A 16-3 bakteriofág host-range mutációi

Átírás

1 DIPLOMAMUNKA A 16-3 bakteriofág host-range mutációi Maász Anita biológus hallgató témavezető: Dr. Putnoky Péter Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék 2004.

2 TARTALOM RÖVIDÍTÉSEK 3 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A 16-3 bakteriofág A 16-3 bakteriofág genetikai és fizikai térképe A 16-3 bakteriofág ismert génjei A fágfertőzés folyamata A h gén lokalizálása A rhizobiumok A szimbiózis kialakulása Sejtfelszíni poliszacharidok A szimbiózisban szerepet játszó fontosabb gének KÍSÉRLETI ELŐZMÉNYEK CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok Baktériumok és bakteriofágok szaporítása Cseppteszt Fágkötési teszt Bakteriofág DNS izolálás Plazmid DNS preparálás DNS tisztítás a minták nukleotidsorrendjének meghatározásához Agaróz gélelektroforézis és restrikciós endonukleázok alkalmazása Fragmentizolálás Ligálási reakció Kompetens sejtek készítése Transzformáció PCR DNS szekvencia meghatározás Számítógépes szekvencia analízis KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK Egy host-range mutáció jellemzése Újabb host-range fágmutánsok azonosítása A fág baktériumfelszín felismerésében más fágfehérje is szerepet játszhat A h mutáns fágok baktériumhoz történő kötődésének vizsgálata ÖSSZEFOGLALÁS FÜGGELÉK FELHASZNÁLT IRODALOM 36 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 2

3 RÖVIDÍTÉSEK Amp ATP bp DMSO DNS EDTA EPS IPTG kb Km KPS LPS Neo ORF PCR SDS Tris X-gal ampicillin adenozin-5 -trifoszfát bázispár dimetil-szulfoxid dezoxi-ribonukleinsav etilén-diamin-tetraacetát exopoliszacharid izopropil-β-d-galaktopiranozid kilobázis kanamicin kapszuláris poliszacharid lipopoliszacharid neomicin open reading frame (nyitott leolvasási keret) polimeráz láncreakció nátrium-dodecil-szulfát tris-(hidroxi-metil)-amino-metán 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-tiogalaktopiranozid 3

4 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. A 16-3 bakteriofág A bakteriofágok a baktériumgenetika fontos eszközei, elég, ha csak az Escherichia coli - lambda fág rendszerre utalunk, amely kiemelkedő jelentőségűvé vált. A rhizobium genetikában, melynek fő célja a szimbiotikus baktériumgének megismerése, ennek mintájára szintén fontosnak tűnt egy megfelelő fág - baktérium rendszer megismerése. A rhizobiumok számos bakteriofágja ismert. Ezek közül többel végeztek sikeresen általános vagy speciális transzdukciót. A legtöbb eredmény a Sinorhizobium meliloti törzsek fágjaival született. Ezek közül is kiemelkedik a Magyarországon használt S. meliloti 41 törzsön szaporodó 16-3 fág, amely az egyetlen részletesen tanulmányozott rhizobium fág. A 16-3 fágot a talajból izolálták Balatonberény környékén (Szende et al., 1960). A virion kromoszómája kétszálú, lineáris, 60,8 kb nagyságú molekula (Dallman et al., 1979), amely 10 bázis hosszú, 3 túlnyúló ragadós végekkel rendelkezik. Alakjában és több molekuláris sajátságában is emlékeztet a lambda fágra és ahhoz hasonlóan egy speciális transzdukáló fág. Ismert a részletes genetikai-fizikai térképe (1. ábra), a represszor fehérje szerkezete, a fág és a baktérium kromoszómáján lévő att régió pontos szekvenciája, tanulmányozták a fág integrációjának mechanizmusát. Ennek eredményeként egy speciális vektorcsaládot is kifejlesztettek, amely a fág int génjét és att régióját hordozza. Ennek felhasználásával a legkülönbözőbb gének építhetők be a S. meliloti 41 kromoszóma att helyére (Papp et al., 1993) A 16-3 bakteriofág genetikai és fizikai térképe A 16-3 fág alapvető genetikai analízisét és térképezését különböző mutánsok segítségével végezték el. Az izolált, mintegy 150 ts (hőérzékeny) mutáns a fágszaporodás szempontjából korai és kései típusokra bontható. A korai és kései funkciók elkülönülését jól tükrözi a 16-3 fág genetikai térképe, szoros korreláció van a gének elhelyezkedése és működésének ideje között (1. ábra) (Orosz et al., 1973). A géntérkép régiói a következők: h gén - ant gén - lizozim gén - immx régió - att régió - int gén - xis gén - avirc operátor - C cisztron - avirt operátor (Orosz et al., 1973). A géntérkép hossza a C cisztrontól a lizozim génig 40 térképegység hosszúságú. 4

5 Elkészítették a 16-3 fág kromoszómájának fizikai térképét 10 féle restrikciós endonukleáz segítségével. Ez száz térképezett hasítóhelyet tartalmaz (7. fejezet). Lényegesen kevesebb a 16-3 fágról szerzett ismeretanyag, mint az, ami az E. coli lambda vagy T4 fágjáról felhalmozódott. Ennek ellenére a 16-3 fág ma már a viszonylag jól ismert bakteriofágok szűk köréhez tartozik (Orosz et al., 1973; Dallmann et al., 1979; Dorgai et al., 1981). 1. ábra: A 16-3 bakteriofág genetikai és fizikai térképe. Az ábra felső részén a 16-3 fág publikált fizikai térképe látható két restrikciós endonukleázzal hasítva (Dorgai et al., 1983). A számok az 1. táblán (7. fejezet) található hasítóhelyek pozíciójára utalnak. A színes téglalapok a géneket, illetve a fontos régiókat jelölik. Az ábra alsó részén az egyes régiók felépítését tüntettük fel. P R, P C : a C cisztron promotereit, az O R az operátor régiókat jelöli. (Csiszovszki et al., 2003; Semsey et al., 1999; Dallmann et al., 1991) 5

6 A 16-3 bakteriofág ismert génjei A 16-3 fágnak két fő regulátor génje van: a c cisztron és az immx régió (Orosz et al., 1973). A c regulátorgén a 16-3 egyik legjobban ismert génje, amely a lizogén életciklus kialakításában játszik szerepet, a fág baktériumba integrálódását és kivágódását szabályozza. A gén kódoló régiója az (55)HindIII-(60)HindIII fragmenten található (1. ábra). Két operátor régióval rendelkezik: avirc és avirt. Az avirc a géntől 5 irányban található, míg az avirt -t 3 irányban a korai génekhez közel lokalizálták. A c gén terméke egy represszor fehérje, amely transzkripciógátló hatást fejt ki. A DNS szekvencia adatok alapján a C represszor egy 197 aminosav hosszúságú bázikus fehérje. Amino-terminális doménje egy helix-turn-helix DNS kötő motívumot hordoz, amely az operátor régióhoz való kötődésért felelős (Dallmann et al., 1991). A másik regulátor régió, az immx a (41)EcoRI hasítóhely környékén lévő körülbelül 1500 bázispáros régióban foglal helyet (EcoRI L, H fragment) (1. ábra). A vizsgálatok alapján ez a regulátor nagymértékű hasonlóságot mutat a lambda fág ci represszorával. Az immx régió 3 részből áll: X U, X L és X V. Az X U és X L két átfedő cisztron, amelyek a px U, px L fehérjéket kódolják. E fehérjék szabályozó tevékenységének célpontja az X V régió, amely szintén három részből áll: X V1, X V2, X V3. Az X V1 egy rho független transzkripció terminációs struktúra. Az X V2 az X V1 és X V3 expresszivitását növeli (Dorgai et al., 1986; Csiszovszki et al., 2003). A 16-3 egy tipikus temperált fág, amelyik helyspecifikus rekombináció révén képes integrálódni a gazdakromoszóma egy meghatározott helyére. A baktérium és a fág részéről is az att régiók (fág: attp, baktérium: attb) vesznek részt a folyamatban. A fág genomjában az attp szekvencia a (48)EcoRI - (52)EcoRI hasítóhelyek között (K fragment) található (1. ábra). Az att régión belül egy 51 bázispár hosszúságú szakaszt, egy core (magi) régiót különíthetük el, amely a fágban és a baktériumban is azonos. E részen belül történik meg a szálkicserélődés. A baktérium kromoszómáján található attb hely két fordított orientációjú integráz kötőhelyet tartalmaz (Dorgai et al., 1993; Papp et al., 1993). A helyspecifikus rekombináció működését két rekombináns gén teszi lehetővé: az int és a xis gén (1. ábra). Az int gén az integrációért felelős fehérjét (Int) kódolja, a xis gén pedig a baktérium kromoszómájából történő kivágódásért felelős. Mindkét gént az att régiótól 3 irányban a (48)EcoRI - (55)HindIII hasítóhelyek között lokalizálták. A két gén körülbelül 240 bázispár hosszú része átfed egymással. Mindkét gént a C represszor 6

7 fehérje szabályozza. Az int gén által kódolt fehérje hordozza mindazon jegyeket, amelyek a helyspecifikus rekombinázok integráz családjának tagjaira jellemzőek. Így az Int fehérje is ebbe a csoportba sorolható. A homológia vizsgálatok alapján elmondható, hogy a fehérje C-terminális részéhez közel a 346-os pozícióban található tirozin oldallánc vesz részt a DNS szálak hasításában. Ezen oldallánc hidroxil csoportjának eltávolítása a fehérje rekombináz aktivitásának elvesztéséhez vezet (Semsey et al., 1999). A xis gén által kódolt fehérje (Xis) 140 aminosavból áll. Számítógépes analízis szerint az N-terminálisán valószínűleg egy helix-turn-helix motívum található. Mérete hasonló az eddig ismert néhány hasonló fehérje méretéhez, de azokhoz számottevő szekvencia homológiát nem mutat. A 16-3 fág h génje a (28) EcoRI - (37) EcoRI (D) fragmenten található. A fág farki rost fehérjéjét (H) kódolja, amely a fág baktériumhoz tapadásában játszik fontos szerepet. Az ant gén a h gén közelében, attól 3 irányban helyezkedik el (1. ábra). Az általa termelt fehérje (Ant) a fág poliklonális ellenanyagokkal történő reakciójában vesz részt (Orosz et al., 1970) A fágfertőzés folyamata A fág a fertőzés során először farki rostjával a baktérium sejtfal speciális kiemelkedésein, az ún. fágreceptorokon tapad meg. Ezt fág adszorpciónak nevezzük, amely hatékony, kalciumiont igénylő folyamat. A fág a tapadási folyamat után lítikus és lizogén módon szaporodhat (2. ábra). Lítikus úton a fágok a baktériumon belül sokszorozódnak, majd a baktériumsejtet szétroncsolva kiszabadulnak és újabb baktériumokat fertőznek meg. A lizogén módon szaporodó fágok kromoszómájukat a baktérium genomjába képesek integrálni és ott generációkon keresztül a baktériummal együtt replikálódni. A 16-3 tulajdonságainak és viselkedésének beható tanulmányozása során kiderült, hogy ez a bakteriofág egy temperált (mérsékelt) fág, amely képes profágként a baktérium genomjába integrálódni, illetve lítikus úton is szaporodni. Ezzel szemben léteznek agresszív fágok, amelyek csak lítikus módon képesek önmaguk sokszorozására (Szende et al., 1960). A 16-3 fág integrációja helyspecifikus rekombináció révén valósul meg. A folyamat meghatározott szekvenciájú rövid homológ DNS szakaszok között játszódik le, 7

8 amelynek során profág keletkezik. Az, hogy a 16-3 fág helyspecifikus rekombinációs rendszere E. coliban nem működik, arra utal, hogy a fág kromoszómába épüléséhez specifikus gazdafaktor is szükséges, amely az E. coliban nem található meg. A 16-3 helyspecifikus rekombinációs rendszer közvetlen felhasználhatóságának tehát két feltétele van, az egyik a specifikus gazdafaktor jelenléte, a másik pedig az, hogy a rekombinációs célszekvencia az adott baktérium kromoszómáján megtalálható legyen (Semsey et al., 1999). A 16-3 fág csak a baktérium egy meghatározott régiójához (attb) tud hozzákapcsolódni. Környezeti indukció hatására bekövetkező kivágódása során e régió környéki kromoszómaszakaszokat képes magával vinni. Így a fág fehérjeburkába a fág DNS helyett bakteriális DNS darabok kerülhetnek. A 16-3 fág tehát egy speciális transzdukáló fág. Léteznek azonban általános transzdukcióra képes fágok, amelyek a baktérium kromoszómájából bizonyos gyakorisággal (10-5 ) kivágódva bármely baktérium-kromoszómadarabot magukkal ragadhatnak. 2. ábra: A bakteriofágok szaporodási formái ( lizogén, lítikus). 8

9 Egyedi cys + transzduktáns telepekből fágot indukáltak és megvizsgálták a fág DNS restrikciós képét. Gyakran találtak stabilan transzdukáló, ugyanakkor életképtelen fágokat, amelyeket dtr-nek neveztek el. Az ilyen fág csakis helper fág jelenlétében szaporodott. A dtr fágokban a fág DNS óriási része hiányzott. A hiányzó szakaszt bakteriális DNS helyettesítette. A deléció/inszerció nem érinti a ragadós végeket és a replikációs origót, aminek következtében a dtr kromoszóma jól pakolódik és replikálódik. A kiesett fág funkciókat és az ezeket kódoló fág DNS szakaszokat azonosítva megállapították, hogy a Sinorhizobium meliloti DNS modifikáló aktivitással rendelkezik (Svab et al., 1978 ). Az érett fágrészecske elkészüléséhez (ún. eklipsz periódus) 28 C-on minimálisan 80 percre, 36 C-on 65 percre van szükség (Orosz et al., 1973). A fágot a késői gének által kódolt 5 nagy (72 Kd, 18,5 Kd, 31,5 Kd, 47 Kd, 86 Kd) és 5 kicsi (25 Kd, 27 Kd, 50 Kd, 59 Kd, 68 Kd) fehérje építi fel. Eddigi ismereteink alapján a fágfej 6 (18,5 Kd, 31,5 Kd, 47 Kd, 50 Kd, 59 Kd, 68 Kd), a farokrész pedig 2 polipeptidláncot (72 Kd, 86 Kd) tartalmaz. A két legkisebb fehérje (25, 27 Kd) helyzete még bizonytalan (Erdei et al., 1982) A h gén lokalizálása Ha a baktérium felszínén megváltozik a fág receptora, de még jelen van, akkor lehet olyan fágmutánsokat izolálni, amelyek egy mutáció révén képesek ismét felismerni ezt a felszínt. A jelenséget host-range mutációnak, az érintett gént pedig h génnek nevezzük. Orosz László laborjában Palágyi Zsuzsanna (pzs plazmidok) határozta meg a h gén körülbelüli helyzetét marker rescue technikával, mely során h mutáns fágból klónozott DNS fragmenteket egy plazmidba. Ha a plazmidot tartalmazó baktériumon vad típusú fágokat szaporítottak el, akkor homológ rekombináció révén a fágokban megjelenhet a h mutáció. A h mutánsok nagy száma jelezte, hogy a kérdéses mutáció a klónozott DNS szakaszon helyezkedik el. Egyre kisebb DNS fragmentumokkal dolgozva, ezen az elven a pzs5 klón,- amely EcoRI hasítással keletkezett, illetve a BamHI enzimmel előállított pzs10 klón (4. ábra) tartalmazta a mutációt. Így a h mutációt az 1,16 kb hosszúságú BamHI szakaszon belül lehetett lokalizálni. 9

10 1.2. A rhizobiumok A 16-3 bateriofág gazdabaktériuma a Sinorhizobium meliloti 41-es törzs, amely a Rhizobiaceae családba tartozó endoszimbionta talajbaktérium. E család tagjai (Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium, röviden rhizobiumok) nitrogénkötésre képesek. Általában a Leguminosae (hüvelyesek) növénycsalád tagjaival alakítanak ki szimbiótikus kapcsolatot (Allen et al., 1981). Ez az együttélés mindkét fél számára előnyös, hiszen a baktérium tápanyagokhoz jut a növény által, a növény pedig a szervezete felépítéséhez szükséges nitrogént a baktériumok segítségével veszi fel. Így a növény tulajdonképpen függetleníti fejlődését a talajtól és közvetve a légkör nitrogéntartalmát hasznosítja. Az általunk vizsgált Sinorhizobium meliloti 41 (régi nevén Rhizobium meliloti 41) egy pálcika alakú, endospóra nélküli Gram-negatív baktérium, amely Medicago, Melilotus és Trigonella fajokkal alakít ki endoszimbiózist. Gazdaságilag legfontosabb partnere a lucerna (Medicago sativa) A szimbiózis kialakulása A rhizobiumok hüvelyes növényekkel kialakított kapcsolatát endoszimbiózisnak nevezzük. A baktériumok e folyamatban egy új növényi szerv, a szimbiótikus gümő (nodulus) belsejében végzik a nitrogénfixációt. Ez a struktúra csak a megfelelő baktérium jelenlétében alakul ki a gazdanövény gyökerén. A rhizobiumok a gümő belsejében a nitrogéngázt ammóniává redukálják, hasznosíthatóvá téve ezáltal a növény számára. A fertőzési folyamat függ a növény fiziológiai állapotától és a fertőzési helyek egymástól való távolságától. A baktériumok a növény gyökérszőrsejtjein keresztül jutnak be azok belsejébe. A baktériumok ezért először e képletekhez kapcsolódnak. Hatásukra a fertőzési ponttal ellentétes oldalon megindul a gyökérszőrsejt növekedése, ami annak görbülését eredményezi. A fertőzési ponton a sejtfal leépül és egy sejtösszetevőkből álló, újonnan kialakuló csőszerű képlet, az infekciós fonal jön létre. Ebben a baktériumok a kéregsejteken át a kéreg belsejébe jutnak, ahol mitózist indukálnak. Ennek hatására egy új osztódószövet, a gümőmerisztéma jön létre (Dudley et al., 1987), amelyből aztán a gümő fejlődik. Ezzel egyidőben a baktériumok endocitózissal belépnek a gümősejtekbe, így egy ún. peribakteroid membránnal határolódnak, amely transzportfehérjéket tartalmaz és jelentős 10

11 anyagtranszportot bonyolít le. Közben a baktériumok fiziológiai változásokon mennek keresztül, illetve térfogatuk szeresére megduzzad, vagyis bakteroidokká alakulnak. A bakteroidok nitrogenáz enzimének működéséhez nélkülözhetetlen bizonyos mennyiségű (csekély) oxigén. A komplex azonban túl nagy oxigén-koncentrációra érzékeny. A gazdanövényben egy olyan különleges hemoglobin képződik, a leghemoglobin, amely biztosítja az alacsony, de még szükséges oxigén mennyiséget (mikroaerob környezet) Sejtfelszíni poliszacharidok A szimbiózis kialakulásában fontos szerepük van a rhizobiális sejtfelszíni poliszacharidoknak. Ezen belül elkülöníthetünk exopoliszacharidokat (EPS), lipopoliszacharidokat (LPS) és kapszuláris poliszacharidokat (KPS). Az exopoliszacharidok a sejtfelszínen felhalmozódó és a környezetbe nagy mennyiségben kiválasztott extracelluláris poliszacharidok. Nélkülözhetetlen szerepet töltenek be a gümőfejlődésben, ugyanakkor a szimbiózis kialakulásában nem meghatározó a funkciójuk. A S. meliloti 41 törzs egy szükcinoglükán természetű heteropoliszacharidot termel, amely ismétlődő oktaszacharid egységekből épül fel. Az alegységek szukcinil, piruvil és acetil módosításokat tartalmaznak. Ezek közül a szukcinil és piruvil csoportok elengedhetetlenül szükségesek a gümő kialakulásához. (Hiányuk esetén gümő nem képződik.) A S. meliloti 41 által termelt exopoliszacharidot kromatográfiás módszerrel egy nagy (HMW) és egy kis (LMW) molekulatömegű frakcióra lehet elkülöníteni. Az exopoliszacharidok szintézise négy lépéses folyamat: 1. nukleotidcukrok szintézise (UDP-glükóz, UDP-galaktóz); 2. az oktaszacharid alegységek szintézise a nukleotidcukrokból egy lipidhordozó felszínén; 3. az alegységek módosítása piruvil, szukcinil és acetil-csoportok elhelyezése révén; 4. az oktaszacharid alegységek polimerizációja. A lipopoliszacharidok a Gram-negatív baktériumok sejtfelszínének fontos alkotói, a külső membrán integráns részei. Egy LPS molekula három szerkezeti egységre tagolható: lipida egység, amely a molekulát a külső membránhoz horgonyozza. Ehhez kapcsolódik a konzerválódott szerkezetű core oligoszacharid, amellyel az ismétlődő 11

12 oligoszacharidokból álló törzsspecifikus O-antigén alakít ki kapcsolatot (Kannenberg et al.,1994). A lipopoliszacharidok a nagy variabilitással és nagyfokú immunogén aktivitással rendelkező alkotórészük (O-antigén) által fontos szerepet tölthetnek be például a patogenitás mértékének meghatározásában. Ezek a sejtfelszíni struktúrák az új eredmények alapján a rhizobiumoknál szerepet játszhatnak a szimbiózis kialakításában. A kapszuláris poliszacharidok más néven (erős immunogén hatásuk miatt) K- antigének a baktérium felszínéhez szorosabban kötődő struktúrák, amelyek (az EPS-sel ellentétben) nem választódnak ki a környezetbe. A KPS-ek szerkezetüket tekintve diszacharidegységekből felépülő poliszacharidok. A diszacharidegységek a 2-keto-3-deoxi-oktulonsavat (Kdo) vagy annak valamilyen variánsát tartalmazzák. Az EPS-sel ellentétben, melynek szerkezete fajon belül állandó, a KPS törzsspecifikus antigén, vagyis a faj különböző törzsei eltérő szerkezetű sejfelszíni KPS-sel rendelkeznek (Reuhs et al., 1997). A S. meliloti 41 törzs K R 5 nevű poliszacharidot termel. Ez a struktúra felépítésében hasonló az E. coli törzs II. típusú K antigénjéhez (Reuhs et al., 1993). A KPS-ek képesek akár az EPS-ek szerepét is betölteni a szimbiózisban. Erre az általunk vizsgált baktériumtörzs exob mutánsa mutatott rá, amely az EPS elvesztése mellett továbbra is ki tudott alakítani szimbiózist a gazdanövénnyel. Ezt pedig a KPS biztosította (Putnoky et al., 1990). A KPS-ek elősegítik a bakteriofág baktériumhoz történő kötődését, azonban léteznek a 16-3 fágra rezisztens KPS baktériummutánsok, amelyekhez a fág nem tud hozzákapcsolódni, mert megváltozott szerkezetű poliszacharidot termelnek, vagy egyáltalán nem képeznek ilyen sejtfelszíni struktúrákat (Petrovics et al., 1993; Kereszt et al., 1998; Kiss et al., 2001) A szimbiózisban szerepet játszó fontosabb gének A S. meliloti 41 törzs 6,7 Mb nagyságú genommal rendelkezik (Honeycutt et al., 1993). Kromoszómája 3,7 Mb hosszú, emellett egy psyma (1,4 Mb) és egy psymb (1,7 Mb) megaplazmidot hordoz. A psyma replikon a nod, nif és fix géneket illetve a transzfert irányító szekvenciákat (orit és tra gének) tartalmazza. A psymb plazmidon az orit és tra gének homológjai és sok poliszacharid bioszintézist irányító gén található. 12

13 Rendelkezik még néhány esszenciális aminosav bioszintézisét kódoló, illetve a sejtosztódáshoz nélkülözhetetlen génnel. A hordozott gének által a psymb megaplazmid növeli a baktérium környezethez való alkalmazkodóképességét. A szimbiózis kialakulásának és a nitrogénfixáció egyes lépéseinek kódolásáért felelős géneket három csoportba sorolhatjuk: nodulációs gének, gümőinváziót meghatározó gének és a nitrogénkötés génjei. A nodulációs gének (nodabc) a növény által kibocsátott szignálmolekulák (flavonoidok) megjelenésével aktiválódnak. Egy diffúzibilis molekula, a Nod-faktor szintézisét kódolják, amely a gazdanövény gyökerén hoz létre változásokat: indukálja a gümőmerisztéma és a gümő kialakulását. A gümőinváziót meghatározó gének közé a sejtfelszíni struktúrák bioszintézis útjait kódoló géneket soroljuk, hiszen a szimbiózis e szakaszában elsődleges szerepet ezek a struktúrák játszanak. Az infekcióban hibás mutánsok gümőfejlődést tudnak indukálni, azonban a fertőzési folyamat nem jön létre. Az exopoliszacharidok szintézisét ( fejezet) exo gének irányítják (exoa-w). A K R 5 antigén bioszintézisében szerepet játszó gének a psymb megaplazmidon, az rkp- 1,2,3 régióba tartoznak. A poliszacharidok szintézisében és a transzportban jelentős funkcióval bírnak az NdvA, B fehérjék, amelyeket az ndv gének kódolnak. A nitrogénkötés génjei közé sorolhatók a nif és fix gének. A nif gének a nitrogenáz enzimkomplex egyes részeit és kofaktorának szintézisét irányítják. A fix gének pedig a nitrogenáz enzimkomplexhez elektront szállító rendszer elemeit kódolják. 13

14 2. KÍSÉRLETI ELŐZMÉNYEK Munkám kezdetekor a vad típusú 16-3 fág h génjének DNS-szekvencia meghatározására vonatkozó kísérletek is megkezdődtek. (A kapott részletes eredmények Békási Krisztina diplomamunkájában olvashatók.) A vad típusú szekvencia meghatározásához először a fág fizikai térképe alapján a D és a C EcoRI fragmentet kellett elválasztani egymástól (3. ábra). Ezután a D fragmentből izolálva az 1,16 kb hosszúságú BamHI fragmentet, meghatározták annak nukleotidszekvenciáját. 3. ábra: A D EcoRI fragment helyzete a 16-3 fág fizikai térképén. Az ábra felső részén a 16-3 kromoszóma EcoRI restrikciós hasítóhelyei és a fragmentek jelei vannak feltüntetve. Az alsó részen a D EcoRI fragment részletesebb fizikai térképe látható, amelyen a számozás a restrikciós hasítóhelyek pozíciójára utal a 16-3 fág publikált fizikai térképén. (7. fejezet) (Dorgai et al., 1983) 14

15 A kapott szekvenciát elemezve megállapítható volt, hogy egyetlen esetben a meghatározott 1157 bp-os szakaszon keresztül húzódik egy ORF. Valószínűnek tartották, hogy ez az ORF határozza meg a H fehérje aminósavsorrendjét. A kapott szekvenciában azonban sem a gén elejét (5 vég), sem a gén végét (3 vég) nem találták meg. Ezért mindkét irányban meghatározták a szomszédos régiók nukleotidsorrendjét is. A 3 irányban történő szekvenálás eredményeként a (36)BamHI helytől körülbelül 300 bp távolságra elhelyezkedő transzlációs stop kodon, illetve egy transzkripció terminációs szignálszerű szekvencia volt azonosítható, amelynek jelenléte alátámasztja, hogy ez ténylegesen a h gént kódoló régió. Később a (34)BamHI helytől 5 irányba haladva azt próbálták meghatározni, vajon honnan kezdődik a h gén. Többféle esetleges transzlációs start kodont is detektáltak (ATG, GTG, GTT). Ezek közül a valós kezdőpont kiválasztásához a H fehérje termeltetésével kapcsolatos kísérleteket terveztek. A bakteriofág genetikai-fizikai térképén Palágyi Zsuzsanna révén már ismert volt egy host-range mutáció körülbelüli helyzete. A mutációt Orosz László laborjában marker-rescue technikával azonosította. Eredményei azt mutatták, hogy ez a változás a pdh1 klónon, a ppzs5 klónon ((29)BamHI - (36)BamHI fragmenten), illetve a ppzs10 klónon ((34)BamHI - (36)BamHI fragmenten) belül helyezkedik el (4. ábra). Az érintett gén nukleotid-szekvenciáját és természetét azonban eddig még nem határozták meg. 4. ábra: Egy h mutáció elhelyezkedése a 16-3 fág fizikai térképén. 15

16 3. CÉLKITŰZÉSEK A 16-3 fág kizárólag a Sinorhizobium meliloti 41 baktériumtörzsön képes szaporodni, feltehetően azért, mert ez a törzs egy speciális kapszuláris poliszachariddal rendelkezik, amelynek szerepe van a gazdanövénnyel való szimbiózis kialakításában is. Korábbi munkákban feltételezték, hogy a fág receptora ez a törzsre jellemző KPS. A fágreceptor természetének tanulmányozása érdekében célul tűztük ki receptor-mutáns baktérium és host-range fágmutánsok azonosítását és jellemzését. E munkában feladatunk a bakteriofág vizsgálata volt. Orosz László laborjában sok évvel ezelőtt egy mutációval azonosították a megváltozott baktériumfelszín felismerésében szerepet játszó fehérjét (H) kódoló h gén helyét a bakteriofág genetikai-fizikai térképén. Az érintett gén nukleotid-szekvenciájában történt változásokat azonban még nem vizsgálták. Ennek ismeretében célunk: a 16-3 bakteriofág feltételezett farki rost fehérjéjét kódoló h génben található mutáció(k) helyzetének feltérképezése, és a mutáció(k) természetének meghatározása volt. 16

17 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok A munkánk során használt baktériumtörzseket, bakteriofágokat és plazmidokat, illetve azok jellemzőit az 1. táblázat foglalja össze. 1. táblázat: Alkalmazott baktériumtörzsek, bakteriofágok, plazmidok. Elnevezés Baktériumtörzsek AK631 Jellemzők, hivatkozások RM41 kompakt kolóniamorfológiájú változata (exob631, Nod +, Fix + ) (Kondorosi et al., 1977) RM41 S. meliloti 41 vad típusú (Exo +, Nod +, Fix + ) (Putnoky et al., 1990) XL1-Blue GH4046 GH4178 GH4180 Bakteriofágok E. coli K12, reca1, enda1, gyra96, thi-1, hsdr17, supe44, rela1, lacz M15 (Stratagene USA) RM41 rkpm 4046 (Hoffmann) RM41 rkpm 4178 (Hoffmann) RM41 rkp-4180 (Hoffmann) PP2511 AK631 rkp-3::tn5 (212) Km R Sm R (Kiss et al., 2001) 16-3 S. meliloti 41 baktériumtörzsre specifikus vad típusú fág (Orosz et al., 1970) 16-3 h fág, host-range mutáns (ez a munka) 16-3 h fág, host-range mutáns (ez a munka) 16-3 h fág, host-range mutáns (ez a munka) 16-3 h fág, host-range mutáns (ez a munka) 16-3 h fág, host-range mutáns (ez a munka) Plazmidok pbs pbluescript II SK (+), Amp R, klónozó vektor, (Stratagene USA) pbbr1-mcs 2 Km R, Tra, Mob + (Kovach et al., 1995) pdh1 PLAFR1 kozmid 16-3 fág klón, h régió; (Dorgai et al., 1986) 17

18 4.2. Baktériumok és bakteriofágok szaporítása Az E. coli törzseket LB komplett táptalajon, a megfelelő antibiotikum jelenlétében 37 ºC-on, a S. meliloti törzseket pedig TA komplett táptalajon, 32 ºC-on növesztettük. Az LB tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton 5 g/l Yeast extract 5 g/l NaCl (ph 7,2). (Meade et al., 1977) A TA tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton 1 g/l Yeast extract 5 g/l NaCl (ph 7.0) 1 mm MgSO 4 1 mm CaCl 2 (ph 7,2-7,5). (Orosz et al., 1973) A táptalajok készítésekor a tápoldatokat 1,5 % agarózzal, fedőagar esetében pedig 0,7 % agarral egészítettük ki. A szilárd táptalajokban alkalmazott antibiotikum koncentrációkat a 2. táblázat tartalmazza. 2. táblázat: Alkalmazott antibiotikum koncentrációk (µg/ml). Antibiotikumok E. coli S. meliloti ampicillin 100 kanamicin tetraciklin A bakteriofágok esetében 4 ml TA tápfolyadékban 0,2 ml megfelelő baktériumot (friss kultúra) és 1 plakk növeszteni kívánt bakteriofágot kevertünk össze, majd ezt éjszakán át 32 ºC-on erős rázatás mellett szaporítottuk Cseppteszt A kísérlet elvégzéséhez 4 ml TA fedőagarban elkevert, éjszakán át növesztett 0,2 ml rhizobium kultúrát TA táptalajt tartalmazó lemezekre szélesztettünk. A tesztelendő 18

19 bakteriofág szuszpenziójából 1 µl-t ( db fág részecske) a megszilárdult fedőagar tetejére cseppentettünk, majd 32 C-on, termosztátban inkubáltuk. Ha a fág fertőzése sikeres volt, másnapra tiszta tarfolt (plakk) vált láthatóvá. Kísérleteinkben ennek meglétét illetve hiányát elemeztük Fágkötési teszt A kísérletben éjszakán át növesztett baktériumkultúrát (RM41, GH4178, GH4180) és megfelelő higítású ( db/ml) bakteriofágot (16-3, 16-3 h 5, 16-3 h 109 ) használtunk. A teszt kivitelezése előtt meghatároztuk a fágok titerét [16-3 (3,4x10 9 ); 16-3 h 5 (1,05x10 10 ); 16-3 h 109 (4,2x10 9 )]. Ezen értékek alapján állapítottuk meg a higítás mértékét. A reakcióhoz 800 µl TA tápoldatot, 200 µl baktériumot és 50 µl megfelelő fágot használtunk. A vak (kontroll) oldatba baktérium helyett 200 µl TA oldatot adtunk. Ezután az Eppendorf-csöveket azonos körülmények között kezeltük: 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd a baktériumokat a hozzájuk tapadt fágrészecskékkel együtt lecentrifugáltuk (5 perc, rpm). Ezután a felülúszóból származó 100 µl fágot 0,2 ml vad típusú baktériummal kevertük össze és fedőagar jelenlétében TA táptalajt tartalmazó lemezekre szélesztve 32 C-on növesztettük. E fágtitrálással meghatározható volt a felülúszóban maradt (baktériumok által nem kötött), fertőzőképes bakteriofágok száma Bakteriofág DNS izolálás A szükséges mennyiségű DNS oldatot 20 ml TA táptalajban egész éjszakán át növesztett bakteriofágból ( fág/ml) izoláltuk. 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe mértünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük. A felülúszót új csőbe átpipettázva 300 µl PEG/NaCl (20% PEG 6000; 2,5M NaCl) oldattal kevertük össze. Ezután a mintákat 15 percig jégen (0 C) inkubáltuk, majd újra lecentrifugáltuk. Az üledéket 50 µl TE (50mM Tris; 20mM EDTA; ph 8,0) oldatban szuszpendáltuk és 0,1 térfogat 10 % SDS oldatban vettük fel. Az elegyet 1 térfogat 7,5 M hűtött ammónium-acetáttal kevertük össze. 15 perces 0 C-on történő inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, majd a felülúszót új csőbe mérve 0,6 térfogat izopropanollal csaptuk ki a DNS oldatot. A mintákat 15 percig - 20 C-on inkubáltuk, majd 5 percig centrifugáltuk. Ezután az üledéket 400 µl 70 %-os 19

20 etanollal mostuk, szárítottuk, majd 25 µl (vagy 50 µl) steril desztillált vízben oldottuk fel. A kísérlet sikerességét restrikciós endonukleázokkal történő DNS emésztés után agaróz gélelektroforézissel ellenőriztük (4.8. fejezet). Az emésztés során 1 µl bakteriofág DNS mintát használtunk Plazmid DNS preparálás A plazmid DNS oldatot 3 ml TA táptalajban éjszakán át növesztett sejtekből alkalikus lízissel preparáltuk (Ish-Horovicz et al., 1981). 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe mértünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük, majd 100 µl TEG oldatban (25 mm TrisHCl; 10 mm EDTA; 50 mm glükóz; ph 8,0) szuszpendáltuk fel. A feltárást óvatos keverés mellett 200 µl NS oldat (0,2 N NaOH; 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig jégen (0 ºC) inkubáltuk, majd 160 µl 0 ºC-os nátrium-acetátot (3M, ph4,8) adtunk az oldathoz. A keletkezett csapadékot 5 perc 0 ºC-os inkubáció után 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszóban lévő plazmidot 320 µl izopropanollal csaptuk ki. 10 perc 20 ºC-on történő inkubáció után a mintákat lecentrifugáltuk, 400 µl 70 %-os etanollal mostuk és szárítottuk. A csapadékot 100 µl Tris-pufferben (50 mm TrisHCL; 100 mm nátrium-acetát; ph 8,0) oldottuk fel, majd 200 µl 96%-os etanollal ismét kicsaptuk. 10 perc 0 ºC-os inkubáció után a mintákat újból lecentrifugáltuk, mostuk és szárítottuk, majd kozmidok esetén 30 µl, pbluescript, illetve pbbr plazmidok esetében 50 µl RNáz ( µg/ml) oldatban vettük fel DNS tisztítás a minták nukleotidsorrendjének meghatározásához A szekvenálási reakció előtt nagy tisztaságú minták előállításához erre a célra tervezett tisztítási lépést végeztünk. A preparált DNS mintákhoz 0,1 térfogat 10 %-os SDS oldatot adtunk, és 5 percig jégen inkubáltuk. Ezután az DNS-SDS elegyhez 1 térfogat (0 ºC-os) 7,5 M ammónium-acetát oldatot tettünk és a mintákat 15 percig jégen inkubáltuk, majd a keletkezett csapadékot 5 percig centrifugáltuk (12000 rpm). A felülúszót azonnal átpipettáztuk egy másik Eppendorf-csőbe, és a benne lévő DNS oldatot 0,6 térfogat izopropanollal csaptuk ki. 20 perc 20 ºC-on történő inkubáció után a mintákat 400 µl 70 %-os etanollal mostuk, szárítottuk, majd a tisztított DNS oldatot µl steril desztillált vízben oldottuk fel. 20

21 4.8. Agaróz gélelektroforézis és restrikciós endonukleázok alkalmazása A tisztított plazmid DNS mintából 0,2-0,5 µg-ot, a bakteriofág DNS preparátumból 1-2 µg-ot használtunk fel restrikciós endonukleázokkal történő emésztésekhez. A mintákat 1-2 U mennyiségű FERMENTAS enzim, megfelelő enzimpuffer és steril desztillált víz jelenlétében 1-2 óráig 37 ºC-on inkubáltuk. Az emésztés végén a reakcióelegybe 1/5 rész mintafelviteli puffert (10 % ficoll; 0,25 M EDTA; ph 8,0; 0,2 % brómfenolkék) mértünk. (Maniatis et al., 1982) A restrikciós endonukleázokkal hasított minták fragmentjeit agaróz gélen választottuk el. A gél készítéséhez az agarózt 0,5xTBE pufferben (5,4 g TRIS; 2,75 g bórsav; 2 ml 0,5 M EDTA/1000 ml; ph 8,0) oldottuk fel, majd 100 µg/ml koncentrációjú etídiumbromidot mértünk bele, így a gél végkoncentrációja etídium-bromidra nézve 0,1 µg/ml lett. Munkánk során többnyire 1%-os gélt készítettünk. A gél dermedése (40-60 perc) után a fragmenteket 0,5xTBE pufferben V-on, fragmentizolálás esetén V- on szeparáltuk. Az elektroforézis során molekulatömeg-standardként PstI enzimmel hasított lambda fág DNS mintát alkalmaztunk. A kiértékelést UV fény segítségével végeztük és az eredményeket dokumentáltuk Fragmentizolálás A megfelelő restrikciós endonukleázokkal hasított fragmenteket elektroforézissel választottuk szét. Az izolálni kívánt fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk. 20 perces 60 V feszültség mellett történő futtatás után az izolálandó fragment a papírra került, amelyről 2x50 µl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS-t ezután 0,1 térfogat 3M nátrium-acetát oldat (ph 7,0) és 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával csaptuk ki. 20 perces (vagy éjszakán át) 20 ºC-on történő inkubáció után a mintát lecentrifugáltuk, 400 µl 70 %-os etanolban mostuk, szárítottuk és a keletkezett csapadékot 20 µl steril desztillált vízben oldottuk fel Ligálási reakció A ligálási elegyet vektor DNS oldat, fragment DNS oldat, 5x ligáz puffer (500 mm Tris HCl; 100 mm MgCl 2 ; 10 mm ATP; ph 7,6), steril desztillált víz és T4 ligáz enzim 21

22 felhasználásával állítottuk össze 15 µl végtérfogatra. A vektor és a fragment mennyiségét az ellenőrző emésztés eredményétől függően állapítottuk meg. A reakcióban a ligálandó végek minősége alapján kétféle T4 DNS ligáz enzimet használtunk: tompa végek esetében tömény, ragadós végek esetében higított ligázt alkalmaztunk. A ligálási elegyet ezután legalább 1 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk Kompetens sejtek készítése A kompetens sejtek készítéséhez E. coli XL1-blue törzset használtunk. 200 ml SOB táptalajban (2 % Bacto trypton; 0,5 % Yeast extract; 10 mm NaCl; 2,5 mm KCl; ph 7,0) 22 C-on történő erős rázatás mellett, 24 óráig növesztett baktériumkultúrát (OD= 0,5-0,6) 10 percre jégre tettünk, ezután mindig 0 ºC-on dolgoztunk. A sejteket 10 perces centrifugálással (4000 rpm) gyűjtöttük össze, majd 80 ml hideg TB pufferben (10 mm PIPES; 15 mm CaCl 2 ; 250 mm KCl; ph 6,7) szuszpendáltuk fel. A következő lépésben a mintát újra 10 percig jégen inkubáltuk, lecentrifugáltuk, majd 20 ml 0 C-os TB pufferben vettük fel. A szuszpenzióhoz 1,5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket Eppendorfcsövekbe szétosztva transzformációig 80 C-on tároltuk. (Inoue et al.,1990) Transzformáció Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket 80 C-ról jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt vektorba ligált DNS fragmentet, amelyet ezután 30 percig jégen inkubáltunk, majd 3 percig 37 C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 400 µl SOC oldatot (2 % Bacto trypton; 0,5% Yeast extract; 10 mm NaCl; 2,5 mm KCl; 20 mm glükóz; ph 7,0) adtunk a sejtekhez. Egy óra 37 C-on történő inkubáció után a sejteket szelektív LB táptalajra szélesztve másnapig 37 C-on inkubáltuk. A táptalaj 100 µl megfelelő antibiotikumot, 40 µl IPTG (100 mm) és 40 µl X-gal (2%, DMSO) oldatot tartalmazott. A másnapra felnövő telepek közül kék-fehér screen segítségével választottuk ki az inszertet tartalmazókat (fehér), vagyis amelyeknél nem figyelhető meg β galaktozidáz (lacz gén) aktivitás. A kiválasztott telepekkel további kísérleteket végeztünk. 22

23 4.13. Polimeráz láncreakció (PCR) A reakcióelegy 25 µl végtérfogatába: 1 µl higított (100x) templát DNS oldatot, 1-1 µl oligonukleotid primert [h31 (62,2 nmol); h51 (31,3 nmol); h32 (61,4 nmol); h52 (48,7 nmol)], 6 µl PCR-mixet (4x Taq puffer; 0,8 mm dntp; 6 mm MgCl 2 ), 15 µl steril desztillált vizet, 1 µl (2-5 U) Taq polimeráz enzimet mértünk. A reakció során előre megtervezett programot használtuk. A program leírása a 3. táblázatban olvasható. 3. táblázat: A kísérlet során alkalmazott PCR program C 2 perc C 30 mp C 30 mp C 1 perc 5. 35x GO TO C 1 perc 7. END A PCR reakcióban felsokszorozni kívánt szekvenciához oligonukleotid primereket terveztünk. A primereket és azok nukleotidsorrendjét az 4. táblázat tartalmazza. 4. táblázat: Alkalmazott primerek és szekvenciáik. primerek h31 h51 h32 h52 szekvenciáik gcgggctgcaaaatccaga caactgccgcggagatgg ccgccagaaacgacttcc gccattgcccgatgagg Az oligonukleotid primerek reakcióban elfoglalt helyzetét a 5. ábra mutatja. 23

24 4.14. DNS szekvencia meghatározás A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotidszekvenciáját a megfelelő oligonukleotidok segítségével a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg. A szekvenálást Sanger-féle láncterminációs módszer alapján működő reakcióval készítették elő és ABI PRISM automata szekvenáló berendezéssel végezték Számítógépes szekvencia analízis A meghatározott DNS részszekvenciákat számítógép segítségével összeillesztettük és megvizsgáltuk mind a hat leolvasási keretben a kódoló kapacitásukat (LaserGene programcsomag, DNA Star Inc., USA). 24

25 5. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 5.1. Egy host-range mutáció jellemzése Munkám kezdetekor folytak a vad típusú 16-3 fág h génjének DNS-szekvencia meghatározására vonatkozó kísérletek. Emellett fontosnak tűnt a 16-3 fág farki rost fehérjéjét kódoló génben hibás, mutáns allélek (h 5, h 15 allél) pontos szerkezetének felderítése is. A fágrezisztens receptor-mutáns baktériumon (GH4046) a rezisztencia-tesztben vizsgált vad típusú populáció (kb. 5x10 9 ) egy töredéke visszanyerte fertőzőképességét. Ez esetben a fágpopulációban feltételezéseink szerint olyan spontán mutációk jöhetnek létre a baktériumfelszínt felismerő H farki rost fehérjét kódoló génben, amelyek révén a fág adaptálódik a baktérium megváltozott, RkpM4046 receptorfehérjéjéhez. A baktérium részéről jelen kell lennie valamilyen sejtfelszíni struktúrának, amelyhez a bakteriofág kötődni képes. Az is bizonyos, hogy ezeknél a mutánsoknál (GH4046, GH4178) a fágreceptor valamelyest különbözik a vad típusú baktériumtörzsétől (RM41), hiszen a vad típusú fág nem képes azt felismerni. Megvizsgáltuk az izolált fágplakkok morfológiáját, majd az azonos fenotípusú és nagy számú plakkot adó fágokat választottuk ki kísérleteink folytatására. Az ilyen módon izolált fágokat tisztítottuk és a bennük található feltételezett h allélt h 5 és h 15 allélnek neveztük el, majd mindkét törzsből DNS preparátumot készítettünk. Ezután azt vizsgáltuk, hogy a h génen belül megtalálhatók-e az újonnan izolált hostrange mutációk, illetve mi azoknak a pontos helyzete. Ennek érdekében PCR reakció során felsokszoroztuk a h régiót két erre a célra tervezett oligonukleotid primer segítségével (5. ábra). A tisztított PCR fragmentek nukleotid-szekvenciáját ezekkel és két további primert használva határoztuk meg (5. ábra). Az oligonukleotid primerek szekvenciája a fejezetben található. 25

26 5. ábra: A 16-3 fág h 5 és h 15 alléljében található mutáció helyzetének meghatározása. Az ábra felső része a 16-3 fág illetve a h régió fizikai térképét mutatja, összefoglalva a h régió elemzése során nyert következtetéseket (Dorgai et al., 1983). Az alsó részen a PCR kísérlethez használt primerek elhelyezkedését és a mutáns allélekben talált változás természetét foglaltuk össze. A kapott szekvencia (6. ábra) elemzésekor csak egyféle host-range mutációt, egy változást találtunk az általunk H fehérjét kódoló régiónak tartott szakaszon. Természetét tekintve ez egy missense mutáció, ami olyan aminosavcserét jelent, amely a H fehérje hosszát nem, de a fág baktériumhoz történő kötődését megváltoztatja. Esetünkben ez a következőképpen alakult. A vad típusú bakteriofág h génjében ggc, azaz glicint kódoló triplet található, míg a mutáns fág h génjének ugyanezen helyén gac bázishármast azonosítottunk, ami már nem glicint, hanem aszparaginsavat kódol. 26

27 vad típusú bakteriofág h 5 mutáns allélt hordozó bakteriofág h 15 mutáns allélt hordozó bakteriofág h 109 mutáns allélt hordozó bakteriofág h 111 mutáns allélt hordozó bakteriofág h 114 mutáns allélt hordozó bakteriofág 6. ábra: A vad típusú bakteriofág, illetve a h 5, h 15, h 109, h 111 és h 114 mutáns allélt hordozó fágok h génjének szekvenciarészlete ( bp). A zöld téglalapok jelölik az egyes fágok szekvenciájában található eltérő bázishármas pozícióját. 27

28 Ez az eredmény több dolgot is jelentett számunkra: egyrészt alátámasztotta, hogy ez a feltételezett gén valóban a H farki rost fehérjét kódoló ORF, és ez a fehérje a host-range jelenség kialakulását befolyásolja. Azt vártuk, hogy a h génben és az általa expresszált fehérjében olyan változás alakuljon ki, amivel a fág alkalmazkodni tud a baktérium szintén mutáció által megváltozott fágfelismerő felszínéhez és ezt meg is találtuk. (A baktériummutánsok izolálása, illetve azok vizsgálata Deák Veronika és Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozatában olvasható.) a másik fontos megállapítás a mutáció és az aminosavcsere helye, amit kísérleteink alapján a gén által kódolt H fehérje C-terminális részén lokalizáltunk. Ebből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy ez a C-terminális rész funkcionálisan fontos szerepet tölt be a fág baktériumfelszínhez történő tapadásában Újabb host-range fágmutánsok azonosítása A fág baktériumfelszínt felismerő fehérjéje és a baktérium fágreceptora között létrejövő kölcsönhatás pontosabb megismerése érdekében a már elmondott elvek alapján (5.1. fejezet) újabb receptor-mutáns baktériumokat és host-range fágmutánsokat izoláltunk. A kísérlet eredményét a 5. táblázat mutatja be. 5. táblázat: A host-range fágmutánsok megjelenése a különböző baktériumtörzseken. A fertőzésnél minden esetben ugyanazt a fágpopulációt alkalmaztuk. Baktériumtörzs RM41 GH4046 GH4178 GH fágpopulációval (5x10 9 ) való fertőzés után, egy lemezen lévő plakkok száma 5x10 9 plakk 50 plakk 50 plakk 200 plakk 28

29 Az 5. táblázat adatai alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy valószínűleg két eltérő fenotípusú fágot tartalmazott a vizsgált lizátum (a vad típusú fág nagy többsége mellett). Az egyik a GH4046, illetve a GH4178 törzsön 50 plakk által képviselt fág. Ezen felül (vagy kívül) a GH4180 baktériumot egy további, a kísérletben 150 (200) plakkot adó fágmutáns is képes volt fertőzni. Azonban a GH4180 törzsön szaporodó fágok 75%-a (150) nem képes a másik két baktériumtörzshöz (GH4046, GH4178) kapcsolódni. Ezért mondhatjuk, hogy két különböző mutáns fágot sikerült kimutatnunk. A mutánsok közül hármat kiválasztottunk és h 109, h 111, h 114 jelzéssel láttuk el őket. E fágok további jellemzését a 6. táblázat mutatja. A táblázatban összehasonlításképpen feltüntettük az elsődlegesen izolált mutáns fágok fertőzőképességét is. 6. táblázat: A különböző host-range fág, receptor-mutáns és vad típusú baktérium gazdaspecifitása. A (-) jel a fágra való rezisztenciát, a (+) az érzékenységet jelenti. Host-range bakteriofág-mutánsok h 109 h 111 h 114 h 5 h 15 Receptormutáns baktériumok GH GH GH RM A kapott eredményeket elemezve elmondható, hogy abban az esetben, ha a h 114 -es fágtörzzsel fertőztük az rkpm 4046 allélt tartalmazó baktériumot (GH4046), pozitív eredményt kaptunk, vagyis a h 114 -es törzs mindkét baktériummutánson ugyanúgy képes szaporodni, ahogy azt a h 5 és h 15 allélt tartalmazó fágok esetében is megállapítottuk. Ez azt jelentheti, hogy e három bakteriofágban (h 5, h 15, h 114 ) a mutáció ugyanabban a régióban helyezkedhet el. (Az erre vonatkozó kísérletek és eredmények az 5.3. fejezetben találhatók.) A táblázat adatai alapján a h 109, h 111 allélt hordozó fágok az eredeti mutáns baktériumot (GH4046) nem, de az újonnan izolált mutánst (GH4180) képesek fertőzni. Tehát feltételezhető, hogy a h 109, h 111 -es törzsekben a mutáció legalábbis más aminosavcserét eredményez a h génen belül, vagy más gént érint. 29

30 5.3. A fág baktériumfelszín felismerésében más fágfehérje is szerepet játszhat Az 5.2. fejezetben olvasható feltevések bizonyítása érdekében meghatároztuk az újonnan izolált bakteriofágok (h 109, h 111, h 114 ) h régiójának nukleotid-szekvenciáját is, hasonlóan mint a h 5 és h 15 allél esetében (5.1. fejezet). Azt az eredményt kaptuk, hogy a h 114 mutáns allélben pontosan ugyanott és ugyanolyan mutáció található, mint az előzőleg izolált mutánsoknál (h 5, h ábra), viszont a h 109 és h 111 alléleket hordozó fágok h régiójának egész területén nem találtunk változást (6. ábra). Tehát a mutáció egy másik gén területére esik, ami azt feltételezi, hogy a fág baktérium kölcsönhatásban a fág több fehérjéje is részt vesz. Ezt a feltételezést alátámasztják a fág kezdeti vizsgálatakor kapott eredmények, miszerint a h génben talált mutáción kívül egy Ant mutáció is izolálható és térképezhető volt, amely a fág poliklonális ellenanyagokkal való reakcióját lényegesen gyengítette. Ezek ismeretében elképzelhető, hogy az általunk izolált 16-3 h 109 és h 111 az ant gén mutáns allélje. Ennek megállapítására vonatkozó kísérleteket a h 109 allélt tartalmazó törzs esetében terveztünk. Eredményeink nagyon hasonlítanak az E. coli lambda fág rendszerben tapasztaltakhoz. Mint ismeretes a lambda fág farki rost fehérjéjét (J) a j gén kódolja. E gén 3 végén szintén missense mutációt azonosítottak. A mutációt hordozó fágok csak a receptor-mutáns baktériumokat képesek fertőzni. E baktériumokban a fág-baktérium kapcsolat kialakításáért a malb gén által kódolt fehérje (MalB) felelős. A malb génben szintén egy missense mutációt detektáltak a C-terminális részen. Tehát mind a fág, mind a baktérium részéről a fehérjék C-terminális része fontos szerepet játszik a felismerés folyamatában (Wang et al., 1998) (Werts et al., 1994). A 16-3 fág S. meliloti kapcsolatban szintén a fehérje C-terminális része alakít ki kapcsolatot a fág és a baktérium között. Azonban a lambda fág esetében mindkét oldalról egy-egy fehérje, míg a 16-3 fág S. meliloti rendszerben legalább két fehérje vesz részt a tapadásban A h mutáns fágok baktériumhoz történő kötődésének vizsgálata A receptor-mutáns baktériumon újonnan izolált fágmutánsok (16-3 h 109 ) kötődésének megismerése céljából tervezett fágkötési tesztben a felnövesztett spontán mutáns baktériumokat ismert titerű 16-3 fág szuszpenzióval inkubáltuk, majd a sejtek lecentrifugálása után a felülúszót vad típusú KPS-t termelő (RM41) törzsön titráltuk 30

31 (4.4. fejezet). A tesztben a kontroll oldatokban nem található baktérium, így a belőlük nyert felülúszóból a fágok teljes mennyisége számolható. A baktériumokat is tartalmazó elegyben pedig a fágok egy része hozzá tud tapadni a baktériumok sejtfelszíni receptorához a fág kötődésének mértékétől függően. Így a felülúszóban csak azok a fágok találhatók, amelyek nem képesek a baktérium fágreceptorához kapcsolódni. A fág titerének nagymértékű csökkenése azt jelzi, hogy a vizsgált baktérium megkötötte a fágot. Ellenkező esetben (ha a fág képtelen a baktériumhoz kötődni), a titer nem változik jelentősen. 7. táblázat: Az izolált bakteriofágok kötődésének vizsgálata mutáns allélt tartalmazó (GH4046, GH4178, PP2511) és nem hordozó baktériumokon (RM41). A kontroll oldatok baktériumot nem tartalmaztak. Bakteriofágok Baktériumok h h 109 RM41 GH4046 kontroll RM h h 109 kontroll GH GH h h 109 kontroll GH GH h h 109 kontroll GH PP h h 109 kontroll PP

32 A 7. táblázat adatai alapján elmondható, hogy a vad típusú baktériumot (RM41) mindhárom fág körülbelül ugyanolyan mértékben (100%) képes fertőzni. A baktérium fágreceptorában nem történt változás, így a fágok felismerik azt és kromoszómájukat a baktérium genomjába tudják juttatni (profág). Különös eredményt kaptunk a fágok kötődését a GH4046 és a GH4178 baktériumon összehasonlítva. A GH4178 egy újonnan izolált mutáns, amely SDSpoliakrilamid gélelektroforézissel vizsgálva ugyanolyan KPS-t termel, mint a GH4046 (7. ábra). Az rkpm gén ugyanazon mutáns allélját hordozza, mint a GH4046 baktériumtörzs. Mégis a tesztben a fágok GH4046 és GH4178 baktériumokhoz kötődésében szignifikáns eltérés mutatkozott. Az eltérés oka feltételezéseink szerint a GH4178 baktérium kromoszómáján más régióban bekövetkezett mutáció lehet, amely erősebb kötődés létrejöttét engedélyezi. Ezt a hipotézist a GH4178 baktériummutánson végzett további kísérletekkel szeretnénk alátámasztani. 7. ábra: A mutáns baktériumok sejtfelszínén található kapszuláris poliszacharidok. Az ábrán Dr. Kerepesi Ildikó által készített SDS-poliakrilamid gél látható. Az ábra felső részén a KPS nagy molekulasúlyú, alsó részén a kis molekulasúlyú alkotója látható. A gélek felett a megfelelő mutáns törzsek számát tüntettük fel, amelyekből a KPS preparátum készült. A GH4178 baktériummal egyidőben izolált mutáns törzsön (GH4180) mindhárom fág erősebb kötődése észlelhető, mint a GH4046 vagy a GH4178 esetében, ami arra vezethető vissza, hogy az újonnan izolált baktérium eddigi mutánsokétól eltérő 32