A 16-3 bakteriofág h génje

Átírás

1 A 16-3 bakteriofág h génje Diplomamunka Békási Krisztina biológus hallgató témavezető: Dr. Putnoky Péter PTE TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék Pécs, 2004.

2 A 16-3 fág h génje - 2 TARTALOM OLDAL 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A 16-3 bakteriofág A 16-3 bakteriofág genetikai térképe A fágfertőzés folyamata A 16-3 bakteriofág ismert génjei A h gén lokalizálása A rhizobiumok A szimbiózisban résztvevő partnerek Endoszimbiózis Sejtfelszíni poliszacharidok A kapszuláris poliszacharidok jelentősége CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok Baktériumok és bakteriofágok szaporítása Plazmid DNS izolálás Agaróz gélelektroforézis Fragmentizolálás Fehérjepreparátum készítése SDS-PAGE-hoz SDS-PAGE Ligálási reakció Kompetens sejtek készítése Transzformáció PCR DNS szekvencia meghatározás Számítógépes szekvencia analízis KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK A h gén klónozása A BamHI fragment nukleotid szekvenciájának meghatározása A 3 régió nukleotid szekvenciájának meghatározása Az 5 régió nukleotid szekvenciájának meghatározása Host-range mutáció igazolja, hogy a feltételezett H fehérje a 28 fágreceptor felismerésében játszik szerepet 4.6. A feltételezett H fehérje összehasonlítása az adatbázisokkal A h gén expressziója A h gén expressziós vektorba történő klónozása ÖSSZEFOGLALÁS FELHASZNÁLT IRODALOM 34 RÖVIDÍTÉSEK 38 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 39

3 A 16-3 fág h génje IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. A 16-3 bakteriofág A bakteriofágok a baktériumgenetika fontos eszközei, elég, ha csak az Escherichia coli - lambda fág rendszerre utalunk, mely kiemelkedő jelentőségűvé vált. Ennek mintájára a rhizobium genetikában, melynek fő célja a szimbiotikus baktériumgének megismerése, szintén fontosnak tűnt egy megfelelő fág-baktérium rendszer megismerése. A rhizobiumok számos bakteriofágja ismert. Ezek közül többel végeztek sikeresen általános vagy speciális transzdukciót. A legtöbb eredmény a Sinorhizobium meliloti törzsek fágjaival született. Ezek közül is kiemelkedik a Magyarországon használt S. meliloti 41 törzsön szaporodó 16-3 fág, amely az egyetlen részletesen tanulmányozott rhizobium fág. A 16-3 fágot a talajból izolálták Balatonberény környékén (Szende and Ordogh, 1960). A virion kromoszómája kétszálú, lineáris, 60,8 kb nagyságú molekula (Dallman et al., 1979), amely 10 bázis hosszú, 3 túlnyúló ragadós végekkel rendelkezik. Alakjában és több molekuláris sajátságában is emlékeztet a lambda fágra és ahhoz hasonlóan egy speciális transzdukáló fág. Ismert a részletes genetikai-fizikai térképe, a represszor fehérje szerkezete, a fág és a baktérium kromoszómáján lévő att régió pontos szekvenciája, tanulmányozták a fág integrációjának mechanizmusát. Ennek eredményeként egy speciális vektorcsaládot is kifejlesztettek, mely a fág int génjét és att régióját hordozza és melynek felhasználásával a legkülönbözőbb gének építhetők be az S. meliloti 41 kromoszóma att helyére (Papp et al., 1993) A 16-3 bakteriofág genetikai térképe A 16-3 fág alapvető genetikai analízisét és genetikai térképezését különböző mutánsok segítségével végezték el. Az izolált, mintegy 150 ts (hőérzékeny) mutáns a fágszaporodás szempontjából korai és kései típusokra bontható. A korai és kései funkciók elkülönülését jól tükrözi a 16-3 fág genetikai térképe, szoros korreláció van a gének elhelyezkedése és működésének ideje között (Orosz et al., 1973).

4 A 16-3 fág h génje - 4 A géntérkép régiói a következők: att régió - int gén - avirc operátor - C cisztron - avirt operátor - rekombináció gén korai ts mutációk - kései ts mutációk - farki rost és ant gén - lizozim gén. A géntérkép hossza a C cisztrontól a lizozim génig 40 térképegység hosszúságú. Elkészítették a 16-3 fág kromoszómájának fizikai térképét 13 féle restrikciós endonukleáz segítségével. Ez több, mint száz térképezett hasítóhelyet tartalmaz. Lényegesen kevesebb a 16-3 fágról szerzett ismeretanyag, mint az, ami az E. coli lambda vagy T4 fágjáról felhalmozódott. Ennek ellenére a 16-3 fág ma már a viszonylag jól ismert bakteriofágok szűk köréhez tartozik (Dallman et al., 1979; Dorgai et al., 1981; Orosz et al., 1973) A fágfertőzés folyamata A fág farki rostjával a fertőzés során először a baktérium sejtfal speciális struktúráin, az ún. fágreceptorokon tapad meg. Ezt fág adszorpciónak nevezzük, mely hatékony, kalciumiont igénylő folyamat. A bakteriofágoknak kétféle szaporodási módja van. A lizogén úton a fág DNS beépül a baktérium kromoszómába és a baktérium zavarása nélkül szaporodik. A lítikus szaporodási mód drasztikusabb. Ebben az esetben egy baktériumsejtből akár 10 2, 10 3 fág keletkezik, ciklikusan elszaporodik. Lizogén útvonal esetén helyspecifikus rekombinációra van szükség ahhoz, hogy a bejutott fág DNS képes legyen integrálódni a bakteriális genomba. Az, hogy a 16-3 fág helyspecifikus rekombinációs rendszere E. coliban nem működik, arra utal, hogy a fág kromoszómába épüléséhez specifikus gazdafaktor is szükséges, amely az E. coliban nem található meg. A 16-3 helyspecifikus rekombinációs rendszer közvetlen felhasználhatóságának tehát két feltétele van, az egyik a specifikus gazdafaktor jelenléte, a másik pedig az, hogy a rekombinációs célszekvencia az adott baktérium kromoszómáján megtalálható legyen. (Semsey et al., 1999). A fág a beépülés után a baktériummal együtt replikálódik. A profágot hordozó baktérium lizogén, azaz a fágszaporodás környezeti indukció hatására következik be. A lízis során bizonyos gyakorisággal (10-5 ) bakteriális eredetű, cys-46 lokusz környéki kromoszómaszakasz vágódik ki, ezt a folyamatot transzdukciónak nevezzük. Kiderült tehát, hogy ez egy speciális transzdukáló fág, mert csak a baktérium egy meghatározott régiójához (attb) tud hozzákapcsolódni.

5 A 16-3 fág h génje - 5 Egyedi cys + transzduktáns telepekből fágot indukáltak és megvizsgálták a fág DNS restrikciós képét. Gyakran találtak stabilan transzdukáló, ugyanakkor életképtelen fágokat, amelyeket dtr-nek neveztek el. Az ilyen fág csakis helper fág jelenlétében szaporodott. A dtr fágokban a fág DNS óriási része hiányzott. A hiányzó fág DNS-t bakteriális DNS helyettesítette. A deléció/inszerció nem érinti a ragadós végeket és a replikációs origót, aminek következtében a dtr kromoszóma jól pakolódik és replikálódik. A kiesett fág funkciókat és az ezeket kódoló fág DNS szakaszokat azonosítva megállapították, hogy a Sinorhizobium meliloti DNS modifikáló aktivitással rendelkezik (Svab et al., 1978). Az érett fágrészecske elkészüléséhez minimálisan (ún. eklipsz periódus) 80 percre van szükség 28 C-on és 65 percre 36 C-on (Orosz et al., 1973). A fág fej 3 főbb (18,5 Kd, 31,5 Kd, 47 Kd) és 5 kisebb mennyiségben (25 Kd, 27 Kd, 50 Kd, 59 Kd, 68 Kd) polipeptid láncból épül fel, míg a farokrész 2-ből (72 Kd, 86 Kd) (Erdei et al., 1982) A 16-3 bakteriofág ismert génjei A 16-3 fág legjobban ismert génje a c regulátorgén, amely a lizogén életciklus kialakításában játszik szerepet. A c gén terméke egy represszor fehérje, mely transzkripciógátló hatást fejt ki. A DNS szekvencia adatok alapján a C represszor egy 263 aminosav hosszúságú bázikus fehérje. Amino-terminális doménje egy helix-turnhelix DNS kötő motívumot hordoz, amely az operátorhoz való kötődésért felelős (Dallmann et al., 1991). A 16-3 fág int génje és az integráz fehérje (Int) az integrációért felelős. Az integráz fehérje C-terminális végéhez közel két tirozin oldallánc található a 334. és 346. pozíciókban. A homológia vizsgálatok alapján valószínűbb, hogy a 346-os pozícióban található tirozin oldallánc vesz részt a DNS szálak hasításában. Ezen oldallánc hidroxil csoportjának eltávolítása a fehérje rekombináz aktivitásának elvesztéséhez vezet. Ez az integráz fehérje hordozza mindazon jegyeket, amelyek a helyspecifikus rekombinázok integráz családjának tagjaira jellemzőek (Semsey et al., 1999). A 16-3 Xis fehérje 140 aminosavból áll, és számítógépes analízis szerint az N- terminálisán valószínűleg egy helix-turn-helix motívum található. Mérete hasonló az eddig ismert néhány hasonló fehérje méretéhez, de azokhoz számottevő szekvencia homológiát nem mutat.

6 A 16-3 fág h génje - 6 Az attb egy olyan régió a baktérium kromoszómán, amely arra szolgál, hogy a fág integrálódhasson. A bakteriofágok helyspecifikus rekombinációjának modellje szerint az attb hely két fordított orientációjú integráz kötőhelyből áll A h gén lokalizálása Ha a baktérium felszínén megváltozik a fág receptora, de még jelen van, akkor lehet olyan fág mutánsokat izolálni, amelyek egy mutáció révén képesek ismét felismerni ezt a felszínt. Ezen fenotípust okozó változást host-range mutációnak, az érintett gént pedig h génnek nevezzük. Orosz László laborjában Palágyi Zsuzsanna határozta meg a h gén körülbelüli helyzetét marker rescue technikával, mely során h mutáns fágból klónozott DNS fragmenteket egy plazmidba. Ha a plazmidot tartalmazó baktériumon vad típusú fágokat szaporítottak el, akkor homológ rekombináció révén a fágokban megjelenhet a h mutáció. A h mutánsok nagy száma jelezte, hogy a kérdéses mutáció a klónozott DNS szakaszon helyezkedik el. Egyre kisebb DNS fragmentumokkal dolgozva, ezen az elven a pzs5 klón, amely EcoRI hasítással keletkezett, illetve a BamHI enzimmel előállított pzs10 klón (2. ábra) tartalmazta a mutációt. Így a h mutációt az 1.16 kb-os BamHI szakaszon belül lehetett lokalizálni A rhizobiumok A 16-3 bateriofág gazdabaktériuma a Sinorhizobium meliloti 41-es törzs, amely a Rhizobiaceae családba tartozó endoszimbionta talajbaktérium. A Sinorhizobium meliloti pálcika alakú, endospóra nélküli Gram-negatív baktérium, melynek gazdaságilag legfontosabb partnere a lucerna (Medicago sativa) (Allen and Allen, 1981). Összefoglaló néven rhizobiumoknak hívjuk az Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Rhizobium és Sinorhizobium fajokat. A Rhizobiaceae családba tartozó baktériumfajok képesek átprogramozni bizonyos növényi differenciálódási és anyagcserefolyamatokat, ezzel biztosítva maguknak tápanyagutánpótlást a gazdanövény belsejében, valamint háborítatlan életteret.

7 A 16-3 fág h génje - 7 A rhizobiumok esetében az átprogramozást jelcserék sorozata határozza meg és a folyamat eredményeként egy új növényi szerv keletkezik, a szimbiotikus gümő. A szimbiózis olyan kapcsolat, melyben mindkét fél számára hasznos az együttélés, hiszen a gümő belsejébe került rhizobiumok képesek a légköri nitrogéngázt ammóniává redukálni a növénytől származó tápanyagok energiájának segítségével A szimbiózisban résztvevő partnerek A Leguminosae (hüvelyesek) családjába tartozó növényfajok valamelyikével a Rhizobiaceae baktériumcsalád (Bacteria, Proteobacteria, Alphaproteobacteria, Rhizobales) azon tagjai alkítanak ki endoszimbiózist, amelyek nitrogénkötésre képesek (Allen and Allen, 1981). A rhizobiumok kutatásának fő célja elsősorban azoknak a bakteriális géneknek a megismerése, amelyek a szimbiózis kialakulását irányítják vagy a szimbiotikus gümő anyagcseréjében játszanak jelentős szerepet. Ebből a szempontból az egyik legjobban ismert baktérium a Sinorhizobium meliloti (régebbi nevén Rhizobium meliloti), mely a lucerna (Medicago sativa) és még néhány más pillangós virágú növény (Medicago, Melilotus, Trigonella) szimbiotikus partnere Endoszimbiózis A szimbiotikus gümő a gazdanövény gyökerén partnerspecifikus módon létrejövő új növényi szerv, melynek kialakulásához a megfelelő baktériumfaj szükséges. A növények nagy mennyiségben bocsájtanak ki szerves molekulákat a rhizoszférába. A kezdeti genetikai kísérletek is arra utaltak, hogy a nodulációs gének két csoportba oszthatók. Közös nod géneknek nevezzük a legtöbb rhizobiumban megtalálható, funkcionálisan egymást helyettesíteni tudó géneket, míg az egyes növények nodulálását befolyásoló géneket gazdaspecifitási nod géneknek nevezték el (Djordjevic et al., 1985; Fisher et al., 1985; Kondorosi et al., 1984; Truchet et al., 1985). Ez utóbbiak természetüknél fogva nem találhatók meg mindenütt egységesen. Kiderült az is, hogy ezek a gének egy diffúzibilis szignál szintézisét kódolják, amely a gazdanövény gyökerén jellegzetes változásokat hoz létre. A nod gének inducerei elsősorban flavonoid típusú molekulák (1. ábra). Nem minden rhizobium képes

8 A 16-3 fág h génje - 8 egyformán érzékelni ezeket a jeleket, mivel a gyökér által kibocsájtott molekulák konkrét szerkezete már a gazdaspecifitást is befolyásolja (Denarie et al., 1992; Firmin et al., 1986; Peters et al., 1986; Phillips and Kapulnik, 1995). A flavonoid növényi szignálra válaszként küldött bakteriális Nod szignál elégséges a gümőfejlődés elindításához (1. ábra). Az összes eddig megismert Nod-faktor szerkezetét és a felépítésükben fontos nod gén szerepét részletesen tárgyalja több összefoglaló cikk (Denarie and Debelle, 1996; Perret et al., 2000; Spaink, 2000). A szimbiotikus gümő belsejében történik a nitrogénkötés. A rhizobiumok feladata a nitrogéngáz ammóniává redukálása során nyert nitrogén bekapcsolása a növényi anyagcserébe. A szimbiózis kialakulásának első lépéseként mikroszkóposan megfigyelhető a baktériumoknak a gyökérszőrsejtekhez történő specifikus kötődése (1. ábra). 1. ábra: A pillangósok és a Rhizobium baktériumok közötti molekuláris párbeszéd vázlatos sémája (Kondorosi and Kondorosi, 1986). Az ábra felső részén a Sinorhizobium melilotira jellemző Nod-faktor szerkezete látható, kiemelve a specifitásért felelős régiókat.

9 A 16-3 fág h génje - 9 A rhizobiumok többsége a gyökérszőrökön keresztül jut be a növény belsejébe. A szomszédos fertőzési helyek távolsága és a növény fiziológiai állapota befolyásolja a fertőzés kimenetelét. Miután a baktériumok megtapadnak, a gyökérszőrsejt növekedése a csúcsról áthelyeződik a baktériumokkal szembeni oldalra majd jellegzetesen meggörbül. A fertőzés pontján leépül a régi sejtfal és kialakul egy csőszerű képlet az újonnan lerakódó belső sejtfal folyamatos növekedése révén. Ez a képlet az infekciós fonal, mely bejutási útvonalat bíztosít a baktériumok számára a gyökérszőrsejt belsejébe. Ezt követően a baktériumok a növekedő és elágazódó infekciós fonalon keresztül fertőzik meg a gümősejteket. Néhány pillangósvirágú növénynél a fertőzés kevésbé specifikus módon, az oldalgyökér-kiágazódásoknál található nyílásokon keresztül megy végbe (Newcomb, 1981). A gyökér belső kéregsejtjei között, a fertőzési ponttól sok sejtrétegnyi távolságra dedifferenciáció, mitózis figyelhető meg (gümőprimordium), mely során gümőmerisztéma, egy új osztódó szövet keletkezik (1. ábra). A fertőzés után néhány nappal már mikroszkóppal látható kidudorodás jelenik meg a gyökér felszínén, melynek merisztematikus zónájában sokszorosan elágazódó infekciós fonalak figyelhetők meg. Később infekciós fonal végződik a legtöbb proximális merisztémasejtben, majd a baktériumok elözönlik ezeket a sejteket (Dudley et al., 1987). Mitotikus aktivitása több hétig megmarad a merisztémának. A gümő kéregrészében szállítónyalábok húzódnak, majd ezeken keresztül jutnak a gümőbe a különböző fotoszintátok és a kötött nitrogén a növény többi részébe aminosavak formájában. A gümő jellegzetes szövettani zónái: a gümőmerisztéma, a korai és késői szimbiotikus zóna, valamint az öregedési zóna. A többféle gümőtípus között a különbség a morfológiai felépítésben, a fertőzés stratégiájában és a merisztematikus aktivitásban van (Newcomb, 1981; Vasse et al., 1990). A két leggyakoribb ilyen típus az indeterminált, valamint a determinált gümő. A fent leírtak leginkább az ún. indeterminált gümő kialakulására és felépítésére vonatkoznak. Ennél a gümőtípusnál a gümőmerisztéma hosszabb ideig, folyamatosan működik. A másik jellegzetes forma a determinált gümő, melynél viszonylag rövid ideig aktív a merisztéma. A mai fő kutatási irányok e két gümőtípust létrehozó pillangós-rhizobium kapcsolatra orientálódnak (Cook, 1999; Stougaard, 2001). A baktériumok endocitózis segítségével kerülnek be a gümősejtekbe oly módon, hogy az infekciós fonal sejtfal nélküli végénél a növényi sejtmembrán befűződései egy vagy több baktériumot magában foglaló vezikulummá alakulnak, mely így egy külön

10 A 16-3 fág h génje - 10 membránnal (peribakteroid membrán, PBM) van körülvéve. A sejt belsejébe került baktériumok további osztódásokat követően fiziológiai, majd morfológiai változásokon mennek keresztül és ún. bakteroidokká alakulnak. A bakteroid időleges sejtorganellumként is felfogható, amelyet a növény a felhasználható nitrogénvegyületeknek hiányában importál a környezetéből. A fertőzött sejtekben intenzív fehérjeszintézis és anyagcsere folyik, membránfelületük szer nagyobb, mint a fertőzetleneké. A legnagyobb mennyiségben előforduló növényi szimbiotikus fehérje a leghemoglobin, mely egyrészt biztosítja a megfelelő oxigénszegény (mikroaerob) környezetet az oxigénre érzékeny bakteriális nitrogenáz enzim működéséhez az oxigén megkötése révén, másrészt a bakteroidban zajló fokozott respirációhoz szállítja az oxigénutánpótlást (Appleby, 1984). Így a gümő belsejében a szabad oxigén koncentrációja akár százezred része is lehet (3-30 nm) a szokásos módon növesztett baktériumkultúrában található mennyiségnek (kb. 250 mm) Sejtfelszíni poliszacharidok A szimbiózis kialakításában fontos szerepük van rhizobiális sejtfelszíni poliszacharidoknak, melyeken belül lipopoliszacharidokról (LPS), kapszuláris poliszacharidokról (KPS) és exopoliszacharidokról (EPS) beszélünk A kapszuláris poliszacharidok jelentősége Szende Kálmán izolálta és kezdte el vizsgálni a S. meliloti 41 törzset (RM41) mely a magyarországi rhizobiumkutatás kiindulópontja volt (Szende and Ordogh, 1960). Kondorosi Ádám és társai ebből a törzsből izoláltak egy kompakt kolóniamorfológiával rendelkező, nem mukoid törzset (AK631), amely szintén képes volt szimbiózisra a lucernával (Banfalvi et al., 1981). A további genetikai munkák kiindulópontja az AK631 lett. A későbbiekben kiderült, hogy az AK631 egy exob mutáns, amelyet az inváziós folyamatban az exopoliszacharid helyett egy másik felszíni poliszacharid segít (Putnoky et al., 1990).

11 A 16-3 fág h génje - 11 A kezdetekben ez az anyag liposzacharidnak tűnt a genetikai és biokémiai vizsgálatok alapján (Brzoska and Signer, 1991; Putnoky et al., 1990). Később kiderült, hogy kapszuláris poliszacharid (KPS), és így egy KPS-bioszintézisben szerepet játszó géncsoportot sikerült azonosítani a nemtermelő, Inf mutánsok segítségével (Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990). A KPS szerkezete, bioszintézise és a megfelelő gének jellemzése a különböző humánpatogén E. coli, Salmonella, Neisseria, Haemophilus, illetve a növénypatogén Pseudomonas és Erwinia törzsek vizsgálata révén váltak leginkább ismertté (Boulnois and Roberts, 1990; Jann and Jann, 1990; Roberts, 1996; Whitfield and Roberts, 1999). A kapszuláris poliszacharidok a baktériumok felszínéhez kötöttek, és szintén erős immunogének lehetnek, ezért K-antigéneknek is nevezik őket. A különböző E. coli törzsek több, mint 80-féle K-antigént termelnek. Rhizobiumoknál elsők között R. Carlson laboratóriumából számoltak be a KPS jelenlétéről és kezdeti jellemzéséről egy R. fredii és a S. meliloti 41 törzs vizsgálata kapcsán. Kimutatták, hogy a S. meliloti 41 törzs egy törzsspecifikus poliszacharidot termel, amely felípétésében hasonló az E. coli törzseknél ismert II. típusú K-antigénekhez. Ezt a poliszacharidot K R 5 antigénnek nevezték el (Reuhs et al., 1993). Érdekes példáját adták a S. meliloti 41 törzsnél kapott eredmények annak, hogy helyettesítheti egymást két felszíni poliszacharid az invázió folyamatában. Ennél a törzsnél képesek hatékony szimbiózist kialakítani a lucernával mind az exob (EPS, nemtermelő), mind a különböző rkp (KPS, nemtermelő) mutánsok, és Inf fenotípust csak az exob/rkp (EPS, KPS ) kettős mutánsok mutatnak (Putnoky et al., 1990). A megvizsgált gazdanövények egyaránt képesek a csak szükcinoglükánt vagy csak K R 5 antigént termelő törzsek fertőzésére (Putnoky et al., 1990), de azok a mutánsok, amelyek csak galaktoglükánt termelnek, egyedül a lucernát tudják fertőzni (Glazebrook and Walker, 1989).

12 A 16-3 fág h génje CÉLKITŰZÉSEK A fágrezisztenciát okozó baktériummutációk és a mutáns baktériumon izolálható host-range fágmutációk elemzése bepillantást ad a felismerési mechanizmusok molekuláris természetébe. Korábbi eredmények alapján a K R 5 antigént érdemesnek tartottuk arra, hogy segítségével olyan, különleges mutációkat keressünk, vizsgáljunk, amelyek a fág-baktérium és a növény-baktérium felismerési folyamatokat egyaránt befolyásolják, hiszen azt feltételeztük, hogy a K R 5 antigénnek mind a szimbiózisban, mind a 16-3 fág fertőzésében fontos szerep jut (Putnoky et al., 1990). Korábbi munkákban feltételezték, hogy a fág receptora ez a törzsre jellemző KPS. Célul tűztük ki a fágreceptor természetének tanulmányozását, így fágreceptor mutáns baktériumok és host-range fágmutánsok azonosítását és jellemzését. Kiindulási feltételezésünk az volt, hogy a fágreceptor vizsgálata által a fág-baktérium kapcsolat és a baktérium-növény kapcsolatról is többet tudhatunk meg. E munkában feladatunk a bakteriofág vizsgálata volt. Valójában a 16-3 fág azért érdekelt minket, mert segítségével KPS-bioszintézis hibás mutánsokat lehet előállítani. Feltételeztük, hogy ez a speciális KPS a fágreceptor, ezt a kölcsönhatást kezdtük tanulmányozni. A 16-3 fág egy host-range mutációjának izolálása és térképezése már hosszú évekkel ezelőtt megtörtént (Orosz and Sik, 1970; Orosz et al., 1973), de a további vizsgálatok elmaradtak. Ezért fogtunk bele tehát egy új mutánsizolálási kísérletbe. Az én feladatom volt annak a DNS szakasznak a klónozása, aminek a területén belül található az eredetileg meghatározott h mutáció, valamint olyan szubklónok készítése, amelyek alkalmasak a szekvencia leolvasására. A továbbiakban a meghatározott szekvenciát elemeztük bioinformatikai eszközökkel. Velem párhuzamosan végezte Maász Anita a h mutáns fágok izolálását és ezek feltérképezését, valamint tulajdonságainak megállapítását.

13 A 16-3 fág h génje ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok Baktériumtörzsek Jellemzők AK631 RM41; exob631; Nod + ;Fix + XL1-Blue E. coli K12, reca1, enda1, gyra96, thi-1, hsdr17, supe44, rela1, lacz M15 (Strategene USA) RM41 S. meliloti 41 vad típusú (Exo +, Nod +, Fix + ) (Putnoky et al., 1990) GH4046 GH4178 GH4180 Bakteriofágok RM41 rkpm 4046 (Hoffmann Gyula) RM41 rkpm 4178 (Hoffmann Gyula) RM41 rkp-4180 (Hoffmann Gyula) 16-3 S. meliloti 41 baktériumtörzsre specifikus vad típusú fág (Orosz L.) 16-3 h fág, host-range mutáns 16-3 h fág host-range mutáns 16-3 h fág, host-range mutáns 16-3 h fág, host-range mutáns 16-3 h fág, host-range mutáns Plazmidok pbs pdh1 psem91 pbm4128 pbm4129 pbm4135 pbm4144 pbm4145 pbm4146 pbm4147 pbm4137 pbm4138 pbm4148 pbluescript II SK (+), Amp R, klónozó vektor, (Stratagene USA) plafr1 kozmid 16-3 fág klón, h régió, (Papp P.) Rhizobiumban is működő expressziós vektor, Km, (Semsey et al., 1999) pbs::16-3 fág EcoRI D frg.; ori2, Amp pbs::16-3 fág EcoRI D frg.; ori1, Amp pbs::16-3 fág 1.16 kb BamHI frg. (feltételezett h gén), Amp pbs::16-3 fág 3.1 kb PstI frg.; ori1 (feltételezett h gén), Amp pbs::16-3 fág 3.1 kb PstI frg.; ori2 (feltételezett h gén), Amp pbs::16-3 fág 1.6 kb XhoI frg.; ori1 (feltételezett h gén), Amp pbs::16-3 fág 1.6 kb XhoI frg.; ori2 (feltételezett h gén), Amp pbm4146; EcoRV deléció, Amp pbm4146; EcoRV deléció, Amp pbm4145; BamHI deléció; ori2

14 A 16-3 fág h génje - 14 pbm4153 pbm4238 pbm4239 pbm4240 pbm4146; EheI-SmaI deléció psem91, h régió, (SphI-StuI), Km psem91, h régió, (SphI-StuI), Km psem91, h régió, (SphI-StuI), Km 3.2. Baktériumok és bakteriofágok szaporítása Az E. coli törzseket LB komplett táptalajon, a megfelelő antibiotikum jelenlétében 37 C-on, a S. meliloti törzseket pedig TA komplett táptalajon, 32 C-on növesztettük. Az LB tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (ph 7,0). A TA tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton, 1 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl, 1mM MgSO 4, 1mM CaCl 2 tartalmú (ph 7,2). Táptalaj esetében 1.5 % agarózzal egészítettük ki a tápoldatot. A szilárd táptalajokban alkalmazott antibiotikum koncentrációk a következők: ampicillin: 200 µg/ml, tetraciklin: 15 µg/ml. Tetraciklin koncentrációja folyékony táptalajban: 5 µg/ml. Kanamicin koncentrációja E. coli törzseknél 30 µg/ml (7.5 mg/ml), S. meliloti törzsek esetén 200 µg/ml (50 mg/ml). A bakteriofág szaporításakor 4 ml TA tápoldatot és 0.2 ml megfelelő éjszakán át rázatott baktérium kultúrát (friss) összekevertünk, majd elhelyeztünk benne egy fágplakkot. A szaporítást egy éjszakán át, 32 C-on, erős rázatás mellett végeztük Plazmid DNS izolálás A plazmidot 3-3 ml TA tápfolyadékban egész éjszakán át növesztett sejtekből preparáltuk (Ish-Horovicz and Burke, 1981). 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe mértünk és a sejteket ülepítettük centrifugálással, majd felszuszpendáltuk 100 µl TEG oldatban (25 mm TrisHCL, 10 mm EDTA, 50 mm glükóz ph 8,0). Óvatos keverés mellett 200 µl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával történt a feltárás. A mintákat 5 percig jégen (0 C) inkubáltuk, majd 160 µl 0 C-os Na-acetát oldatot (3M, ph 4,8) adtunk az elegyhez. A keletkezett csapadékot 5 perc, 0 C-os inkubáció után centrifugáltuk. Minden centrifugálást fordulatszámon 5 percig végeztünk.

15 A 16-3 fág h génje - 15 A felülúszóból 320 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS mintákat. 10 perc - 20 C-os inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, mostuk (400 µl 70%-os etanollal) és szárítottuk. A csapadékot 100 µl Tris-pufferben (50 mm TrisHCL, 100 mm Naacetát, ph 8,0) oldottuk fel, majd 200 µl 96%-os etanollal ismét kicsaptuk. 10 perc 0 Cos inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, szárítottuk, majd kozmidok esetén 30 µl, pbluescript esetén 50 µl RNáz tartalmú oldatban (10 mg/ml) vettük fel. Szekvenálás esetén a plazmid DNS izolálás után még egy extra tisztítást alkalmaztunk. A mintákhoz 0.1 térfogat 10%-os SDS-t és 1 térfogat. 7.5 mólos NH 4 - acetátot (0 C-os) mértünk, majd alapos összerázás után 15 percig jégen inkubáltuk őket. A keletkezett csapadékot centrifugáltuk és a felülúszóból 0.6 térfogat izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS mintákat. 20 perc -20ºC-os inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, mostuk (400 µl 70%-os etanollal) és szárítottuk. A DNS-t 40 µl desztillált vízben vettük fel Agaróz gélelektroforézis és restrikciós endonukleázok alkalmazása A tisztított DNS-ből 0,2-0,5 µg-ot használtunk fel restrikciós emésztésekhez. A mintákat 1-2 U mennyiségű FERMENTAS enzim jelenlétében 1-2 óráig 37 C-on inkubáltuk. Az emésztés végén a reakcióelegybe 1/5 rész mintafelviteli puffert mértünk (5xSTOP: 10 % ficoll; 0,25 M EDTA; ph 8,0; 0,2 % brómfenolkék). A restrikciós enzimekkel hasított minták fragmentjeit agaróz gélen választottuk el. Az agarózt 1xTBE pufferben (10.8 g TRIS, 5.5 g bórsav, 0,1 M EDTA, ph 8,0/1000ml) oldottuk fel. Majd a feloldódást követően etídium-bromidot mértünk bele, melynek végkoncentrációja : 0.1 µg/ml. Kis fragmentek ( bp) esetén 1,3-1,5 %-os gélt, nagy fragmentek elválasztására 0,7-0,8 %-os gélt használtunk. Ezután a mintákat TBE pufferben, a gél dimenziójától függően V-on, fragmentizolálás esetén V-on választottuk el. A kiértékelést UV fény segítségével végeztük.

16 A 16-3 fág h génje Fragmentizolálás A megfelelő restrikciós enzimmel hasított fragmenteket elektroforézissel szétválasztottuk. Az izolálni kívánt fragment elé bevágtunk és a gélbe Whatman DE 81 papírt helyeztünk. 20 perces 60V feszültség mellett történő további elektroforézis után a papírról a DNS fragmentet 2 50 µl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS-t 0.1 térfogat 3 M Na-acetát oldat (ph 7,0) és 80 µl izopropanol hozzáadásával kicsaptuk. 20 perces -20 C-os inkubáció után centrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl desztillált vízben feloldottuk a csapadékot Fehérjepreparátum készítése SDS-poliakrilamid gélelektroforézishez Éjszakán át rázatott rhizobium kultúrát huszadára visszahigítottuk (10 ml táptalaj ml baktérium + megfelelő antibiotikum). 37 C-os rázóban 90 percig rázattuk, törzsenként 2-2 lombikot indítva. Egyikbe beletettük az IPTG-t (23 mg/ml), majd minden kultúrát továbbnövesztettük. Az indukció után 4 órával megmértük az OD-kat. OD mérés után 1.5 ml-t lefugáltunk minden törzsből. A kapott OD értékek függvényében oldottuk fel a mintákat: 0.5 OD-ra 50 µl desztillált vizet adtunk. Ezt követően ugyanannyi µl mintafelviteli puffert (2xSTOP-ot) adtunk hozzá, mint amennyi desztillált vízbe felvettük a baktériumot. Az eppendorf csöveket 10 percre 95 C-ra raktuk, majd a mintákat felhasználásig +5 C-on tároltuk SDS-PAGE (poliakrilamid gélelektroforézis) Futtató gél (15 ml) :6 ml 30 % akrilamid/biszakrilamid, ml 1 M-os ph 8.8-as TRIS, 0.3 ml 5 %-os SDS, ml desztillált víz, 6-8 mg APS, 15 µl TEMED Tömörítő gél (5 ml):0.83 ml 30 % akrilamid/biszakrilamid, ml 1 M-os ph 6.8-as TRIS, 0.1 ml 5 %-os SDS, 3.5 ml desztillált víz, 8 mg APS, 10 µl TEMED

17 A 16-3 fág h génje - 17 Mintafelvitel előtt a mintákat 90 C-ra raktuk. Ezután a gélt glicin pufferben 30 maen előfuttattuk, majd a mintákat a tömörítő fázison 20 ma-en, majd a szeparáló fázison 40 ma-en választottuk el. A gélfestéshez 0.2 %-os Coomassie kék festéket használtunk. Az éjszakán át festett gélt mosópufferben mostuk, melynek összetétele a következő: 10 % metanol, 30 % ecetsav, desztillált víz Ligálási reakció A ligálási elegyet vektor DNS oldat, fragment DNS oldat, 5 ligáz puffer (500 mm TrisHCL, 100 mm MgCl 2, 10 mm ATP, ph 7,6) és desztillált víz felhasználásával állítottuk össze. A reakcióhoz higított T4 DNS ligázt használtunk (4µl T4 DNS ligáz -1 weiss U/µl- és 200 µl T4 DNS ligáz puffer) és az elegyet legalább 1 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A ligálási reakciót 15 µl végtérfogatban végeztük, 5 µl DNS-t mértünk bele Kompetens sejtek készítése A kompetens sejtek készítéséhez E. coli XL1-blue törzset használtunk. 200 ml SOB táptalajban (2% Bacto trypton, 0,5% Yeast extract, 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl, ph 7,0) éjszakán át C-on os OD-ig (OD 600 ) növesztettük a baktériumkultúrát, majd 10 percre jégre tettük, ezután mindig 0 C-on dolgoztunk. A sejteket 10 perces centrifugálással (4000 rpm) gyűjtöttük össze, majd 80 ml hideg TB pufferben (10 mm PIPES, 15 mm CaCl 2, 250 mm KCl, ph 6,7) szuszpendáltuk fel. 10 percig jégen inkubáltuk, majd centrifugáltuk és 20 ml 0 C-os TB pufferben szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 1,5 ml dimetil szulfoxidot (DMSO) adtunk, a sejteket Eppendorfcsövekbe szétosztva fagyasztottuk és transzformációig -80 C-on tároltuk (Inoue et al., 1990).