táblázat : Alkalmazott PCR reakció Program és lépései PHA65 MuEnd perc 94 C 30 sec 94 C 30 sec 65 C 1 perc 72 C 2. lépéstıl 33szor End 2 perc 95 C 30 sec 95 C 20 sec 68 C 2 perc 72 C 2. lépéstıl 30szor end 16

17 3.7. DNS ligálás és transzformálás A ligálási elegyet a vektor DNS oldat, a fragment DNS oldat, a ligáz puffer (5 koncentráció: 200 mm TrisHCl, 50 mm MgCl 2, 50 mm DTT 2,5 mm ATP, ph 7.8) és a steril desztillált víz felhasználásával készítettük el. A reakciónál T4 DNS ligáz enzimet használtunk és az elegyet legalább 2 órán keresztül szobahımérsékleten inkubáltuk. A transzformálás során 200 µl kompetens sejtet használtunk. A sejteket -80 C-ról jégre raktuk. 15 perc múltán hozzámértük a transzformálni kívánt sejtet. 20 percig jégen állni hagytuk, majd 3 percig 37 C-os hısokkot alkalmaztunk. A hısokkot követıen az elegyhez 800 µl LB oldatot adtunk. Egy órát 37 C-on inkubáltuk. Ez után a sejteket szelektív táptalajra kentük ki. A pbluescript vektorba való klónozás során az inszert beépülését a vektoron található lacz gén inaktiválása mutatja. A telepek enzimaktivitását 40 µg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indolyl-ß-dgalactopyranoside) és 40µg/ml IPTG (isopropyl-ß-d-thiogalactopyranoside) jelenlétében teszteltük. A megjelenı kék és fehér telepek közül a fehérekkel dolgoztunk tovább Emésztés restrikciós endonukleázokkal Az elızıekben izolált és tisztított DNS-mintákat a FERMENTAS cég anyagait használva emésztettük. Az emésztési reakcióelegy 1µl plazmid DNS-t, 1.5 µl 10 puffert, 0.5 µl enzimet és steril desztillált vizet tartalmazott. Az emésztés 37 C-on 1-2 órát tart. Az emésztés után a reakciót agaróz gélelektroforézissel ellenıriztük DNS agaróz gélelektroforézis Az emésztési reakciót követıen a fragmenteket 1%-os vagy ritkábban 1.5%-os agaróz gélt és 0.5 TBE puffert használva választottuk el. Az elválasztandó mintához 4-4 µl 5 STOP-ot adtunk (20 ml-hez: 2g ficoll, 10 ml 0.5 M EDTA (ph 8), 40 mg brómfenolkék, a végtérfogat 1/5-ének megfelelı mennyiséget adva). Az 17

18 elektroforézist a gél méretétıl függıen V-on végeztük, 1-2 órán keresztül. Kontrollként emésztett λ-dns-t vagy 100 bp Ladder DNS-t alkalmaztunk Transzpozonos mutagenezis A phaa2 PCR I.-fragment mutagenezisét a TGS II Kit felhasználásával végeztük el (Finnzymes, Haapa et al., 1999) A mutagenezissel a géncsoportba egy kanamicin rezisztencia markert kívántunk bejutatni. A reakcióhoz szükséges DNS mennyiséget (40 ng DNS/kb) a cél DNS hossza (4.4 kb) alapján számítottuk ki. A meghatározott térfogatú mintához, 2 µl 5 puffert, 0.5 µl Kan R entranszpozont, 0.5 µl MuA transzpozáz enzimet adtunk és az elegyet 10 µl-re egészítettük ki steril desztillált vízzel. Az elegyet 1 órán át 30 C-on, majd 10 percig 75 C-on inkubáltuk. A mintákat transzformáltuk és Amp, Km táptalajon szelektáltuk, amelyekbıl plazmid DNS készítettünk. A ET-Kan R -3 inszert beépülési helyét PCR-technikával és restrikciós enzimekkel határoztuk meg. A PCR reakcióhoz MuEnd és puc reverz primereket használtunk. A PCR-termék nagysága adja meg a ET-Kan R -3 szakasz beépülésének távolságát a reverz primer helyétıl. 18

19 4. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK Munkánk során az izolált és pbs vektorba klónozott phaa2 gén egy szakaszán hoztunk létre mutációt transzpozonos mutagenezissel. A transzpozont hordozó inszertet egy konjugatív plazmidba, a ppag160-ba építettük át, mely alkalmas a phaa2 génben mutáns Sinorhizobium meliloti baktérium létrehozására A pha2 génszakasz izolálása A munkánk elsı lépése az volt, hogy a phaa2 gén két meghatározott szakaszát PCR-technika segítségével felsokszorozzuk, majd izoláljuk. A PCR elıtt azonban meg kellett tervezni a reakcióhoz szükséges primereket. Mivel a S.meliloti 41 phaa2 régiójának szekvenciáját nem ismertük, ezért a primereket a 1021 törzs szekvenciája alapján határoztuk meg, mivel a S.meliloti 1021 phaa2 bázissorrendjét ismertük ( Capela et al., 2001). A reakcióhoz a S.meliloti 41 törzsébıl készített totál DNS-t használtuk, ebbıl amplifikáltuk fel az adott DNS szakaszokat a PCR segítségével. A reakciókhoz az a2-13/a2-15 és az a2-23/a2-25 primerpárokat használtuk, amelyekkel a PCR I. ill. a PCR II. elnevezéső DNS-szakaszokat kaptuk. A kapott fragmentek nagysága megegyezett a várt termékek méretével (PCR I. fragment körülbelül 1300kb, míg a PCR II. elnevezéső DNSszakasz közel 1500kb nagyságú.) (2.ábra). Mindkét fragmentet izoláltuk és pbluescript vektor EcoRV helyére építettük be. 19

20 λ PCR I. PCR II. 2. ábra: A PCR I és a PCR II. fragmentek Kontroll: λ DNS PstI enzimmel vágva A klónokat X-gal, IPTG jelenlétében növesztettük fel. A fehér telepekbıl plazmid DNS-t tisztítottunk, majd a konstrukciót PCR reakcióval és HindIII enzimmel történı emésztéssel ellenıriztük. Az ellenırzı reakciók megmutatták, hogy az inszert beépülése a vektorba sikeres volt. Mindkét fragment DNS-szekvenciáját meghatároztattuk. A bázissorrend mindkét esetben igazolta, hogy valóban a tervezett primereknek megfelelıen, a phaa2 gén egy egy darabját sikerült klónoznunk A PCRI fragment mutagenezise A létrehozott és megfelelı klónok közül a PCR I fragmentet hordozókkal dolgoztunk tovább. A phaa2 szekvenciában a mutációt transzpozonos mutagenezissel hoztuk létre a Finnzymes cég TGS II Kit felhasználásával. A reakció során az adott mutagenizálni kívánt plazmidba a MuA enzim kanamicin rezisztencia gént épített be. Ez a folyamat véletlenszerő volt. Miután a mutagenezis lejátszódott, feladatunk volt, hogy megvizsgáljuk és kiválasszuk a létrehozott klónokból azokat, amelyekben a mutáció létrejött. A kiszelektálást antibiotikumokkal végeztük el, ugyanis a mutáns baktériumok ampicillin mellett, kanamicin rezisztenciával is 20

21 rendelkeztek. Ezt a tulajdonságukat használtuk fel a szelektáláshoz (Amp, Km táptalajon csak a mutánsok nıttek fel). Miután kiválogattuk a mutagenezist szenvedett klónokat, meg kellett határoznunk hová is épült be az antibiotikum rezisztencia gén. A célunk az volt, hogy ez az inszert körülbelül a génszakasz közepére kerüljön, ugyanis ez megkönnyíti a késıbbiekben lejátszódó homológ rekombinációt a mutánsok létrehozása során. A rezisztencia gén helyzetének meghatározására fizikai térképezést használtunk. Ez azt jelentette, hogy a DNS-szakaszainkat a megfelelı restrikciós enzimekkel hasítottuk. Az emésztés eredményeképpen kapott fragmentek mérete alapján el tudtuk dönteni, melyik klónban a legkedvezıbb pozíciójú az inszert beépülése. A térképezést PCR reakcióval (a MuEnd programot használtuk) (2. ábra.), valamint CfrI és TaqI enzimekkel végeztük, a technikák során kapott eredmények alapján kiválogattuk azokat a klónokat, amelyekkel továbbdolgoztunk (AA4460, AA4462). λ ábra: Az ET-Kan R -3 inszert helyének meghatározása A MuEnd és puc reverz primerek segítségével végzett PCR- reakció termékének nagysága megadja az ET-Kan R -3 inszert távolságát a puc reverz primer helyétıl. Ez az 1.minta esetében 800bp, a 2.minta esetében 600bp, 3.minta esetében 300bp. Kontroll: λ DNS PstI enzimmel vágva 21

22 4.3. A pha2 mutánsok átklónozása konjugatív vektorba Az eddigi klónozási lépések pbs vektorba történtek. Mivel ezt a pbs alapú konstrukciót nem tudjuk a késıbbiekben Sinorhizobiumba konjugációval bejuttatni, ezért egy újabb lépésre volt szükség. A mutációt hordozó inszertet pbs vektorból ppag160 vektorba építettük át. A ppag160 egy konjugatív plazmid, amely nem képes replikációra Sinorhizobium törzsekben, tehát a konjugáció után egy lépésben kiszelektálhatók azok a baktériumok, amelyekben lejátszódott a homológ rekombináció, vagyis a mutáció átkerült a recipiens genomjába, ezzel mutánsokat létrehozva. A mutációt hordozó DNS-szakaszt EcoRI-KpnI emésztéssel a pbs vektorból kivágtuk és egy fragmentként izoláltuk. Ezt az izolált, kanamicin rezisztenciát hordozó fragmentet az úgyszintén EcoRI-KpnI enzimekkel hasított ppag160 vektorba építettük be. A PCR I szakaszon nem található se EcoRI, se KpnI hasító hely, ellentétben a pbs plazmiddal, ahol ez a két hasító hely közel a fragmenthez, annak egyik illetve másik oldalán található. Ennek következtében az EcoRI-KpnI emésztés során a PCR I szakasz teljes egészében kivágódik. Ellenırzésként kanamicin és spektinomicin tartalmú táptalajon felnıtt, transzformáns kolóniákból plazmid DNS tisztítottunk és HindIII, NotI, XhoI restrikciós enzimekkel ellenıriztük a konstrukciónk létrejöttét. (AA4461, AA4463) 22

23 4. ábra: A phaa2 génszakasz klónozása ppag160 konjugatív vektorba. A klónozás egyes lépéseit mutatja az ábra. Elıször PCR-technika segítségével a génszakasz megfelelı szakaszait felsokszoroztuk, majd a fragment izolálást követıen pbluescript II SK vektor EcoRV helyére ligáltuk. Transzpozonos mutagenezissel Km rezisztencia gént jutattunk be az inszertbe. A vektorból EcoRI-KpnI emésztéssel kivágtuk az elrontott DNS-szakaszt és ppag160 vektorba építettük be. 23

24 4.4. További eredmények Munkánkat sikeresen befejeztük, megterveztünk egy olyan plazmid konstrukciót, amelynek felhasználásával phaa2 génben mutáns baktérium hozható létre. Idıközben csoportunkban a mutációt hordozó ppag160 vektor segítségével (donor) elkészítették a mutánsokat a vadtípusú S.meliloti 41 törzsben (recipiens) is. A keresztezés során a mutációt tartalmazó plazmid a donor sejtbıl konjugációval átjutott, és homológ rekombinációval beépült a recipiens sejt kromoszómájába. A meglévı mutánsok ellenırzése után, - hogy valóban hordozzák-e a mutációt -, a megfelelı baktériumokkal elkezdıdtek a különbözı fiziológiai vizsgálatok, melyekkel bizonyítható, hogy a pha2 régió egy Na + /H + antiportert kódol, aminek hiányában a mutánsok Na és ph-érzékenységet mutatnak. 24

25 5. ÖSSZEFOGLALÁS A Rhizobiaceae családba tartozó baktériumok egyes növényekkel, mint például a pillangósvirágúak, mindkét partner számára elınyös szimbiózist alakítanak ki. A szimbiózis során úgynevezett szimbiotikus gümı jön létre. A gümı biztosítja a baktériumok számára a védelmet. Ahhoz, hogy a szimbiózis kialakuljon és a rhizobiumok a növény belsejében elszaporodjanak szükség van a baktériumok ph-homeosztázisának megtartására. Ebben többek között a pha géneknek van szerepük. Nukleotidszekvencia alapján bebizonyosodott, hogy a S.meliloti 1021 törzsében két pha géncsoport található. Az egyiket pha1, a másikat pha2 géncsoportnak nevezték el. A pha1 génjeivel folytatott kísérletek során bizonyossá vált, hogy azok egy K + /H + antiportert kódolnak. Úgy véljük, hogy a pha2 géncsoport pedig egy Na + /H + antiporter szintéziséért lehet felelıs. Célunknak tőztük ki, hogy létrehozzunk phaa2 génben mutáns S. meliloti baktériumokat. Munkánk elsı lépéseként, PCR technikával és két primerpár segítségével a phaa2 régió két szakaszát felsokszoroztuk. Majd transzpozonos mutagenezissel kanamicin rezisztencia gént építettünk be az izolált fragmentbe, ezzel mutációt létrehozva a klónozott phaa2 gén adott szakaszán, melyet ppag160 konjugatív plazmidba juttattuk át, megalkotva egy olyan vektor konstrukciót, melynek segítségével lehetıség van a mutáns baktériumok létrehozására. Idıközben csoportunkban elıállt a phaa2 génben mutáns törzs és megkezdıdtek a különbözı fiziológiai kísérletek a Na és ph érzékenység bizonyítására. 25

26 6. IRODALOMJEGYZÉK Bladergroen, M.R., and H.P. Spaink Genes and signal molecules involved in the the rhizobia- Leguminosae symbiosis. Current Opinion Plant Bio. 1: Burns, R.C., and R.W.F. Hardy, (1975) Nitrogen fixation in bacteria and higher plants. New York: Springer Verlag. Capela D, Barloy-Hubler F, Gouzy J, Bothe G, Ampe F, Batut J, Boistard P, Becker A, Boutry M, Cadieu E, Dreano S, Gloux S, Godrie T, Goffeau A, Kahn D, Kiss E, Lelaure V, Masuy D, Pohl T, Portetelle D, Puhler A, Purnelle B, Ramsperger U, Renard C, Thebault P, Vandenbol M, Weidner S, Galibert F. (2001). Analysis of the chromosome sequence of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti strain Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: Catoira, R., A.C.J. Timmers, F. Maillet, C. Galera, R.V. Peumetsa, D. Cook, and J. Denarie, (2001) The HCL gene of Medicago truncatula controls Rhizobium-induced root hair curling. Development 128: Cheng, H.P., and G.C. Walker, (1998) Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti. J Bacteriol 180: Currier, W.M., and G.A. Strobel, (1974) Chemotaxis of a Rhizobium spp to a glucoprotein produced by birdsfoot trefoil roots. Science 196: Diaz, C.L., L.S. Melchers, P.J.J Hooykaas, B.J.J Lugtenberg, and J.W. Kijne, (1989) Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhizobium legume symbiosis. Nature 338: Dudley, M.E., T.W. Jacobs, and S.R. Long, (1987) Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti. Planta 171: Dylan, T., P. Nagpal, D.R. Helinski, and G.S. Ditta (1990b) Symbiotic pseudorevertants of Rhizobium meliloti ndv mutants. J. Bacteriol. 172: Fraysse, N., F. Couderc, and V. Poinsot, (2003) Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis. Eur. J. Biochem. 270: Friedrich, T., K. Steinmüller, and H. Weiss, (1995) The proton-pumping respiratory complex I of bacteria and mitochondria and its homologue in chloroplasts. FEBS Letters 367: Friedrich, T., and H. Weiss, (1997) Modular evolution of the respiratory NADH:ubiquinone oxidoreductase and the origin of its modules. J. Theoret. Biol. 187: Gage, D.J., and W. Margolin, (2000) Hanging by thread: invasion of legume plants by rhizobia. Current Opinion Microbio 3: Gonzáles, J.E., C.E. Semino, L.X. Wang, L.E. Castellano-Torres, and G.C.Walker, (1998) Biosynthetic control of molecular weigth in the polymerization of the octasaccharide subunits of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti. PNAS 95: Hamamoto, T., M. Hashimoto, M. Hino, M. Kitada, Y. Seto, T. Kudo, and K. Horikoshi, (1994) Characterization of a gene responsible for the Na + /H + antiporter system of alkalophilic Bacillus species strain C-125. Mol. Microbiol. 14: Ish-Horovicz, D., and J.F.Burke, (1981) Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9: Kannenberg, E.L., and N.J.Brewin, (1994) Host-plant invasion by Rhizobium : the role of cellsurface components. Trends Microbiol 2: Kiss, G.B., E.Vincze, Z.Kalman, T.Forrai, and A.Kondorosi Genetic and biochemical analysis of mutants affected in nitate reduction in Rhizobium meliloti. J. Gen. Microbiol. 113: Koonin, E. V., K. S. Makarova, and L. Aravind Horizontal gene transfer in 26

27 prokaryotes. Annu. Rev. Microbiol. 55: Krulwich, T.A., Cheng, J., and Guffanti, A.A. (1994) The role of monovalent cation/proton antiporters in Na+- resistance and ph homeostasis in Bacillus: An alkaliphile versus a neutralophile. J Exp Biol 196: Lagares, A., Caetano-Anolles, G., Niehaus, K., Lorenzen, J., Ljunggren, H.D., Puhler, A., and Favelukes, G. (1992) A Rhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in competitiveness for nodulation in alfalfa. J Bacteriol 174: Meade, H.M., S.K.Long, G.B.Ruokun, S.E.Brown, and F.M.Ausubel Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis. J. Bacteriol. 149: Mellor, R., and D. Werner, (1987 ) Peribacteroid membrane biogenesis in mature legume root nodules. Symbiosis 3: Mills, K.K., and W.D.Bauer, (1985) Rhizobium attachment to clover roots. J Cell Sci Suppl. 2: Newcomb, W. (1981 ) Nodule morphogenesis and differentiation. In Biology of the Rhizobiaceae. Vol. 13. Giles, K.L. and Atherly, A.G. (eds). New York: Academic Press, pp Orosz, L., Z. Svab, A. Kondorosi, and T. Sik Genetic studies on Rhizobio- phage Genes and functions on the chromosome. Mol. Gen. Genet. 125: Petrovics, G., P. Putnoky, B. Reuhs, J. Kim, J., T.A.Thorp, K.D.Noel, R.W. Carlson, and A. Kondorosi, A. (1993) The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development. Mol. Microbiol. 8: Putnoky, P., E. Grosskopf, D.T.C.Ha, G.B.Kiss, and A. Kondorosi, (1988) Rhizobium fix genes mediate at least two communication steps in symbiotic nodule development. J. Cell Biol. 106: Putnoky, P., G. Petrovics, A. Kereszt, E. Grosskopf, D.T.C. Ha, Z. Banfalvi, and A. Kondorosi, (1990) Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction. J. Bacteriol. 172: Putnoky, P., A. Kereszt, T. Nakamura, G. Endre, E. Grosskopf, P. Kiss, and A. Kondorosi, (1998) The pha gene cluster of Rhizobium meliloti involved in ph adaptation and symbiosis encodes a novel type of K+-efflux system. Mol. Microbiol. 28: Redmond, J.W., M. Batley, M.A.Djordjevic, R.W. Innes, P.L. Kuempell, and B.G.Rolfe, (1986) Flavons induce expression of nodulation genes in Rhizobium. Nature 323: Reuber, T.L., and G.C.Walker, (1993 ) Biosynthesis of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti. Cell 74: Reuhs, B.L., R.W.Carlson, and J.S.Kim, (1993) Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3- deoxy-d-manno-2- octulosonic acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigens (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175: Reuhs, B.L., D.P.Geller, J.S.Kim, J.E.Fox, and S.G.Pueppke, (1998) Sinorhizobium fredii, and Sinorhizobium meliloti produce structurally conserved lipopolysaccharides and strain-specific K antigens. Appl. Environ. Microbiol. 64: Sambrook, J., E.F.Fritsch, and T. Maniatis, (1989) Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schultze, M., E. Kondorosi, P. Ratet, M. Buire, and A. Kondorosi, (1994) Cell and molecular biology of Rhizobium-plant interactions. Int. Rev. of Cytol. 156: Seto, Y., M. Hashimoto, R. Usami, T. Hamamoto, T. Kudo, and K. Horikoshi, (1995) Characterization of a mutation responsible for an alkali-sensitive mutant, 18224, of alkaliphilic Bacillus sp strain C-125. Biosci. Biotech. Biochem. 59:

28 28

29 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Munkámat a PTE Természettudományi Kar Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem. Hálával tartozom a tanszék összes dolgozójának, hogy a lehetı legjobb hátteret biztosították terveim megvalósításához. Kiemelt köszönettel tartozom témavezetıimnek, dr. Putnoky Péternek és Pálvölgyi Adriennek a türelmükért, a munkámhoz nyújtott segítségükért, tanácsaikért, irányításukért. Külön köszönet illeti Deák Veronikát, Garai Krisztinát, a kísérleteim kivitelezésében nyújtott segítségért. 29