Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar. Hajdú Fanni. BSc. IV. évfolyam Biomérnök szakos hallgató

Átírás

1 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Hajdú Fanni BSc. IV. évfolyam Biomérnök szakos hallgató A maláriaellenes célpont Plasmodium falciparum CTP: foszfokolin citidililtranszferáz enzim szerkezeti megismerése fehérje kristályosítás révén Témavezetők: Dr. Vértessy G. Beáta BME VBK Alkalmazott Biotechnológiai és Élelmiszertudományi Tanszék Nagy Gergely Nándor BME VBK Alkalmazott Biotechnológiai és Élelmiszertudományi Tanszék TDK dolgozat Budapest 2014

2 Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke Irodalmi áttekintés A malária A malária egészségügyi és gazdasági jelentősége A malária kórokozói, a Plasmodium paraziták A parazitát célzó malária ellenes terápiák Lipid bioszintézis útvonalon ható terápiás szerek A lipid bioszintézis útvonala Foszfatidilkolin szintézis Az emlős CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzim (CCT) A P. falciparum CCT enzim Célkitűzéseim Anyagok és módszerek Fehérjetermelés és tisztítás Primer tervezése és inszertek felszaporítása polimeráz láncreakcióval Agaróz gélelektroforézis Restrikciós emésztés és ligálás Kompetens sejt készítés Transzformálás Fehérje kifejeztetése rekombináns módon Sejtfeltárás Fehérje-tisztítás és dialízis Gélszűrés Fehérjevizsgálati módszerek Fehérjekoncentráció-meghatározás Nátrium-dodecil szulfátos poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) Differenciális pásztázó fluorimetria (Thermofluor) Fluoreszcens spektroszkópia Steady-state enzimaktivitás mérés Homológia modellezés Fehérje kristályosítás Eredmények

3 4.1. Új konstrukciók tervezése Homológia modellezés Klónozás A fehérjék kifejeztetése A konstrukciók tisztítása Ni-NTA affinitás kromatográfia Gélszűrés A fehérjék steady-state enzimaktivitás vizsgálata Az AVΔQ és CatH2 konstrukciók ligand kötésének vizsgálata Hőstabilitás vizsgálat differenciális pásztázó fluorimetria módszerrel Az AVΔQ konstrukció ligand kötésének vizsgálata fluoreszcens spektroszkópiával Fehérje kristályosítási kísérletek a szerkezet feltárásához Összegzés Irodalomjegyzék

4 Rövidítések jegyzéke AAG ADP APS ATP BA CCT CDPCho ChoP CK CMP CPT CTP DAG DTT EDTA ER Hepes IPTG LB MES MESG Ni-NTA NMR OD PBS PC PCR PfCCT PMSF PNP PPáz PPi alkil-acilglicerol adenozin-difoszfát ammónium-perszulfát adenozin-trifoszfát benzamidin CTP:foszfokolin citidililtranszferáz citidin-difoszfokolin foszfokolin kolin kináz citidin-monofsozfát CDP-kolin:1,2-diacilglicerol kolinfoszfotranszferáz citidin-trifoszfát diacil-glicerol ditiotreitol etiléndiamin-tetraecetsav endoplazmatikus retikulum N-(2-hidroxietil)piperazin-N -etánszulfonsav izopropil- -D-1-tiogalakto-piranozid Luria-Bertani tápoldat 7-metil-6-tioguanin 7-metil-6-tioguanozin Ni-nitrilotriecetsav magmágneses rezonancia optikai denzitás foszfát-puffer foszfatidil-kolin polimeráz láncreakció Plasmodium falciparum CTP:foszfokolin citidililtranszferáz fenilmetilszulfonil-fluorid purin nukleozid foszforiláz pirofoszfatáz pirofoszfát 4

5 SDS TCEP TEMED Tm -ME NATA KM Kd PEG EDO IM Nátrium-dodecil szulfát tris-(2-karboxietil)-foszfin N,N,N,N -tetrametil-etilén-diamin letekeredési hőmérséklet -merkaptoetanol N-acetil-triptofánamin Michaelis-Menten állandó disszociációs állandó polietilén-glikol etilén-glikol imidazol 5

6 Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy a kutatócsoportjában dolgozhassak, megismertetett a téma alapjaival, és lelkesítő ötletetivel segítette munkám előrehaladását. Köszönöm Buday Lászlónak, az MTA TTK Enzimológiai Intézet igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetben. Hálás köszönettel tartozom Marton Líviának és Nagy Gergelynek, akik bevezettek a labormunka alapjaiba, megismertettek a molekuláris biológia lehetőségeivel. Türelemmel és határtalan segítőkészséggel válaszoltak minden felmerülő kérdésemre, irányították kutatómunkámat, és támogattak a nehezebb pillanatokban is. Köszönöm Leveles Ibolyának, aki nagy segítséget nyújtott a kristályosítás során, valamint a fehérjekristályokat röntgendiffrakciós kísérletekkel vizsgálta. Köszönettel tartozom Krámos Balázsnak, aki elkészítette a fehérjekonstrukció homológia modelljét. Végül szeretném megköszönni az egész kutatócsoportnak, akik bátorító támogatást nyújtottak a munkám során, és megteremtették azt a légkört, ahol öröm volt a közös munka. 6

7 1. Irodalmi áttekintés 1.1. A malária A malária egészségügyi és gazdasági jelentősége A malária napjaink egyik leggyakoribb járványos megbetegedése. A terápiás szerek kifejlesztése nagy jelentőséggel bír a betegség megelőzésében, illetve kezelésében ban 97 országban volt jelen a fertőzés, körülbelül 1.2 milliárd ember magas veszélyeztetettségi zónában él (1. ábra). Ezen régiókban 1000 emberre egy fertőzött beteg jut es adatok szerint év alatti gyermek halt meg a betegségen, amely percenként majdnem egy gyermeket jelent [1]. Fontos tényező, hogy a gyerekek esetében még nem alakulhatott ki az immunitás, amely bár nem nyújt teljes védelmet, de felnőttek esetében lehetővé teszi, hogy ne okozzon súlyos szövődményeket a megbetegedés [2]. 1. ábra Malária előfordulása a világon, rezisztencia kialakulása megnövekede klorokin vagy mul rezisztencia, megnövekede klorokin rezisztencia, nincs rezisztencia maláriával nem sújtott területek 7

8 A prevenciós technikák propagálásával, valamint a gyógyszeres terápia segítségével között sikerült csökkenteni az esetek számát, valamint a halálozási arányt is. A kedvező tendencia fenntartására a továbbiakban is rendkívül fontos a terápiás szerek kutatása és fejlesztése [1]. Azonban a törekvések ellenére kialakuló rezisztencia megnehezíti a védekezést, ezért egyre nagyobb jelentőséggel bír az új hatásmechanizmusú terápiás szerek kifejlesztése. A malária egészségügyi jelentősége mellett összefüggésbe hozható a gazdasági fejlődés akadályozásával és a nyomorral mindazon országokban, ahol széles körben elterjedt. Összehasonlítva azon országok éves nemzeti jövedelmét (GDP), ahol a malária nincs jelen, és azokét, ahol nagy problémát jelent a betegség, ötszörös különbséget tapasztaltak [3]. Megvizsgálva azt is, hogy a GDP növekedése hogyan alakult ezekben az országokban rávilágítottak arra, hogy a malária sújtotta országokban a GDP növekedés sokkal kisebb mértékű, 2.4% helyett csupán 0.4% évente [4]. A szegénység a betegséggel szembeni védekezést is megnehezíti, hiszen ezen országoknak nincs meg a gyógyszer finanszírozási és infrastruktúrafejlesztési kapacitása sem A malária kórokozói, a Plasmodium paraziták A különböző gerincesek malária fertőzését a nőstény Anopheles szúnyog által terjesztett, az Apicomplexák törzsébe tartozó Plasmodium protozoon paraziták okozzák. A különböző fajok azonban eltérő mértékben veszélyesek. A P. knowlesi ritkán, a P. vivax, P. ovale, P. malariae fajok gyakrabban okoz megbetegedést, azonban ezek ritkán halálos kimenetelűek [2]. Az összes faj közül messze a legveszélyesebb a Plasmodium falciparum, melynél a fertőzések legnagyobb arányban végződnek halállal. A Plasmodium paraziták összetett életciklusuk során mind a szúnyogban, mind a melegvérű gazdáikban fejlődnek [5]. A szúnyog vérszívása során az emberbe a parazita sporozoita állapotában jut be, majd az új gazdaszervezetben megindul egy ivartalan szaporodási fázis (2. ábra). A sporozoiták bejutnak a vér- és nyirokkeringésbe, majd rövid időn belül eljutnak a májhoz. A következő, pre-eritrocita növekedési fázis 5-16 napig tart, amely során a fertőzött egyén tünetmentes. 8

9 2. ábra A Plasmodium falciparum parazita életciklusa Ezután a kiszabaduló merozoita sejtek bejutnak a vörösvértestekbe, és differenciálódás útján tovább fejlődnek, majd kialakul az érett trofozita a vörösvértestek citoplazmájában. Végül kialakul a sizont, amely merozoitát tartalmaz. Ezzel párhuzamosan létrejönnek a gametociták, amelyek a paraziták szexuális reprodukcióját biztosítják a szúnyog hordozóba jutva. Végül egy újabb csípéssel terjedhet tovább a kórokozó (2. ábra) A parazitát célzó malária ellenes terápiák Számos módszert alkalmaznak a malária visszaszorítására, melyek a hordozó szúnyog kontrollálásán, a parazita elleni oltóanyaggal kifejlesztésén, illetve a kemoterápián alapulnak. A szúnyog populáció csökkentésére annak életciklusába avatkoznak be, míg az emberekkel történő érintkezését védőhálók alkalmazásával próbálják elkerülni. Komoly lehetőségeket rejteget az oltás kifejlesztése, amelyet nagy erőkkel kutatnak, és a folyamat már az embereken való tesztelés fázisába lépett [6]. 9

10 ARTEMISININ KLOROKIN 3. ábra A leggyakrabban használt antimaláriás gyógyszerek hatóanyaga az artemisinin, a klorokin, illetve azok származékai. A jelenleg széleskörűen alkalmazott antimaláriás kemoterápiás kezelések a klorokin és az artemisinin, valamint ezek származékaira épülnek (3. ábra), azonban az ezen hatóanyagok ellen egyre elterjedtebb parazita rezisztencia kialakulása miatt szükségessé vált új gyógyszerek fejlesztése [7]. Több szelektív biokémiai célpontot ismertek fel az utóbbi években, amelyek potenciálisan lehetőséget adnak az új hatásmechanizmusú szerek kifejlesztésére, ezek közé tartozik a mitokondriális transzport [8], a folát útvonal [9], a proteáz [10], a hem [11] és apikoplaszt [12] metabolizmus, valamint a lipid metabolizmus [13] Lipid bioszintézis útvonalon ható terápiás szerek A parazita membrán bioszintézisének gátlását célzó kutatások ígéretes terápiás stratégiát nyújtanak, hiszen amellett, hogy a foszfolipid bioszintézis a kórokozó számára létfontosságú, jelentősen eltér a humán gazda folyamataitól. A parazita a vörösvértestbe jutva a sokszoros osztódásához nagymértékű membrán bioszintézist folytat, az újonnan előállított lipid összetevők döntő része foszfolipid. A fertőzött vörösvértest emiatt nagy affinitással bír a kolin metabolitra és jelentős mennyiség felvételére képes, ami jelentősen különbözik a minimális metabolizmust folytató normál eritrocita viselkedésétől. Ez a különbség a hatóanyag felvétel és átalakítás folyamataiban képes biztosítani a gyógyszerhatás szelektivitását megfelelő plazma hatóanyag koncentráció esetén. A kifejlesztett kolin analóg lipid metabolizmust támadó hatóanyagok, például egyes bisz-tiazólium sók, gátolják a kolin bejutását az eritrocitába, ezáltal megakadályozzák a foszfatidilkolin szintézist [14]. A szervezetbe a terápiás szer előanyagát (prodrug) juttatják be orális vagy parenterális módon, majd az 10

11 a humán szervezetben alakul át hatóanyaggá. A kialakult kvaterner ammónium szerkezetű molekulák a fertőzött vörösvértestben képesek a lipid bioszintézis gátlására is gyors, irreverzibilis citotoxicitásuk által A lipid bioszintézis útvonala Foszfatidilkolin szintézis A foszfatidilkolin az egyik legnagyobb mennyiségben előforduló sejtmembrán alkotó, mely fontos szerepet játszik a sejt felépítésében és működésében. De novo bioszintézis útvonalát Eugene P. Kennedy fedezte fel [15], [16], aki rámutatott, hogy foszfatidilkolin (és foszfatidil-etanolamin) 3 enzimatikus lépésben keletkezhet a sejtben melyhez elengedhetetlen kofaktor a citidin-trifoszfát (CTP) (4. ábra). Elsőként a kolin kináz (CK) katalizálja a kolin foszforilációját, amely során adenozin-trifoszfátot (ATP) használ fel a sejt, így keletkezik foszfokolin (ChoP) és melléktermékként adenozin-difoszfát (ADP). A reakció útvonal második lépése során a CTP:foszfokolin citidililtranszferáz (CCT) enzim a foszfokolint és a CTP-t, egy nagy energiájú citidin-difoszfokolint (CDPCho) molekula létrehozására használja fel. Ebben a lépésben pirofoszfát (PPi) szabadul fel a reakció során. Az útvonal utolsó lépését a CDP-kolin:1,2-diacilglicerol kolinfoszfotranszferáz (CPT) enzim katalizálja, amely a foszfatidilkolin (PC) keletkezéséhez CDP-kolint valamint egy lipid horgonyt, diacilglicerolt (DAG) vagy alkil-acilglicerolt (AAG) használ fel. A reakció során citidin-monofoszfát keletkezik melléktermékként. 11

12 4. ábra A Kennedy de novo foszfatidilkolin bioszintézis útvonal Az útvonal sebesség meghatározó lépését a CTP:foszfokolin citidililtranszferáz (CCT) katalizálja, mely a foszfokolint CTP felhasználásával CDP-kolinná alakítja Az emlős CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzim (CCT) A CTP:foszfokolin citidililtranszferáz, a második, egyben sebesség meghatározó lépését katalizálja a Kennedy foszfatidilkolin bioszintézis útvonalnak. A reakció során a foszfokolin nukleofil támadást intéz a CTP -foszfátjára, majd a -foszfát csoportok helyére kapcsolódik be a nukleotidba, így létrehozva a CDP-kolin terméket [17]. Az általánosan vizsgált patkány CCT esetén megállapítást nyert, hogy az enzim négy, az enzimatikus funkció betöltésében kulcsszerepet játszó szerkezeti egységet tartalmaz (5. ábra). A katalitikus doménen túl ide sorolható az egyes eukarióta CCT fehérjeszerkezetek N-terminálisán található sejtmagi lokalizációs szignál (NLS), a membránkötő domén, valamint a C-terminálison elhelyezkedő foszforilációban szerepet játszó domén (P) [18], [19]. Az enzimatikus reguláció szempontjából különös jelentőséggel bír a membránkötő domén részét képező amfipatikus α-hélix. Az enzim 12

13 aktivációja a sejtbeli transzlokációját eredményezi, mely során az enzim a citoplazmából a sejtmembránhoz vagy endoplazmatikus retikulumhoz (ER) kötődik (5. ábra). Ezen membránkötés hatására feloldódik az α-hélix a katalitikus domén működését gátló ún. autóinhibíciós hatása, és ezzel az enzim aktivitása százszorosára nő [20]. A citoplazmában elhelyezkedő, inaktív enzim foszforilált állapotban van jelen, míg a transzlokációt a foszforilációban szerepet játszó domén elérhetővé válása és defoszforilációja kíséri [21]. 5. ábra A patkány CCT oldott és membránkötött formája A CCT enzimek Rossmann-fold szerkezetű katalitikus doménnel rendelkeznek, amelyben öt párhuzamos β-redő és az azokat körülvevő hat α-hélix található (6. ábra). Az alegységek homodimert alkotnak, a dimerizációs kölcsönható felületen található konzervált motívum ( 140 RYVD 143 ), biztosítja a dimer stabilitását [22]. Az enzimatikus működésben két további konzervált motívum játszik kulcsszerepet. A Rossmann-fold 13

14 első hélixében található 89 HXGH 92 motívum a reakció során az átmeneti állapot stabilizálásában játszik szerepet, ugyanis a második hisztidin (H) a CTP α-foszfátját koordinálja [22] [23]. A másik motívum az αe hélixben található 196 RTEGIST 202 motívum, mely H-híd kötésekkel kapcsolódik a nukleotid citozin bázisához, így koordinálva a CTP-t a reakcióhoz. Hasonlóképpen felismerték még további, bázikus oldalláncú aminosavak enzim katalízisben betöltött támadó foszfát koordinálását végzik [22]. szerepét, melyek a nukleofil A CCT enzim meghatározó szereplője az élőlények a foszfatidilkolin bioszintézisének, emiatt hiánya vagy működésképtelensége a sejt dezintegritásához, a membrán szerkezetének fellazulásához, végső soron a sejt életképtelenségéhez vezet. Emiatt kiváló terápiás célpontot biztosít, alapot ad az új vonalas gyógyszerkutatáshoz [24] A P. falciparum CCT enzim A parazita lipid bioszintézisében szerepet játszó Plasmodium falciparum CTP:foszfokolin citidililtranszferáz 6. ábra A patkány CCT szerkezeti modellje (PfCCT) bioszintézis útvonala egy elismert új generációs terápiás célpont [25], maga az enzim is egy potenciális gyógyszerkölcsönható partner. Kutatócsoportunkban 5 éve folyik a PfCCT enzim szerkezetének és működésének megismerésére irányuló kutatómunka. 14

15 A teljes PfCCT enzim 896 aminosavból áll, és egy, a CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzimek között szokatlan duplikációt tartalmaz, amelynek evolúciós eredetét korábban a kutatócsoportomban is vizsgálták (7. ábra) [26]. Rávilágítottak, hogy a megkettőzött katalitikus domén kizárólag az Apikomplexa paraziták három nemzetségében, a Plasmodium, a Babesia és a Theileria kórokozókban jelenik meg. A PfCCT szekvenciában két található katalitikus domén (Kat1 és Kat2) 90% szekvencia egyezést mutat. A két nagyon hasonló katalitikus domén lehetővé tette egyikük kifejeztetésével egy aktív és stabil homodimer konstrukció létrehozását kutatócsoportomban (PfCCT M K konstrukció). Mivel a teljes hosszúságú PfCCT enzim E. coli expressziós rendszerben történő kifejeztetése sikertelen volt, az enzim biokémiai és szerkezeti tulajdonságait a PfCCT M K konstrukció segítségével jellemezték. Ezen konstrukcióból a tisztíthatóság javítása miatt kivágtak egy rendezetlen lizin gazdag régiót, amelyet a 7. ábrán sárga színnel jelölt K betű jelöl [26]. teljes PfCCT enzim PfCCT M K 7. ábra A P. falciparum CCT enzim teljes szerkezete (fent), az M K konstrukció szerkezete (lent) sematikus ábrán. Az ábrán jelölt K lizin gazdag régió a konstrukcióból a rendezetlensége miatt eltávolításra került. Kat katalitikus domén, pkat pre-katalitikus domén, Memb membránkötő domén A munkacsoportomban korábban folyó kutatások igazolták, hogy az M K konstrukció enzimatikus funkcióját betölti, valamint a teljes hosszú PfCCT Kat1 Kat2 alegységek kölcsönhatását utánozva dimert alkot. A konstrukció 1.45 ± 0.05 s -1 átalakítási számmal és 168 ± 17 M KM,CTP értékkel rendelkezik, valamint 5 mm-nál nagyobb ChoP koncentráció szubsztrát inhibíciós hatást idéz elő. A CDP-kolin termék mindkét szubsztráttal szemben kompetitív kinetikai gátlást mutat [26], ami random bi-bi enzim 15

16 kinetikai mechanizmusra utal. A konstrukció CTP ligand kötése Mg 2+ távollétében is hatékony helyette a CTP trifoszfát részének koordinációjában arginin és lizin aminosavak vesznek részt [27]. A Mg 2+ ionnak a feltételezés szerint a hatékony katalízisben van szerepe, nem pedig a nukleotid kötődésében [26]. Az M K konstrukció, valamint az emlős CCT szerkezeti ismeretei [22] alapján létrehoztak egy új, kristályosításra optimalizált, PfCCT AV Q elnevezésű konstrukciót is (8. ábra). Ez a konstrukció a sikeresen kristályosított patkány CCT enzim konstrukció azon szakaszának megfelelője a Plasmodium szekvenciában, ami a patkány CCT kristályszerkezetben látható (PDB-kód: 3HL4). PfCCT AV Q 8. ábra A PfCCT AV Q konstrukciójának sematikus ábrája A patkány CCT és PfCCT homológia modell alapján megválasztott szakaszhatárok magukba foglalják az enzim azon részét, amelyet pre-katalitikus doménnak nevezünk, mivel a pontos szerepe nem ismert, de fontos a katalízisben, valamint a teljes katalitikus domént. Az M K konstrukcióhoz hasonlóan ez a fehérje sem tartalmazza a lizin-gazdag rendezetlen szegmenst (K). A PfCCT AV Q egy igen rövid konstrukció, hiszen a kristályosításnál fontos, hogy a vizsgált fehérje a lehető legkevesebb rendezetlen régiót tartalmazza. A 2014-ben megjelent újabb patkány CCT kristályszerkezetet (PDB-kód: 4MVC) elemző publikáció [28] a fehérje hosszabb szakaszának szerkezetét és működésben betöltött szerepét ismertette (9. ábra). 16

17 9. ábra A emlős CCT (balra) és PfCCT (jobbra) szerkezeti modellje. A PfCCT enzim világosbarna színnel látható az ábrán, amelyre MΔK konstrukció van ráillesztve szürke színnel homológia modellezés segítségével. Látható, hogy már az MΔK konstrukció sem tartalmazza a lizin gazdag régiót. Ez a szerkezet tartalmazza a katalitikus domén C-terminális végén elhelyezkedő teljes αe hélixet, amely fontos kölcsönhatást alakít ki egy, a membrán-kötő domén részét képező α-hélixszel, ami a dimer szerkezetben zölddel és sárgával jelölve szerepel a 9. ábrán. Ezen új szerkezet analógiája lehetőséget adhat a PfCCT megfelelő szerkezeti részének megismerésére és a két enzim valószínűsített működésbeli eltérésének vizsgálatára [29]. 17

18 2. Célkitűzéseim Tudományos diákköri munkám célja a malária parazita számára létfontosságú PfCCT enzim háromdimenziós térszerkezetének megismerése, amely új antimaláriás szerek lehetséges célpontja. Ehhez a fehérjének egy csonkított, katalitikus domént is tartalmazó újonnan tervezett konstrukciója (PfCCT AV Q) állt rendelkezésemre. Munkám során jellemezni kívánom a kristályosíthatóság céljából tervezett konstrukció biokémiai tulajdonságait, enzim aktivitását, ligand kötő képességét, valamint hőstabilitását. A kapott értékeket a kutatócsoportban eddig használt PfCCT konstrukcióval összevetve szeretném megvizsgálni, hogy a konstrukció tervezése során a méret csökkentésével a korábbihoz hasonló enzimatikus funkció nyerhető. Ezáltal megvizsgálhatjuk, hogy ennek az eddig ismeretlen funkciójú szakaszoknak mi a szerepe az enzimműködésben. A PfCCT AV Q háromdimenziós térszerkezetét fehérje kristályosítással kívánom megismerni. A kristályosítás során meg kívánom vizsgálni, hogy a kifejlesztett konstrukció jobban kristályosítható-e, mint a kutatócsoportban korábban használt fehérje szakasz. A nagy áteresztőképességű kristályosító körülmény keresés után az ígéretes kezdeti találatok finomításával a legjobb minőségű fehérje kristályt szolgáltató körülményt kívánom azonosítani. A kristályosítást a PfCCT különböző ligandumainak hozzáadásával kísérelem meg, hogy betekintést nyerhessek az enzimatikus működés egyes szakaszaiba. Emellett új PfCCT fehérje konstrukciókat kívánok tervezni, a nemrégiben megjelent patkány CTP:foszfokolin citidililtranszferáz kristályszerkezetek alapján. A homológ enzim közzétett szerkezeti és biokémiai vizsgálatának ismeretében célom olyan, biológiai funkcióval rendelkező enzim konstrukciók létrehozása, melyek az analógia alapján várhatóan jól kristályosodnak és még több szerkezeti információt képesek potenciálisan szolgáltatni, mint az eddig a kutatócsoportunkban vizsgált konstrukciók. 18

19 3. Anyagok és módszerek 3.1. Fehérjetermelés és tisztítás Primer tervezése és inszertek felszaporítása polimeráz láncreakcióval A fehérje konstrukciók előállítása a klónozás megtervezésével kezdődik. A konstrukciók határok kijelölése után nukleotid hosszú oligomereket, primereket kell tervezni a polimeráz láncreakcióhoz annak figyelembevételével, hogy a későbbiekben a fehérje konstrukciót kódoló génszakaszt milyen vektorba ágyazzuk be. 1. lépés denaturáció (D) 2. lépés anelláció (A) 3. lépés polimerizáció (P) 10. ábra PCR-eljárás lépései A polimeráz láncreakció (PCR) lehetőséget ad arra, hogy DNS-polimeráz enzimet használva in vitro sokszorosítsunk specifikus DNS részleteket. A PCR eljárása húszharminc ciklusból áll, amelyek 3 lépést tartalmaznak (10. ábra). Elsőként a DNS-szálakat szeparálni kell egymástól. Ehhez a PCR készülék a reakcióteret C-ra hevíti, amely során a magas hőmérséklet hatására a kettős láncot összekapcsoló hidrogénkötések felbomlanak, a DNS denaturálódik. A PCR eljárás indításakor ez a denaturáció hosszabb ideig zajlik, külön beállított ideig, amely nem kapcsolódik az ismétlődő ciklusokhoz, hogy ez alatt az idő alatt mind a templát, mind a primer kettős szálak maradéktalanul szétváljanak, ez növeli az eljárás hatékonyságát. A 19

20 ciklus következő lépése az anelláció, vagy illeszkedési lépés: a reakciótér alacsonyabb hőfokra hűtése, hogy a primerek hozzátapadhassanak a templát DNS-hez. A hőmérséklet függ a primer olvadási hőmérsékletétől, mert a nem megfelelő hőmérséklet vezethet aspecifikus letapadáshoz, vagy a letapadás elmaradásához. Végül egy speciális, hőstabil DNS polimeráz a primerektől kezdve meghosszabbítja a DNS szakaszt, amelynek során a hőmérséklet a polimeráz hőmérséklet optimumától függ. 98 C 98 C 98 C 66 C 72 C 72 C 72 C D D A P D P 10x 20x tárolás 4 C A primerek elősegítik a polimeráz működését, és kijelölik a felszaporítani kívánt génszakasz határait. Fontos, hogy olvadási hőmérsékletük hasonló legyen, és a kitapadási hely specifikus legyen, lehetőleg a templát DNS-en csak egy adott helyen tapadhassanak ki. A reakcióhoz New England BioLabs nagy pontosságú Phusion Hot Start Flex DNS polimerázt és Phusion puffert, valamint 10 mm koncentrációjú dntp-t használtam, amely tartalmazza az összes, a DNS alkotóelem dezoxinukleotid-trifoszfátot azonos koncentrációban. A reakcióelegyet 50 l végtérfogattal állítottam össze úgy, hogy a primerekre nézve 0.25 M, a dntp-re nézve 0.2 M legyen. Hozzáadtam 60 ng templátot, 1 l polimeráz enzimet, és 10 l 5x tömény Phusion puffert, a maradék térfogatot pedig nukleázmentes vízzel egészítettem ki. A PCR program beállításait a 11. ábra mutatja. 11. ábra PCR eljárás sematikus ábrája 20

21 Agaróz gélelektroforézis A PCR reakció során a keletkező DNS termékek méretét agaróz gélelektroforézissel ellenőriztem, ami egy általánosan használt módszer a DNS fragmensek elválasztására, azonosítására (12. ábra). Az elektroforézis során a megfuttatandó minta elektromos térbe kerül, aminek hatására a töltésének megfelelően elmozdul az agaróz mátrixban. A DNS szálai nukleotid egységenként egy negatív töltéssel rendelkeznek a cukor-foszfát gerinc foszfát csoportjai révén, így a pozitív elektród felé mozdulnak el. Mindez lehetővé teszi a méret szerinti elválasztást, a kis molekulatömegű DNS fragmensek gyorsabban, a nagyobbak lassabban haladnak a gélben. A gélben a haladási sebességet a DNS konformációja is befolyásolhatja. Az önmagába záródott DNS, plazmid formában, képes a kompakt, különösen jól feltekeredett, ún. supercoiled állapot felvételére, ami gyorsabb sebességet tesz lehetővé az elektroforézis során. A futási sebességet befolyásolja még az agaróz koncentrációja, és az alkalmazott áramerősség is. DNS felvitele a zsebekbe DNS haladási iránya DNS minta Elektroforézis elindítása Elválasztás a molekulaméret szerint 12. ábra Agaróz gélelektroforézis Munkám során 0.75 %-os agaróz gélt készítettem. 150 mg agarózt melegítés közben oldottam fel 22 ml TAE pufferben (40 mm Tris-acetát, 1 mm M EDTA, ph=8.0). A 21

22 homogén oldatot kb. 60 C-ra hűtöttem, majd hozzáadtam GelRed TM festéket (Biotium) 1: szeres hígításban, amely az etídium-bromidhoz hasonló szerkezetű fluorofór molekula, azonban az előzővel ellentétben nem mérgező, mivel nem képes átjutni a sejtmembránon. A festékmolekulák beékelődnek a kettős szálú DNS szálai közé, és UV fény gerjesztés hatására a látható hullámhossz tartományban bocsátanak ki fényt, ami lehetővé teszi a megfuttatott DNS darabok helyének meghatározását, a gélt elemzését. A minták mellett a ThermoScientific cégtől vásárolt, GeneRuler TM 1 kb Plus ismert molekulatömegű DNS fragmenseket tartalmazó mintáját is futtattam, a méret szerinti azonosításhoz. A módszer lehetővé teszi az elválasztott nukleinsav összetevők preparatív izolálását is, a futtatás után csak a kívánt DNS mintát tartalmazó gél darab kivágásával. A preparatív agaróz gél öntésénél 28 ml 0.75 %-os gélt készítettem, hogy a gél zsebeibe nagyobb mennyiségű mintát tudjak tölteni. A futtatáshoz használt eszközök szennyező DNS tartalmát ehhez mosószeres, majd desztillált vizes és etanolos mosással távolítottam el, hogy minél tisztább terméket nyerhessek az ezt következő tisztítási lépés során Restrikciós emésztés és ligálás A PCR eljárás során nyert DNS-t megtisztítottam, hogy megszabaduljak a reakció során megmaradt dezoxinukleotidoktól, primerektől, a polimeráztól és a nem megfelelő méretű PCR terméktől. Két lehetőség van a DNS kitisztítására: oldatból vagy agaróz gélből. A tisztítást a restrikciós emésztés előtt oldatból, Sigma-Aldrich GenElute TM PCR Clean- Up Kit segítségével végeztem a gyártó által megadott protokoll szerint. A PCR módszerrel felszaporított DNS szakaszokat, valamint a felhasználni kívánt pet- 15b plazmid vektort restrikciós endonukleáz enzimekkel kezeltem. A kiválasztott pet- 15b vektor tartalmaz T7lac promótert valamint beépített His-tag-et, ami egy leolvasási keretbe esik a rekombináns fehérjével, ezáltal a kifejeztetett fehérjében egy His-tag jelenik meg annak N-terminálisán. A pet-15b vektor térképén (13. ábra) látható, hogy több restrikciós emésztési helye van (NdeI, XhoI, BamHI), mi az NdeI és BamHI helyeket választottuk, amelyet már a primer tervezésénél is figyelembe vettünk. Az emésztéshez a vektor DNS-ből 50 ng-ot mértem be, a tisztított PCR-termékekből pedig az összeset, hogy minél több DNS-t nyerjek. A restrikciós enzimeket gyártó New 22

23 13. ábra A pet-15b vektor géntérképe England BioLabs által ajánlott CutSmart puffert, valamint magas megbízhatóságú BamHI-HF, és NdeI restrikciós enzimeket használtam a reakcióhoz. 2 órán keresztül 37 C-on emésztettem meg a DNS-eket, majd az emésztő enzimeket 80 C-on 20 percig inaktiváltam, a gyártó javaslatának megfelelően. A folyamat eredményeként az emésztett PCR termék, ill. vektor DNS szakaszok egymással kompatibilis ragadós végekkel rendelkeznek. A restrikciós terméket preparatív agaróz gélben 100 V feszültségen 50 percig futtattam, és a megfelelő csíkokból Sigma-Aldrich GenElute TM Gel Extraction Kit segítségével a gyártó leírása szerint izoláltam a DNS-t. A ligálás előkészítéséhez az emésztett és tisztított plazmidot és a beklónozni kívánt DNS fragmenseket 5:1 inszert:plazmid arányt alkalmazva elegyítettem. A kompatibilis ragadós végek helyes összetapadását először 90 másodpercig 70 C-on termosztálással, majd 2 percig jégen hűtéssel biztosítottam. T4 DNS ligáz enzim és puffer hozzáadása után 16 C-on 12 órán át hagytam lejátszódni a ligálási reakciót Kompetens sejt készítés A rekombináns DNS bejutattásához a sejteket először kompetenssé kell tenni, amelyet kémiai úton, a használt oldatokban lévő sókkal, ionokkal értem el. Az E. coli sejteket 23

24 egy éjszakán át 37 C-on növesztettem, olyan tápoldatban, amely antibiotikumot tartalmazott (E. coli Rosetta esetében klóramfenikolt, E. coli XL1-Blue esetében tetraciklint), így biztosítva a szelektív növekedést. Az előkultúrát 50 ml friss Luria- Bertani (LB) tápoldatba oltottam, és klóramfenikol jelenlétében szaporítottam tovább A600=0.4 optikai denzitás eléréséig, ahol a sejtek exponenciális növekedési fázisban vannak. Ekkor a sejteket 10 percre jégre tettem, majd az inkubáció után 1380 g-n 20 percig 4 C-on lecentrifugáltam, és elöntöttem a felülúszót. A pelletet 10 ml TFB I. oldatban (100 mm RbCl, 50 mm MnCl2, 30 mm K-acetát, 10 mm CaCl2, 15% glicerin, ph=5.8) visszaszuszpendáltam, a szuszpenziót 20 percig jégen állni hagytam, majd újra lecentrifugáltam ugyanolyan körülmények között, és elöntöttem a felülúszót. Ezután a sejtcsapadékot 1 ml TFB II. oldatban (10 mm MOPS, 10 mm RbCl, 75 mm CaCl2, 15% glicerin, ph=6.8) szuszpendáltam vissza, majd újra 20 percre jégre tettem a szuszpenziót. Az inkubációs idő eltelte után 150 l 90%-os steril szűrt glicerint adtam hozzá, és 100 l-es porciókban -80 C-on tároltam a felhasználásig Transzformálás A kémiai transzformálás a rekombináns DNS baktérium sejtbe juttatásának egyik legáltalánosabban használt módja, mely során a DNS bejuttatásához kémiai és hősokk hatással növelik meg a sejtfal permeabilitását. A transzformálás során a tervezett PfCCT konstrukciókat kódoló génszakaszt tartalmazó pet-15b plazmid DNS-t juttattam be E. coli sejtekbe. Amennyiben a célom a fehérjetermelés volt, az erre a célra kifejlesztett E. coli Rosetta(DE3)pLysS típusú sejteket használtam, ami klóramfenikol rezisztencia gént tartalmaz. Plazmid szaporítás céljára XL1-Blue E. coli baktérium törzset használtam, amely tetraciklin rezisztenciát hordoz. A transzformálás során 100 l kompetens sejthez adtam 1 l mm -merkaptoetanolt, majd jégen állni hagytam 5 percig. A várakozás után hozzáadtam 3 l-t az 50 ng/ l koncentrációjú plazmidból, és újabb 30 percig hagytam jégen állni az elegyet. A hozzáadott plazmid mennyiségét úgy választottam meg, hogy körülbelül ng DNS-t juttassak a sejtbe. Ezután hősokkot alkalmaztam, 60 másodpercig 42 C-os termosztátba, majd két percig jégre téve az elegyet tartalmazó Eppendorf csöveket. Ezzel biztosítottam, hogy a sejtfal szerkezetének hirtelen fellazulása révén a plazmid képes legyen bejutni a sejtekbe. A hősokk után 250 l steril Luria-Bertani tápoldatot (LB) adtam az elegyhez és 24

25 37 C-os rázatógépben 200 rpm fordulatszámon rázatva inkubáltam 1 órát. Az elegyet alacsony fordulatszámmal centrifugáltam a baktériumok ülepítéséhez, majd a felülúszó nagy részének leszívása után újra felszuszpendáltam a baktériumokat, majd fehérje termeltetéshez folyékony tápoldathoz adtam, klónozás során pedig a ligátummal transzformált sejteket szilárd táptalajon kentem szét. A tápoldathoz előzőleg hozzákevertem karbenicillint, amelynek rezisztencia génjét a transzformált pet-15b plazmid tartalmazza, és a használt baktérium törzs saját antibiotikum rezisztenciájának megfelelően klóramfenikolt vagy tetraciklint. Ezzel biztosítottam, hogy csak azok a baktériumok szaporodjanak, amelyek tartalmazzák a kifejeztetni kívánt génszakaszt. Egy éjszakán át, órán keresztül 37 C-os termosztátban folyékony tápoldat esetén 200 rpm rázatás mellett, szilárd táptalaj esetén anélkül inkubáltam a sejteket Fehérje kifejeztetése rekombináns módon A fehérje kifejeztetéshez használt Rosetta (DE3)pLysS E. coli törzs egy DE3 nevű profágot tartalmaz, amely hordozza a T7 RNS-polimeráz gént és az átírását szabályzó lac represszort. A hozzáadott laktóz, vagy laktóz analóg izopropil- -D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) képes kötődni a lac represszorhoz, ezáltal feloldva annak átírás gátló hatását. A sejtben így termelődő T7 RNS-polimeráz a transzformálással bejuttatott pet-15b plazmid T7 promóter régiót felismeri, és átírja a promóter után elhelyezkedő kifejeztetni kívánt gént. 500 ml steril LB-hez adtam hozzá 500 l-t a transzformált E. coli Rosetta (DE3)pLysS sejtekből, majd rázógépben inkubáltam 37 C-on, hogy elérjem a kellő sejtszámot. A sejtek szaporodását az oldat 600 nm-en mért optikai denzitásának (OD600) követésével ellenőriztem többször az inkubáció során. A lombikból kivett 1 ml minta abszorbanciáját WPA biowave CO8000 Cell Density Meter készülékkel mértem. A sejtek növekedésének exponenciális fázisában, amikor az OD elérte a 0.5-öt, a rázó hőmérsékletet átállítottam 16 C-ra. Ezután hozzáadtam az IPTG-t a megfelelő koncentrációban, indukálva ezzel a rekombináns fehérje expresszióját. Az expressziót egy éjszakán át végeztem, majd az így kapott szuszpenziót lecentrifugáltam 3220 g centripetális erővel, 20 percig 4 C-on, majd az edény aljára lerakódott sejt pelletet foszfát pufferben (PBS) szuszpendáltam vissza. Újabb centrifugálási lépés következett, 25

26 amely után a pelletet feltártam, vagy folyékony nitrogénben lefagyasztva -80 C-on tároltam pár hétig Sejtfeltárás A sejt pelletet a felolvasztás után lízis pufferben szuszpendáljuk vissza. Az általam használt lízis puffer a következőket tartalmazza: 20 mm Hepes, 100 mm NaCl, 0.5 mm etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA), 10 mm -merkaptoetanol, 0.5 mm benzamidin (BA), 100 mm fenilmetilszulfonil-fluorid (PMSF), 0.1 % Triton-X, DNáz I, RNáz A. A hozzáadott Triton-X növeli a sejtmembrán permeabilitását. A lízis során felszabadulnak olyan proteázok is, amelyek roncsolhatják a termékünket és kofaktorai fémionok. Ezek hatását akadályozza meg az EDTA, amely komplexet képez a kétértékű fémionokkal, így azok elérhetetlenné válnak ezen proteázok számára. A szerin proteázokkal szemben véd a PMSF, a BA pedig a trombin proteázok irreverzibilis inhibitora. A három említett összetevővel tehát gátolhatjuk azon enzimek működését, amelyek roncsolhatnák az általunk termelt enzimet és a lízis során vele egy térbe kerültek. Első lépésben mechanikus feltárást végeztem álló helyzetű Potter-Elvehjem homogenizátorral, amelynek segítségével a sejt pelletet a lízis pufferben homogenizáltam. A kézi sejtfeltárást egy ultrahangos eljárás követte, amelynek során 4x1 percig szonikáltam a homogén oldatot 6-os ciklusokban (1 másodpercből a berendezés 0.6 másodpercet szonikál, 0.4 másodpercet pihen ). Mivel ez a lépés hő fejlődéssel jár, nagyon fontos, hogy közben hűtsük az oldatot, nehogy a fehérjét károsodás érje, így az edényt jégen tartva végeztem el a kezelést. Az oldatba vitt fehérjét centrifugálással választottam el a többi sejtalkotótól: g-n 30 percig 4 C-on végeztem ezt a műveletet. Ezután a fehérjénk a felülúszóban található meg és készen áll a tisztításra Fehérje-tisztítás és dialízis A rekombinánsan termelt fehérjét az egyéb, a termeltető E. coli gazdából származó fehérje és nukleinsav szennyezőktől, Ni-nitrilotriecetsav (Ni-NTA) affinitás kromatográfiával választottam el, ami a rekombináns fehérje tisztítás legelterjedtebb módja. A kromatográfia álló fázisát egy olyan gyanta képezi, amelynek alapja agaróz gyöngy, amelyre Ni 2+ -ionok vannak kötve. A tisztítandó rekombináns fehérje egy 26

27 genetikailag kódolt 6x hisztidin epitóp címkét (His-tag) tartalmaz. Az egymás mellett elhelyezkedő hisztidinek imidazol oldalláncai hatékonyan komplexálják a Ni 2+ -ionokat (14. ábra), így a His-címkés fehérje szelektíven képes kötődni a gyantához, a szekvenciális hisztidin csoportosulásokat jellemzően nem tartalmazó egyéb fehérjékhez képest. A fehérje elúcióját imidazollal végeztem, amely magas koncentrációban leszorítja az oszlopról a megkötött enzimet. agaróz-gyöngy 14. ábra Ni-NTA rendszer Az oszlopot először előkészítettem, a 20 %-os etanolban tárolt gyantát kiöntöttem az erre a célra gyártott műanyag oszlopba, körülbelül 1 ml ülepítési térfogattal, majd mostam először vízzel, majd CCT-pufferrel (20mM Hepes, 100 mm NaCl, ph=7.5). Az így elkészített oszlop 4 C-on tárolható. A felülúszóhoz hozzáadtam 0.5 mm Mg 2+ és 10 mm imidazolt. A magnézium az EDTA semlegesítésére szolgál, az imidazol pedig segít megakadályozni az aspecifikus kötődések kialakulását az oszlopon. Óvatosan, ügyelve arra, hogy az felülete egyenletes maradjon felvittem az oszlopra a felülúszót, majd átengedtem és az áteső frakciót is gyűjtöttem, hogy később a tisztítás minőségét ellenőrizhessem SDS-PAGE gélen. Az oszlopot ezután több lépésben mostam. Elsőként magas sótartalmú pufferrel (20 mm Hepes, 1 M NaCl), majd alacsony koncentrációjú imidazolos pufferrel (20 mm Hepes, 100 mm NaCl, 50 mm imidazol), hogy a szennyeződéseket és a nem specifikusan kötődő fehérjéket eltávolítsam. Az 50 mm imidazolos mosás alatt a frakciókat 5 ml-enként gyűjtöttem, és ellenőriztem a fehérjekoncentrációt. Amint megjelent a fehérje az áteső frakcióban elkezdtem az elúciót. Az elúciót 250 mm imidazol koncentrációjú oldattal végeztem, a frakciókat 1 ml-enként gyűjtöttem, majd 27

28 mindnek megmértem a koncentrációját (15. ábra). Ez alapján eldöntöttem, hogy melyik frakciókat egyesítsem és végezzem el a dialízist. a szennyezőket lemossuk a fehérjéket tartalmazó keveréket felvisszük az oszlopra az elválasztani kívánt fehérjét az imidazol oldattal eluáljuk elválasztani kívánt fehérje hordozóhoz kötött Ni 2+ -ion szennyező fehérje 15. ábra Ni-NTA affinitás kromatográfia Az oszlopot később újra fel lehet használni az adott fehérje tisztítására, ehhez 1 M imidazol oldattal, CCT-pufferrel és desztillált vízzel kell mosni, majd etanolban tárolható 4 C-on. Az affinitás kromatográfia elvégzése után a fehérje 250 mm imidazol koncentrációjú pufferben van, amely számunkra nem előnyös, ettől az imidazoltól meg kell szabadulnunk, erre szolgál a dialízis. A dialízis során Sigma-Aldrich cellulóz dialízis membránt használtam, amely csak 14 kda-nál kisebb molekulákat enged át. A nagyobb molekulatömegű fehérjék átjutása a membránon gátolt, azonban az oldószer molekulák, és a sokkal kisebb méretű imidazol képes átjutni rajta. A dialízis során a membrán két oldalán az ozmózis nyomása az oldatoknak különböző, ami kiegyenlítődésre törekszik, ami a membrán szelektív áteresztése révén valósul meg. A dialízis membránt megfelelően mostam, majd az egyesített elúciós frakciókat belepipettáztam. A dialízis puffer tartalmaz 20 mm Hepest, 100 mm NaCl-ot, 10 mm - merkaptoetanolt. A dialízist 16 órán keresztül, folyamatos kevertetés mellett, 4 C-on végeztem, majd a kapott fehérjeoldatot a kívánt koncentrációjúra Merck Millipore 28

29 Amicon Ultra töményítő oszlopon centrifuga segítségével töményítettem 3220 g-n a megfelelő ideig. A töményítő oszlop a 10 kda-nál kisebb molekulákat átengedi, így a puffer-oldat bizonyos része az áteső frakcióba kerül. A fehérje tisztasága tovább növelhető méretkizárásos kromatográfia segítségével Gélszűrés A gélszűrés, vagy más néven méretkizárásos kromatográfia a fehérjék oldatbeli mérete szerinti elválasztását teszi lehetővé. A gélszűrő oszlop határozza meg azt a tartományt, amelyben az elválasztás hatékonyan történik. Ez az oszlop jól definiált pórusméretű gyöngyökkel van töltve, amelyek alkotnak egy mátrixot, ami az elválasztás alapja. A gélszűréssel kiválasztható fehérje mérettartomány különbözik az egyes oszlopokra. A kisebb méretű fehérjék beférnek a pórusokba, ezáltal sokkal lassabban haladnak az oszlopon, mint a nagyobb molekulatömegűek. Az oszlopról először a nagyobb méretű fehérjék jönnek le, azok, amelyek csak a gyöngyök közötti térfogatot (kizárási térfogat) járják be az elúció során, majd az egyre kisebb méretűek. Ezzel a módszerrel megszabadulhatunk a fehérjénktől különböző molekulatömegű szennyezőktől. A gélszűrés során GE Healthcare AKTA készüléket használtam Superose 12 oszloppal, gélszűrő puffernek pedig 20 mm Hepes, 100 mm NaCl, 0.5 mm tris-(2-karboxietil)-foszfin (TCEP) tartalmú, ph=7.5 oldatot használtam. A TCEP redukálószer, amely a fehérjemintákat reduktív környezetbe helyezi, ami megakadályozza az oxidatív degradációt, vagy a fehérje oldalláncok esetleges dezaminálódását. Ezt a puffert a folyamat előtt steril szűrtem, valamint ultrahanggal gáztalanítottam, nehogy az oszlopra valamilyen szennyeződést, vagy levegőt juttassak. Az eluált frakciókat 1.5 ml-es Eppendorf csövekbe gyűjtöttem, és koncentrációméréssel ellenőriztem, hogy melyik frakciókban jött le az oszlopról az AV Q konstrukt Fehérjevizsgálati módszerek Fehérjekoncentráció-meghatározás A tisztítás során a minták koncentrációját NanoDrop 2000c spektrofotométer segítségével mértem. A készülék előnye, hogy nagyon kis térfogatú, akár 2 l oldat 29

30 abszorbanciáját is megfelelő pontossággal képes meghatározni. A fehérje koncentrációt a 280 nm hullámhosszon mért fényelnyelés alapján határoztam meg a Lambert- Beer-törvény alapján: A = ε l c, ahol a fajlagos abszorpciós koefficiens [ml/mg cm], l az optikai úthossz [cm], c a koncentráció [mg/ml] Nátrium-dodecil szulfátos poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) Az eljárás a fehérjék méret szerinti elválasztására alkalmas gyakorlati módszer. Ezzel ellenőrizhettem a tisztítás minőségét, valamint azt, hogy a különböző lépések során milyen szennyezőkről szabadultam meg. A gélelektroforézis során a rendszert elektromos térbe helyeztem, amely hatására a töltött molekulák az ellentétes töltésű pólus felé mozdulnak el. Nátrium-dodecil szulfát (SDS) valamint ditiotreitol (DTT) hozzáadása során a fehérjék kitekerednek, mert a DTT redukálja a diszulfid hidakat, az SDS pedig fellazítja a fehérjék hidrofób magját és egyenletes negatív töltéssel vonja be őket. A fehérjék tehát a kezelés után hasonló töltéssel és alakkal rendelkeznek, az elválasztás a méretük alapján történik. Az összes oldatban lévő fehérje egy irányba, a pozitív töltésű elekrtód felé vándorol, a kisebbek gyorsabban, a nagyobbak pedig lassabban haladnak a gélen (16. ábra). Az elválasztásra szolgáló gél pórusmérete a beletett bisz-akrilamid töménységétől függ, amely a polimerizáció után az elválasztásra szolgál. Gélöntés során gyökös polimerizáció játszódik le, ammónium-perszulfát katalizátor (APS) és N,N,N,N - tetrametil-etilén-diamin (TEMED) iniciátor hatására. A gél két részből áll: egy tömörítő és egy elválasztó zóna. A tömörítő zónában a biszakrilamid koncentrációja és a ph is alacsonyabb, amely lehetővé teszi, hogy a felvitt oldatban lévő fehérjék összegyűljenek egy sávba (frontvonalba), ahonnan indulhatnak az elválasztó zóna felé. Az elválasztó zóna töményebb, magasabb ph-val rendelkezik, amely biztosítja a fehérjék mobilitását, így különböző sebességgel haladhatnak tovább. Az elválasztó és a tömörítő zóna között háromszoros bisz-akrilamid koncentráció különbség van. A kísérlethez először gélt kell önteni. Két üveglap közé először az elválasztó gélt juttatjuk be Pasteur-pipettával: 12% akrilamid, elválasztó puffer (1.5 M TRIS-HCl 30

31 ph=8.8), katalitikus mennyiségű APS és TEMED. Ezután hasonlóképpen megöntjük a tömörítő gélt, amely 4% akrilamidot, tömörítő puffert (0.5 M TRIS-HCl ph=6.8), APS-t és TEMED-et tartalmaz, és belehelyezzük a fésűt, amely kialakítja a zsebeket. A megszilárdult gélt futtatókádba helyeztem, majd felöntöttem futtató pufferrel (25 mm TRIS, 192 mm glicin, 0.1% SDS, ph=8.5). A mintákhoz hozzáadtam a mintakoktélt (250 mm TRIS, ph=7.8, 50 % glicerin, 0.05 % brómfenolkék festék, 10 % SDS, 250 mm DTT), és 5 percig 98 C-on forraltam őket, ami lehetővé teszi a fehérjeszerkezet kitekeredését, és megkönnyíti az SDS hozzáférését. Az egyik zsebbe ismert molekulatömegű létrát juttattam, a többibe felvittem a mintákat és 50 percig 180 V feszültségen futtattam. katód fehérjeminta futtató kád diszulfid-híd puffer gél anód SDS puffer SDS 16. ábra SDS gélelektroforézis Differenciális pásztázó fluorimetria (Thermofluor) A differenciális pásztázó fluorimetria vagy Thermofluor egy nagy felbontású módszer fehérje minták letekeredési (olvadási) hőmérsékletének meghatározására [30]. A mérés során egy hozzáadott festék fluoreszcenciájának növekedését követtem, 31

32 fokozatos melegítés mellett. A festék vizes közegben alacsony fluoreszcencia jelet ad, azonban a fehérje denaturációja következtében elérhetővé váló hidrofób régiókhoz kötődve fluoreszcenciája megnövekszik. A kiértékelés során meghatároztam a hőmérséklet-fluoreszcencia görbe inflexiós pontját, amely hőmérséklet a fehérje olvadási pontjának (Tm) tekinthető. A mérést Agilent Technologies Stratagene Mx3000P qpcr készülékben végeztem. 25 l végtérfogatú elegyeket 96-lyukú PCR-tálcán mértem össze, amelyet speciális hőálló fóliával fedtem le. 1 l 40-szer higított SYPRO Orange fluorofór festéket (Invitrogen) adtam 24 l 2 mg/ml koncentrációjú fehérje, illetve fehérje-ligand komplex oldathoz. A mérés során a műszer 25 C-ról 85 C-ra melegítette fel a mintákat, 0.5 C értékenként leolvasva azok fluoreszcenciáját. Az értékeket Origin 8 programmal ábrázoltam, majd a nyers adatsor pontjaira szigmoid görbét illesztettem a következő egyenlet szerint: y = F + (F F )/(1 + e ) ahol Fmin a natív fehérjeállapotra jellemző fluoreszcencia érték, Fmax a kitekert fehérjeállapotra jellemző fluoreszcencia érték, és Tm a becsült olvadási hőmérséklet, azaz a görbe inflexiós pontja Fluoreszcens spektroszkópia A fehérjék saját fluoreszcenciáját az őket felépítő aromás aminosavak (triptofán, tirozin, fenilalanin) okozzák, melyek ultraibolya fény hatására gerjesztődnek, majd az elnyelt energiát nagyobb hullámhosszú fény formájában ns nagyságrendű időtartam alatt sugározzák ki. A PfCCT konstrukciók ligand kötésének vizsgálatára triptofán fluoreszcencia módszert használtam, a mintát 295 nm-en megvilágítva, ahol a triptofán a többi aromás oldallánchoz képest szelektíven gerjeszthető (17. ábra). 32

33 Elnyelési spektrum Hullámhossz, [nm] 17. ábra A fehérjék saját fluoreszcenciáját adó aminosavak elnyelési spektruma. A fluoreszcencia mérés során a gerjesztést 295 nm-en végezzük, ahol a triptofán a többi aromás oldallánchoz képest szelektíven gerjeszthető. A méréseket Fluoromax-3 spektrofluoriméterrel végeztem. A megvilágítás és a detektálás merőleges elhelyezése biztosítja, hogy a gerjesztő fény ne zavarja a fluoreszcens sugárzás mérését (18. ábra). 18. ábra Spektrofluoriméter felépítése Ez a módszer érzékenyen képes követni a triptofánt tartalmazó fehérje-ligand kölcsönhatásokat, mivel a ligandum kötése a fluoreszcens jelet adó triptofán mikrokörnyezetének megváltozásához vezethet, ami a fluoreszcencia mértékét befolyásolja. A mérés során 3 M koncentrációjú fehérjeoldatot titráltam M 33

34 CDPCho-nal, felvettem az emissziós spektrumokat nm között, és vizsgáltam a fluoreszcens jel intenzitásának maximumát, maximumának intenzitását és a hozzá tartozó hullámhossz értéket. A mérést Fluoromax-3 spektrofotométerrel Hellmex 1 cm optikai úthosszú küvettával 800 l térfogatban végeztem Steady-state enzimaktivitás mérés A mérés célja az enzim katalitikus hatékonyságának megismerése. Segédenzimek hozzáadásával mértem a PfCCT enzim által katalizált reakció során felszabaduló pirofoszfát mennyiségét. A CTP+ChoP CDPCho + PPi átalakulás során keletkező pirofoszfátot a hozzáadott pirofoszfatáz (PPáz) segédenzim két foszfáttá alakítja, majd ezt használja fel egy újabb segédenzim a purin nukleozid foszforiláz (PNP). A PNP által katalizált reakció során 7-metil-6-tioguanozinból (MESG) 7-metil-6-tioguanin (MES) és ribóz-foszfát keletkezik (19. ábra). A MESG és a MES fényelnyelésének eltérő hullámhosszon van a maximuma, amely végül lehetővé teszi a PfCCT enzim által katalizált reakció követését. + PfCCT enzim + PP i CTP ChoP CDPCho PPáz enzim PP i P i + P i + P i PNP enzim + MESG MES ribóz-1-foszfát 19. ábra Aktivitásmérés során végbemenő reakciók 34

35 A mérést Specord 200 spektrofotométerrel, 1 cm optikai úthosszú küvettában, 20 Con végeztem. A jelváltozást 360 nm hullámhosszon követtem, míg az optikai résszélesség 2 nm volt. 600 l végtérfogatban mértem CCT-pufferben (20 mm Hepes, 100 mm NaCl, ph=7.5). Ehhez adtam hozzá 5 mm MgCl2-ot, 2.08 U/ml pirofoszfatáz (PPáz) és 2.08 U/ml purin nukleozid foszforiláz (PNP) enzimet, illetve 0.33 mm MESG segédszubszrátot. Az elegyhez megfelelő mennyiségű CTP-t és PfCCT enzimet adtam. A segédenzimek és szubsztrátok koncentrációját úgy állítottam be, hogy feleslegben legyenek jelen, így a mérés során a sebességet meghatározó átalakítást a PfCCT enzim végezte. A ChoP szubsztrátot az összes többi komponens után adtam az elegyhez, azzal titrálva az oldatot. A titrálások kezdeti sebességeit Origin 8 programban ábrázoltam a ChoP koncentráció függvényében. A mért adatokra kompetitív szubsztrát inhibíciót is feltételező Michaelis-Menten enzim kinetikai görbét illesztettem: v = v 1 + K [S] + [S] K A fenti egyenletben v a reakciósebességet (s -1 ), vmax a maximális reakciósebességet (s -1 ), [S] a ChoP titrálás során változtatott koncentrációját (mm), KM a ChoP Michaelis állandóját (mm), a ChoP az enzim aktivitás felére csökkenését eredményező inhibíciós ChoP kötési állandót (mm -1 ) jelzi Homológia modellezés A homológia modellezést kérésünkre Krámos Balázs a BME VBK Szervetlen és Analitikai kémia Tanszékének doktoráns munkatársa végezte el a Modeller programmal. A modellezés előtt ki kellett választanunk egy olyan ismert térszerkezetű homológ fehérjét a fehérje adatbázisból (Protein Data Bank) melynek a szekvenciája a legnagyobb mértékben azonos az általunk vizsgált fehérjével. A program az ismert és ismeretlen szekvenciákat egymásra illeszti, majd az ismeretlen szekvenciát úgy helyezi el, hogy annak atomjai az ismert szekvencia atomjaival azonos helyen legyenek. A program ezután energiaminimum számításokat végez. A különböző aminosavak oldalláncainak helyzete nem pontosan meghatározható, de a program definiál lehetséges rotációs állapotokat, és ezek közül kiválasztja azt, amelyik a legvalószínűbb. 35

36 Eközben figyelembe veszi a flexibilitási kritériumokat, valamint a kötésszögeket és kötéstávolságokat. Az összes ilyen lehetséges modellt felépíti a program, majd minderre elvégzi az energiaszámításokat. Végül kiválasztja azt, amelyik a legalacsonyabb értékű helyet foglalja el Fehérje kristályosítás A fehérjék háromdimenziós szerkezetének meghatározására két módszert használnak, a magmágneses rezonancia (NMR) spektroszkópiás, valamint röntgen diffrakciós vizsgálatot. A diffrakciós kísérlet során a röntgensugár a makromolekulák által alkotott rácson szóródva szolgáltatja a szerkezetmegoldás során használt diffrakciós képet. A fehérjék oldatukból rendezett állapotban történő kiválását segíti elő a fehérje kristályosítás. Ehhez kulcsfontosságú a felhasznált fehérje oldat homogenitása és tisztasága. A kristályosodás elősegíthető a megfelelő koncentrációjú fehérje oldat ph értékének beállításával, valamint a különböző kicsapó szerek illetve kristályosító adalékanyagok megfelelő mennyiségének biztosításával. A fehérje cseppet az egymástól eltérő kristályosító körülmények egy nem átfedő mátrixának, az ún. kristályosító screen oldatainak cseppjeivel összekeverve lehet keresni a fehérje kristályosodását eredményező körülményt. Munkám során a gőzdiffúzió elvén alapuló függőcseppes, ill. ülőcseppes fehérje kristályosítási módszereket használtam (20. ábra). Mindkét esetben egy légmentesen lezárt térrész tartalmazza a kristályosítandó fehérjecseppet, valamint a kristályosító körülmény oldatát. A két oldat feletti térrészben a gőznyomás kiegyenlítődik, a csepp a fehérjére nézve lassan töményedni kezd. A kristályosítás az esetek nagy részében hetekig, akár hónapokig tart, eleinte csak mikrokristályok keletkeznek, majd optimális esetben azok indulnak növekedésnek. 36

37 fedőlemez fedőfólia szilikon zsír ragasztó fehérje+ fehérje+ kicsapószer kicsapószer tiszta kicsapó szer tiszta kicsapó szer függőcseppes módszer ülőcseppes módszer 20. ábra Kristályosítási módszerek Amennyiben pozitív eredményt hoz a kísérlet, további optimalizáció szükséges. Ennek során újabb tálcákat raknak fel, amelyeken például a ph, a kicsapó szer koncentráció, vagy fehérje koncentráció változtatásával a lehető legjobban mérhető kristályokat hozzák létre. Meg kell győződni arról is, hogy nem hibás-pozitív eredmény jelentkezett, vagyis a kristály fehérjét tartalmaz-e, vagy egyéb komponenseket, amelyet a körülmény tartalmaz. A legegyszerűbb megoldás a kristályok UV-fénnyel történő megvilágítása, ugyanis a triptofánt tartalmazó fehérjék kristályai megkülönböztethetőek jelentős fluoreszcenciájuk alapján a kismolekulás, nem fluoreszcens kristályoktól. A vizsgált fehérjék kristályosítására ülő-, és függőcseppes módszert alkalmaztam (20. ábra). A nagy tisztaságú fehérjeoldatot mg/ml koncentrációjúra töményítve használtam, a cseppben a fehérje-oldat aránya 1:1, 1:2 vagy 2:1 volt a kicsapó szerhez képest. Függőcseppes, 24-lyukú tálcás kristályosításnál a cseppeket kézi automata pipettával vittem fel az óraüvegre, így ebben az esetben 2 l végtérfogatú cseppet tettem fel. Az ülőcseppes 48-lyukú tálcák esetén a térfogat kimérését TTP Labtech mosquito nanopipettázó robot segítségével végeztem, amely lehetővé teszi nagyon kis mennyiségek felvitelét a tálcára, ami ebben az esetben nl-t jelent. A felrakott fehérje oldatok minden esetben tartalmaztak TCEP redukálószert, amelyet a gélszűrő pufferhez adtam. Ez segít megelőzni a degradációs folyamatokat. A fehérjét a különböző ligandumjaival együtt kívántam kristályosítani, ezért különféle 37

38 koncentrációkban kevertem az oldatokhoz CTP-t, ChoP-ot és CDPCho-t az optimalizáció során. 38

39 4. Eredmények Munkám során három különböző konstrukcióval dolgoztam, az eredményeket módszerek szerint csoportosítva mutatom be az átláthatóság és az összehasonlíthatóság miatt, amely fontos szempont volt az eredmények értékelése során Új konstrukciók tervezése A kristályosításra szánt PfCCT fehérje konstrukciók esetén a tervezésnél fontos szempont volt, hogy az irodalmi analógiák alapján azok várhatóan kristályosíthatóak legyenek, enzimatikus funkcióval rendelkezzenek és kristályosíthatóság szabta lehetőségek szerint minél több szerkezeti információt képesek legyenek szolgáltatni. A kezdetben általam vizsgált PfCCT AV Q konstrukció megtervezésénél a 2009-ben megjelent patkány CCT kristályszerkezeti modellt vették alapul (PDB-kód: 3HL4) [22], mely esetén a konstrukció határait a patkány fehérje konstrukció látható szerkezeti részei alapján határozták meg. A 2014-ben ismertetett patkány CCT kristályszerkezet (PDB-kód: 4MVC) ezen túl tartalmazza a katalitikus domén C terminálisán elhelyezkedő teljes E-hélixet, melynek fontos működésben betöltött szerepét is megmutatta. Az analógia alapján ezért olyan új PfCCT konstrukciók tervezését kezdtem meg, amelyek kellően rövidek a kristályosításhoz, de tartalmazzák az E-hélixet. Ezáltal lehetőségem nyílik az E-hélix enzimatikus funkcióban betöltött szerepének vizsgálatára a PfCCT enzimben is (21. ábra). 39

40 21. ábra Az emlős CCT (balra) és PfCCT (jobbra) szerkezeti modellje. A PfCCT enzim világosbarna színnel látható az ábrán, amelyre MΔK konstrukció van ráillesztve szürke színnel homológia modellezés segítségével. Látható, hogy már az MΔK konstrukció sem tartalmazza a lizin gazdag régiót. Az új tervezett konstrukciókat CatH1 és CatH2 névvel illettem, ezzel utalva a katalitikus régióra és az E-hélix jelenlétére. Ezek nagymértékben hasonlítanak a PfCCT AV Q konstrukcióhoz, azonban néhány aminosavval hosszabbak. Feltételezésünk szerint az AV Q konstrukció C-terminálisán található E-hélix, amely teljes hosszában megtalálható a nem megfelelően kristályosítható M K konstrukcióban, azonban csak részben az AV Q-ban, szerepet játszhat a CTP-kötésben, ezáltal az enzimatikus funkciók betöltésében. A CatH1 és CatH2 tartalmazza az említett hélixet teljes hosszában, valamint a CatH2 határát egészen a már korábban tárgyalt M K konstrukció végéig (795. aminosav) hosszabbítottam, ahol az említett hélix utáni régió szerepe még nem ismert (22. ábra). A Plasmodium-specifikus lizin-gazdag K régiót ( aminosavak) amely nagyfokú rendezetlensége miatt eltöröltem ezen új konstrukciókból is. 40

41 PfCCT M K PfCCT AV Q PfCCT CatH1 PfCCT CatH2 22. ábra CatH1 és CatH2 konstrukciók sematikus ábrája összehasonlítva a korábbi M K és AV Q konstrukciókkal. prekat pre-katalitikus domén, Kat katalitikus domén, K a szerkezetből eltávolított lizin gazdag loop 4.2. Homológia modellezés Az újonnan tervezett konstrukciók által biztosított in vitro vizsgálat mellett, egy másik eszközt, a homológia modellezést hívtuk segítségül a patkány CCT-ben megtalálható αe-hélix PfCCT analógjának in silico karakterizálásához. A homológia modell elkészítéséhez a 2014-ben megjelent patkány kristályszerkezet (PDB: 4MVC) által szolgáltatott új szerkezeti információt használtuk fel. A modellezés során a 4MVC kristályszerkezet és a PfCCT megfelelő részeinek pontos szekvencia illesztésére volt szükség (23. ábra). 41

42 patkánycct PfCCT AVΔQ PfCCT CatH GLRQPAPFSDEIEVDFSKPYVRVTMEEACRGTPCERPVRVYADGIFDLFHSGHARALM 97 AVPDDDDDDDNSNDESEYESSQMDSEKNKGSIKNSKNVVIYADGVYDMLHLGHMKQLE 638 AVPDDDDDDDNSNDESEYESSQMDSEKNKGSIKNSKNVVIYADGVYDMLHLGHMKQLE 638 patkánycct PfCCT AVΔQ PfCCT CatH QAKNLFPNTYLIVGVCSDELTHNFKGFTVMNENERYDAVQHCRYVDEVVRNAPWTLTPEF QAKKLFENTTLIVGVTSDNETKLFKGQVVQTLEERTETLKHIRWVDEIISPCPWVVTPEF QAKKLFENTTLIVGVTSDNETKLFKGQVVQTLEERTETLKHIRWVDEIISPCPWVVTPEF patkánycct PfCCT AVΔQ PfCCT CatH LAEHRIDFVAHDDIPYSSAGSDDVYKHIKEAGMFAPTQRTEGISTSDIITRIVRDYDVYA LEKYKIDYVAHDDIPYANNQKEDIYAWLKRAGKFKATQRTEGVSTTDLIVRILKNYEDYLEKYKIDYVAHDDIPYANNQKEDIYAWLKRAGKFKATQRTEGVSTTDLIVRILKNYEDYI patkánycct PfCCT AVΔQ PfCCT CatH1 218 RRNLQR ERSLQR ábra A modellezés előtt a 4MVC kristályszerkezet és a PfCCT megfelelő részeinek pontos szekvencia illesztése történt Az Anyagok és módszerek részben leírt számítások alapján kapott modellt összehasonlítva a korábban használt PfCCT AVΔQ homológia modellel (24. ábra) látható, hogy a hozzáadott aminosavak miatt a korábbi csonkolt αe-hélix lefutása megváltozik. Ez alapján feltételezhetjük, hogy az AVΔQ konstrukcióban csonkolt αe-hélix nem volt képes helyesen feltekeredni, ami nagyban befolyásolhatja a katalitikus funkciót. 24. ábra A kapott CatH1 homológia modell (jobbra) összehasonlítva a korábbi AV Q homológia modellel (balra) 42

43 4.3. Klónozás Az új konstrukciók megtervezése után azok előállítása következett. A klónozást az anyagok és módszerek részben leírtak szerint, lépésenként végeztem el. A CatH1 és CatH2 konstrukciót pet-15b vektorba klónoztam BamHI és NdeI restrikciós hasítási helyek közé. Ennek megfelelően megterveztem a primert, amely kódol a konstrukció elejéből és végéből néhány aminosavat, ezzel kijelölve a felszaporítani kívánt DNS szakasz határait, valamint a BamHI és NdeI enzimek által felismert hasítási helyeket. Három primert láttam szükségesnek, mivel a két új konstrukció eleje megegyezik, ezáltal használható ugyanaz a forward primer (F), ellenben a végén található különbség miatt két különböző reverz primer (R) megtervezésére volt szükség (25. ábra). F-primer: NdeI 5 -AGCCATATGGCCGTTCCGGACGATG-3 R-primer CatH1: BamHI 5 -GAACGCTCACTGCAACGCTGAGGATCCTCG-3 5 -CGAGGATCCTCAGCGTTGCAGTGAGCGTTC-3 (rev. compl.) R-primer CatH2: BamHI 5 -GAACTGAATATCGGTGTGACGAAATGAGGATCCTCG-3 5 -CGAGGATCCTCATTTCGTCACACCGATATTCAGTTC-3 (rev. compl.) 25. ábra A PCR-reakcióhoz tervezett primerek, és azok tulajdonságai. Az ábrán aláhúzás jelöli a restrikciós enzimek hasítási helyét. A PCR reakciót lefuttatva megkaptam a felszaporított inszerteket, amelyeket agarózgélen ellenőriztem (26. ábra). 43

44 CatH1-573 bp CatH2 612 bp 26. ábra A PCR reakció során felszaporított inszertek ellenőrzése agaróz gélen. Mellettük ismert bázispár hosszúságú nukleotid létrát futtattam, amely segít megállapítani az inszertek hosszát. Látható a két inszert méretbeli különbsége, mivel CatH2 konstrukció hosszabb (612 bázispár), így a felszaporított inszert is hosszabb, magasabban fut a gélen, mint CatH1 inszertje (573 bázispár). A tesztelt inszerteket, és a pet-15b vektort megemésztettem, így tapadós végű lineáris termékeket kaptam, amelyek összeillenek. Elvégeztem a ligálást, majd a ligátumot E. coli XL1-Blue kompetens sejtbe juttatva egy sejt kolóniákat növesztettem a szelekciót elősegítő antibiotikumot tartalmazó LB szilárd táptalajon. Néhány kiválasztott egy sejt kolóniát folyékony tápoldatba felvéve felszaporítottam a plazmidot, a gyártó utasításainak megfelelően tisztítottam, majd egy kis részét ellenőrzés céljából újra emésztettem, hogy lássam, sikeres volt-e a ligálás (27. ábra). 44

45 Tesztemésztmények Tesztemésztmények CatH1 27. ábra Az ellenőrzés céljából futtatott tesztemésztmény gélképe. Látható, hogy az inszertek kiestek a vektorból, és a hosszúságuk is megfelelő. A tesztemésztés alapján a klónozás sikeres volt, a nukleotid szekvenciát szekvenálással ellenőriztem (Eurofins Genomics). A szekvenálási eredmények kiértékeléséhez ClustalW2 és BLAST illesztő programokat használtam. CatH A fehérjék kifejeztetése A konstrukciókat tartalmazó plazmidokat E. coli Rosetta sejtbe juttattam, azok CatH1 CatH2 28. ábra A fehérje kifejeztetése után készített ellenőrző SDS-PAGE gélképe. A termeltetett fehérjék pozícióját a gélen sárga dobozzal jelöltem. 45

46 expresszióját 0.3 mm IPTG-vel indukáltam, majd egy éjszakán át 16 C-on termosztálás közben 200 rpm-mel rázatva nagy mennyiségű enzimet fejeztettem ki a sejtekkel. Az indukció előtti és a másnap reggeli oldatból mintát vettem, és SDS-gélen vizsgáltam az általam indukált fehérje megjelenését az oldatban (28. ábra) A konstrukciók tisztítása Ni-NTA affinitás kromatográfia Az expresszió után a sejteket centrifugálással szeparáltam, majd az anyagok és módszerek részben leírt módon tisztítottam a fehérjéket AV Q CatH1 CatH2 29. ábra AV Q, CatH1 és CatH2 konstrukciók tisztításának ellenőrzése SDS-PAGE módszerrel. A tisztított fehérjék pozícióját a gélen sárga dobozzal jelöltem. 46

47 A tisztítás lépéseinek ellenőrzésére SDS gélt futattam a különböző lépések során vett, mintakoktéllal kezelt és hődenaturált mintákból (29. ábra). A gélképen látható, hogy a fehérjéhez tartozó sáv nem jelent meg a pelletben valamint a magas só koncentrációt tartalmazó mosási lépésben, ezekben a lépésekben a feltárás és a tisztítás során nem veszítettem a számomra fontos fehérjéből. Effektív veszteséget jelent azonban az áteső frakcióban maradt fehérje, amely nem kötődött fel a gyantára. A fehérje elúciójára a 250 mm imidazol tartalmú oldattal került sor. Látható, hogy ezzel a lépéssel főleg a nagyobb molekulatömegű szennyező fehérjéktől tudtam megszabadítani a konstrukciót. A jó tisztíthatóság vélhetőleg annak köszönhető, hogy a kristályosításra szánt konstrukcióban megszabadultunk a rendezetlen régióktól, amelyek csökkentik a tisztíthatóság mértékét. Mivel a fehérjét kristályosításra szánom, gélszűréssel tovább növelem a 250 mm imidazolos oldattal eluált frakció tisztaságát Gélszűrés A méretkizárásos kromatográfia során a fehérjék a hidrodinamikai tulajdonságaik alapján, méret szerint válnak el, így kihasználtam a kifejeztetett fehérje és a szennyezők közötti különbséget a tisztításhoz. A műszer létrehoz egy kromatogramot, amely alapján tudtam azonosítani az egyes csúcsokhoz tartozó frakciókat (30. ábra) ábra Az AV Q konstrukció gélszűrési kromatogramja (balra), valamint a gélszűrés ellenőrzése SDS-PAGE segítségével (jobbra) 47

48 A gélszűrő oszlopról érkező eluátum fehérjetartalmát UV-fény detektor segítségével 280 és 220 nm-en követtem. 280 nm-es hullámhosszon a fehérjékben megtalálható aromás aminosavak jellemző spektrumot mutatnak, 220 nm-es hullámhosszon pedig a fehérjékben található peptid kötések nyelnek el, amely kevésbé specifikus, de a nagyobb elnyelés miatt érzékenyebb. Ezt kihasználva követtem a mérést mindkét megjelölt hullámhosszon, és azonosítottam az kifejeztetett fehérjét tartalmazó frakciókat. A gélszűrés során a fehérjéhez közelebbi mérettartományba eső szennyezőktől nem tudtam megszabadulni, csak azoktól, ahol a szennyező és a fehérje közötti méretkülönbség jelentős. Az A11-es és A12-es frakciókat választottam ki, mert a kromatogram alapján azok a csúcsfrakciók, ezután egyesítettem őket, és dolgoztam tovább a fehérjével A fehérjék steady-state enzimaktivitás vizsgálata A mérés során a konstrukció enzimaktivitását vizsgáltam steady-state, állandósult állapotban folytonos spektrofotometriás méréssel. A CTP szubsztrát koncentrációját állandó értéken tartva változtattam a másik szubsztrát, ChoP koncentrációját. A kapott kezdeti reakciósebességeket (v0) a ChoP szubsztrát koncentráció függvényében ábrázoltam, és az adatokat összevetettem a kutatócsoportban korábban vizsgált M K konstrukció adataival (31. ábra). 48

49 Steady-state aktivitásmérés 31. ábra A konstrukciók steady-state aktivitásának összehasonlítása. Vegyük figyelembe, hogy a két ábrázolt diagram nem azonos skálával rendelkezik. Az M K konstrukció a magas ChoP koncentráció tartományban csökkenő kezdeti reakciósebességgel rendelkezik, ami szubsztrát inhibíciós hatásra utal [26]. Látható, hogy a kristályosításra szánt AV Q konstrukció aktivitása jelentősen, mintegy három nagyságrenddel csökkent az M K adataihoz képest, így a konstrukció gyakorlati szempontból inaktívnak tekinthető. A mért aktivitás értékek a mérési módszer okozta hibával összemérhetőek voltak, emiatt az adatpontokra nem lehetett kinetikai modellt illeszteni. A CatH1 és CatH2 konstrukciók rendre egy, illetve két nagyságrenddel nagyobb enzim aktivitást mutattak az AV Q esetén mérthez képest, azonban még a CatH2 nagyobb aktivitása sem éri el az M K konstrukcióra mért és publikált értékeket (31. ábra). Az E-hélixnek csak egy részével rendelkező AV Q konstrukció inaktív, szubsztrátjait nem alakítja tovább, ezért alkalmas rendszer a szubsztrát komplex kristályok előállítására, nincs szükség drága, nem hidrolizálható analógok alkalmazására a terner (enzim:két szubsztrát) komplex vizsgálatához. A továbbiakban a két új konstrukció közül CatH2 tulajdonságait vizsgáltam, amely nagyobb enzimaktivitást mutat, így egy biológiai szempontból releváns konstrukciót hasonlíthatok össze az AV Q-val. 49

50 4.7. Az AVΔQ és CatH2 konstrukciók ligand kötésének vizsgálata Hőstabilitás vizsgálat differenciális pásztázó fluorimetria módszerrel A differenciális pásztázó fluorimetria (Thermofluor) mérés során az AVΔQ és CatH2 konstrukciók hőstabilitását vizsgáltam apo állapotban illetve ligandjai jelenlétében. A méréshez használt festék vizes közegben alacsony fluoreszcencia jelet ad, azonban a fehérje denaturációja következtében elérhetővé váló hidrofób régiókhoz kötődve fluoreszcenciája megnövekszik (32. ábra). A ligandok hozzáadásának hatására a spektrum eltolódását várjuk a magasabb hőmérséklet értékek felé, hiszen a ligand bekötődése egy stabilabb konformációt eredményez a létrejött másodlagos kölcsönhatások révén. 32. ábra A fluoreszcencia spektrum eltolódása a magasabb hőmérsékleti tartomány fel ligand hozzáadásának hatására 50

51 33. ábra PfCCT konstrukciók hőstabilitásának mérése differenciális pásztázó fluorimetriával, ligandjaik távollétében, illetve jelenlétében. A fehérje letekeredési hőmérsékletének változása (T m, balra), és a hőmérsékletváltozás ( T m, jobbra) ábrázolása ligandok hozzáadására (balra) Megvizsgáltam a ChoP és CTP szubsztrátoknak, valamint a CDPCho terméknek a PfCCT konstrukciók hőstabilitására gyakorolt hatását. Az egyes ligandokat különböző koncentrációkban alkalmazva végeztem el a differenciális pásztázó fluorimetria mérést, majd a kapott értékeket vizsgálva következtettem a konstrukció hőstabilitására. Az egyes fehérje-ligand körülmények esetén három párhuzamos mérést végeztem. A különböző ligandumok jelenlétében mért fehérje letekeredésre jellemző olvadási hőmérsékleteket (Tm) oszlopdiagramon ábrázoltam, feltüntetve a mérések szórását (33. ábra). A hozzáadott CTP és ChoP szubsztrátok, illetve CDPCho termék egyaránt növelik a PfCCT AVΔQ és CatH2 konstrukciók hőstabilitását. A legnagyobb változást a CDPCho okozza, amit a kialakuló számos kedvező enzim-ligand kölcsönhatás indokolhat. A kapott eredményeket összevetettem az M K konstrukció adataival (33. ábra). Szembetűnő, hogy CDPCho közel azonos hőstabilizáló hatással van mindhárom PfCCT konstrukcióra. A szubsztrátok együttes hozzáadásakor aktív enzim esetében az értéknek közelítenie kell a CDPCho-nal stabilizált letekeredési hőmérséklethez. Mivel a CTP és ChoP együttes hozzáadásakor az M K és az új CatH2 konstrukció esetén tapasztaltam az előző jelenséget, a konstrukciók aktivitására következtettem. Azonban hasonló jelenséget nem tapasztaltam az AV Q konstrukció esetén, ami ennek inaktivitását jelzi. A pontos adatokat táblázatban foglaltam össze (1. táblázat). 51

52 AV Q M K CatH2 T m ( C) T m ( C) T m ( C) T m ( C) T m ( C) T m ( C) apo enzim 48.8 ± ± ± mm CDPCho 51.5 ± ± ± mm CTP 49.2 ± ± ± mm CTP + 3 mm ChoP 49.6 ± ± ± táblázat Az AV Q és M K hőstabilitásának összehasonlítása ligandok hozzáadásának hatására Az AVΔQ konstrukció ligand kötésének vizsgálata fluoreszcens spektroszkópiával Az inaktív AV Q konstrukció további ligand affinitás vizsgálatához fluoreszcens spektroszkópiás módszert alkalmaztam, melynek alapja a fehérjében található triptofán aminosavak gerjesztés hatására történő fluoreszcens emissziója [26]. A gerjesztést 295 nm hullámhosszon végeztem, ahol a triptofán szelektíven gerjeszthető a tirozinhoz képest. A kapott jelet három triptofán szolgáltathatja, de ezek közül a legjelentősebb a 692-es pozícióban elhelyezkedő triptofán, amely a CDPCho kötőhely közelében található, ezáltal a termék bekötődése közvetlenül befolyásolja annak mikrokörnyezetét (34. ábra). A méréshez háttér jelnek a puffer spektrumát vettem alapul, amelyet kivontam a mért értékekből. Elsőként lemértem az apo enzim spektrumát, majd titrálási kísérlettel vizsgáltam az AV Q konstrukt ligand kötő tulajdonságát. Rögzítettem a fluoreszcens jel maximumának intenzitását, valamint az intenzitás helyét, majd két különböző módszerrel végeztem el az adatok kiértékelését. 52

53 34. ábra Az M K konstrukció szerkezeti ábrája, kiemelve a szerkezetben található triptofánokat, amelyek a fluorimetriás mérés során szerepet játszanak A fluoreszcens jel maximumhelyéhez tartozó hullámhossz értéket Origin 8 programmal, Gauss görbe illesztéssel határoztam meg. A hozzáadott CDPCho koncentrációjának növekedésével megfigyelhető az emissziós maximumhoz tartozó hullámhossz csökkenése, tehát a spektrum az alacsonyabb hullámhossz tartomány felé tolódik el, amelyet kék-eltolódásnak neveznek (35. ábra). A gerjesztett, katalitikus régióban található triptofán (W692) mikrokörnyezete a ligand kötődésének hatására elérhetőbbé válik a gerjesztő fény számára, ami a fluoreszcens jel növekedését, valamint a spektrum eltolódását okozza. 35. ábra A fluoreszcens spektrum maximumhelyének eltolódása a CDPCho koncentráció növelésével. 53

54 A kapott értékeket a CDPCho koncentráció függvényében ábrázoltam, majd kvadratikus függvényt illesztve rá Kd értéket számítottam. Összehasonlítás céljából elvégeztem az M K konstrukció CDPCho titrálását is, mely szerint mindkét konstrukciónál megfigyelhető a hullámhossz eltolódás, de annak mértéke különböző, míg az M K konstrukciónál a telítéshez tartozó hullámhossz eltolódás 2.5 nm, addig ugyanez az AV Q-nál 2.8 nm. A disszociációs állandó értékeit megvizsgálva az M K-hoz tartozó 18.5 ± 3.2 M disszociációs állandóhoz képest az AVΔQ konstrukció Kd értéke 3-szoros növekedést mutat, 59.5 ± 7.0 M. A fluoreszcens spektrumok maximumának intenzitását megvizsgálva a CDPCho koncentráció növekedésével eleinte növekedést tapasztaltam, majd az értékek csökkenését figyeltem meg mindkét konstrukciónál, melynek oka a fluoreszcens kioltás (quench) jelensége. A titrálás során hozzáadott CDPCho citozin csoportja a maga aromás gyűrűjével képes a gerjesztő fény energiájából elnyelni, amely nem okoz fluoreszcencia jelenséget, így az elnyelt fény a fluorofór triptofán számára elvész [31]. A mérés során végig jelentkezik ez az effektus, azonban alacsonyabb CDPCho koncentrációknál a ligand kötésből származó fluoreszcencia növekedés van túlsúlyban, később a telítés felé közeledve egyre nagyobb részét teszi ki a kapott jelnek a citozinból származó kioltás, ami miatt a jel erőssége csökkenni kezd. Ennek a jelenségnek a korrekciójára van szükség, amely egy triptofán analóg molekula, az N-acetil-triptofán-amid (NATA) segítségével történt [32] (36. ábra). A NATA titrálásnál kapott relatív fluoreszcencia változás adatait a szükséges koncentrációkhoz interpolálással határoztam meg, majd korrigáltam a konkrét mérés értékeit (37. ábra). AV Q M K Kiértékelési módszer változás F változás változás F változás K d ( M) 60 ± ± ± ± táblázat A PfCCT AVΔQ és MΔK konstrukciók ligand kötő képességének összehasonlítása 54

55 36. ábra Az AV Q konstrukció CDPCho titrálásának nyers görbéje feketével jelölve, valamint a korrekcióhoz szükséges NATA CDPCho titrálás nyers adatai piros színnel jelölve. A fluoreszcencia spektrum maximumának intenzitásán alapuló kiértékelés szerint a disszociációs állandó értékei az M K és az AV Q konstrukcióra rendre 61 ± 12 M, valamint 123 ± 16 M. Ebben az esetben kétszeres növekedés tapasztalható az AV Q esetében az M K-val szemben. Az adatokat táblázatos formában foglaltam össze (2. táblázat). 37. ábra A fluoreszcencia spektrum maximum intenzitásának változása a titrálás során, az N-acetil triptofánamid (NATA) titrálás korrekciót figyelembe véve. 55

56 4.8. Fehérje kristályosítási kísérletek a szerkezet feltárásához A fehérjeszerkezet röntgen diffrakciós megismeréséhez egy fehérje egykristály létrehozása szükséges, amely a fehérje az oldatból rendezett körülmények közötti kiválásával nyerhető. A kutatócsoportban korábban elvégzett PfCCT AV Q konstrukció nagy áteresztőképességű kristályosítási kísérletek után, a kapott kezdeti találatok optimalizálását végeztem el. Ennek során az eredeti PACT valamint Morpheus körülmények kritikus paramétereinek, a ph-nak, valamint a szervetlen só vagy polietilénglikol kicsapó szer koncentrációjának szisztematikus változtatásával hoztam létre új körülmény mátrixokat. Vizsgáltam különböző kétértékű fémionok, cukrok, dikarbonsavak, valamint alkoholok hatását a kristályosítási folyamatra. Mivel AV Q konstrukció gyakorlati szempontból inaktív, szubsztrátjait nem képes hatékonyan átalakítani, ezért alkalmazható lehet az (enzim, CTP, ChoP) szubsztrát komplex kristályosítására enzimatikus átalakítás nélkül, nincs szükség drága, nem hidrolizálható analógok alkalmazására a katalízis előtti állapotot jellemző enzim-szubsztrát komplex vizsgálatához. A fehérjéhez ezért kristályosításkor nemcsak CDP-kolint, hanem CTP és foszfokolin elegyét is adtam egy független kísérletben, 5 mm Mg 2+ jelenlétében. A kristályosító tálcákat az anyagok és módszerek részben leírtak szerint készítettem elő a BME CH épület alagsorában található Biostruct laboratóriumban ( majd hetente, később kéthetente ellenőriztem a kristálynövekedést Leica fényképezésre is alkalmas mikroszkóppal. A kapott kristályok UV megvilágításával teszteltem, hogy azok fehérje eredetűek-e. A kristályosító tálcákat egy FORMULATRIX kristályosító tálcatároló és analizáló készülékben, 20 C-on tároltam. 56

57 Látható fény alatt készült fotó UV fény alatt készült fotó Körülmény Morpheus A M CaCl2, 0.03 M MgCl2 18% etilén-glikol 18 % PEG8000 Im/Mes ph=6.5, dh20 fehérje + 20 mm CDPCho mm SO42 Morpheus A M CaCl2, 0.03 M MgCl2 15% etilén-glikol 15 % PEG8000 Im/Mes ph=6.5, dh20 fehérje + 20 mm CDPCho mm SO4238. ábra Fehérjét nem tartalmazó kristályok növekedése PfCCT AVΔQ kristályosítása során. A baloldalon látható kristályok nem fluoreszkálnak UV megvilágítás hatására, így ezek fehérjét nem tartalmazó sókristályok. A fehérje kristályosítási kísérleteim többségében nem jelent meg kristályforma, mivel a fehérje a túltelítetté váló oldatból kicsapódott, vagy a kialakult fázisszétválás nem eredményezett kristályokat. Az észlelt kristály találatok némelyike UV megvilágítás hatására nem adott fluoreszcens jelet, ami arra utal, hogy fehérje helyett kismolekulás sók alkotják ezeket (38. ábra). A legsikeresebb kísérletnek a PACT D5 körülmény optimalizációja bizonyult, ahol több, a PEG1450 kicsapó szert különböző koncentrációban tartalmazó cseppben is megfigyeltem mikrokristályok kialakulását, melyekből néhány hét alatt vékony, tűs kristályok nőttek. A kristálynövekedést mind CTP és ChoP ligandok együttes hozzáadásakor (39. ábra), mind CDPCho jelenlétében észleltem (40. ábra). 57

58 Látható fény alatt készült fotó UV fény alatt készült fotó Körülmény PACT D5 25% PEG M MMT-puffer dh20 fehérje + 20 mm CTP + 30 mm Mg mm ChoP PACT D5 28% PEG M MMT-puffer dh20 fehérje + 20 mm CTP + 30 mm Mg mm ChoP 40. ábra PfCCT AVΔQ fehérjekristályok a PACT D5 körülményben CTP és ChoP ligandokkal Körülmény Látható fény alatt készült fotó PACT D5 30% PEG M MMT-puffer dh20 fehérje + 20 mm CDPCho 39. ábra PfCCT AVΔQ fehérjekristályok a PACT D5 körülményben CDPCho termékkel A megfelelően nagy méretű tű egykristályokat a BME Biostruct laborban található Agilent Supernova házi röntgenforrással vizsgálta Leveles Ibolya, azonban nem nyert 58