5. Előadás Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "5. Előadás Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás"

Miklós Balla
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 5. Előadás ukleinsavak kimutatása, szekvenálás

=254-366 nm λ e =590 nm 2 2 + C25 Br - X + C3 C3

2 A nukleinsav kimutatás etidiumbromid 3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid λ g = nm λ e =590 nm C25 Br - X + C3 C3 C3 C (C3)2 + (C2)3 + (C3)2 C3 C3 X= : YY-1 X= S: TT-1 X C + 3C

3 Anthraciklin antibiotikumok daunomycin és doxorubicin Rövidítések A G C T bázis A C cukorrész foszfodiészter kötés A C G papcpg [ACG]

4 Szekvencia meghatározása 1. Fragmentálás restrikciós enzimekkel (W. Arber,. Smith, D. athans, 1978 obel-díj) baktériumokban és kékalgákban GAATTC CTTAAGC GGCC CCGG EcoRI ae III törzs E. coli Cél: feldarabolás 2. Sorrend meghatározás 2a. Kémiai módosítás/hasítás (A. Maxam, W.Gilbert, 1977) 2b. Didezoxi beépítés-enzimes módszer (F. Sanger et al., 1977)

5 éhány II-es tipusú restrikciós (endonukleáz) enzim (>2000) Bam I G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens Bst I G/GATCC Bacillus stearothermophilus1503-4r Eco RI G/AATTC Escherichia coli RY 13 Fok I GGATG 9 / CCTAC 13 / Flavobacterium okeanokoites ind II GTy/uAC aemophilus influenzae R d ind I A/AGCTT aemophilus influenzae R d pa II C/CGG aemophilus parainfluenzae Msp I C/CGG Moraxella spezies ot I GC/GGCCGC ocardia otitidiscaviarum Sac I GAGC/TC Streptomyces achromogenes Sau 3A /GATC Staphyllococcus aureus 3A Sma I CCC/GGG Serratia marcecescens Sb Xma I C/CCGGG Xanthomonas malvacearum 5'-3' irányban haladva a hasítás pontos helye: '/' jelnél

7 2a. Kémiai módosítás/hasítás (A. Maxam, W. Gilbert, 1977) 1. lépés 2. lépés ATTGACTTAGCC omogén Single-stranded DS minta előállítása Jelölés a szabad -végen 32 (*) (polinukleotid kináz, észter) *ATTGACTTAGCC 12 mer 3. lépés Kémiai hasítás G reakció A reakció + G reakció T reakció + C reakció C reakció *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATT *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATTGACTT *ATTG *ATT *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGACT *ATTGAC *ATTGA *AT *A *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGA

8 4. lépés: elektroforézis 5. lépés: autoradiográfia méret 6. lépés: szekvencia leolvasás

10 G reakció 2 C Kémiai hasítás: urinok 3C S C3 Dimetilszulfát (metilezés) 2 - Bázis (gyűrűfelnyitás) C2 - C3 + - C3 C3 C C C2 β α C iperidin (-glikozidos kötés hasítás) C2 - - Bázis (Cukor-foszfát lánc hasítás) - 2C C C - C - C + - -

11 A > G: A reakció C S Dimetilszulfát + C3 0 o C, 0,1 M Cl 2 óra (-metilezés) C -glikozidos kötés hasítás 2 - p 7 90 o C - + 3C 2 3-3C - Bázis (Cukor-foszfát lánc hasítás) C 2 C C C C

12 Kémiai hasítás: irimidinek 2 - timin 3C 2 2 hidrazin (-metilezés) - citozin 3C 4-Me-3-pirazolon 1 C Urea + 3-amino-pirazol dezoxiribozil-hidrazon - piperidin Bázis (Cukor-foszfát lánc hasítás a - végen) 2 asítás a végen

13 C + T: T reakció - C3 2 2 hidrazin - 2 C glikozidos kötés hasítás piperidin Bázis (Cukor-foszfát lánc hasítás) - - C C 2 C C C C

14 C reakció C C - - C C hidrazin 1 M acl (gátolja a timin metileződést) - C - - piperidin C C

15 élda: G hasítás után Fragmens hossz *ATTGAACTTAGCC *ATTGAACTTA AACTTAGCC *ATT AACTTA CC + + Színezékkel festett (minden csik) Autoradiográfiás módszerrel jelzett gél ( izotóp csik)

16 Maxam-Gilbert módszer - kiértékelés

17 2b. Didezoxi nuleotid beépítés enzimes módszer (F. Sanger et al., 1977)

18 2b. 1. lépés: Didezoxi nukleotid jelölése a) Radioaktív izotóp ( 32 ) B B b) Fluorofór (fluoreszcens jelölés, L. E. ood, 1986)

19 Áttekintés DS polimeráz primer ( 32 ) ddtt ddct ddgt ddat DEATURÁLÁS T C G A

20 2b. 2 A DS-polimeráz müködésének blokkolása szekvenálandó DS GAATTCGCTAATGC CTTAA primer DS polimeráz I dat, dtt, dct, dgt + didezoxi analóg (ddat) GAATTCGCTAATGC CTTAAGCGATTA + GAATTCGCTAATGC CTTAAGCGA 4 edény 4 analóg

21 2b. 3 Gélelektroforézis Leolvasás - komplement szál

TSMS (True Single Molecule Sequencing) Valódi egymolekulás szekvenálás) 5.

22 1. iroszekvenálás 2. Illumina/Solexa szekvenálás Új-generációs szekvenálás 3. SLiD (Sequencing by ligonucleotid Ligation and Detection) 4. TSMS (True Single Molecule Sequencing) Valódi egymolekulás szekvenálás) 5. SMRT (Single Molecule Real-time) Egymolekulás valósidejű szekvenálás /nanopore-sequencing/

Hasonló dokumentumok

11. Előadás. Nukleinsavak, nukleinsav analitika. Nukleotidok, koenzimek, vitaminok.

11. Előadás. Nukleinsavak, nukleinsav analitika. Nukleotidok, koenzimek, vitaminok. 11. Előadás ukleinsavak, nukleinsav analitika. ukleotidok, koenzimek, vitaminok. Történeti háttér Savas karakterű anyagok a sejtmagból 1869-71 DS a sejtmag fő komponense nuclein Friedrich Miescher (Svájc,