A szimbiotikus gümő inváziójában szerepet játszó bakteriális gének

Átírás

1 MTA DOKTORI ÉRTEKEZÉS A szimbiotikus gümő inváziójában szerepet játszó bakteriális gének Dr. Putnoky Péter Pécsi Tudományegyetem, TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék Pécs, 2003.

2 2 Családomnak és Szüleimnek a sok segítségért és támogatásért. PP dsc_komp3.doc

3 3 Tartalomjegyzék (oldal) 1. ELŐSZÓ 4 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Nitrogénkötés és szimbiózis Az endoszimbiózis kialakulása Szimbiózisban hibás baktériumok A rhizobiumgenetika eszközei Konjugáció, kromoszómatérkép Transzformáció, transzdukció, bakteriofágok A mutánsok előállítása Klóntárak, génizolálás A rhizobiumok genomja Kezdeti felismerések A rhizobium genomprojektek és eredményük A nodulációs gének A nod gének szabályozása A nod gének szerepe egy bakteriális szignál szintézisében A gümőinváziót meghatározó bakteriális gének Az exopoliszacharidok és az infekció Az exopoliszacharidok bioszintézise A kapszuláris poliszacharidok szerepe LPS mutánsok Invázió és alkalmazkodás Az invázió és a növényi védekezési mechanizmusok A nitrogénkötés génjei A nif és fix gének szerepe Az oxigénszint érzékelése: a fixlj és fixk gének Az rpon és a nifa szerepe Egyéb szimbiotikus gének Szimbiotikus gének a pillangósokban CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok Géntárak, géntárklónok izolálása Transzpozonos mutagenezis DNS-DNS hibridizáció Szubklónozás, PCR és DNS-szekvencia meghatározás A meghatározott DNS-szekvenciák főbb jellemzői és regisztrációs számai A szekvenciák számítógépes kiértékelése A nyitott leolvasási keretek igazolása: Tn10LK és TnphoA transzpozonok A kapszuláris poliszacharid és a lipopoliszacharid kimutatása Fiziológiai kísérletek, a K + - és a Na + -transzport mérése Szimbiotikus növényi tesztek EREDMÉNYEK Az rkp-1 régió a KPS-szintézishez szükséges lipidhordozó előállítását kódolja Az rkp-1 régió génfúziókkal történő analízise Az rkpabcdef gének a zsírsavszintáz doménekhez hasonló fehérjéket kódolnak Az rkpgh, rkpi és rkpj gének szerkezete Az rkp gének egy új típusú poliszacharid bioszintéziséhez szükségesek Az rkp-1 régió feltételezett szerepe a KPSbioszintézisben Az rkp-2 régió szükséges a KPS és az LPS bioszintéziséhez is A KPS-bioszintézisben szerepet játszó új géncsoportok azonosítása Az rkp-2 régió mutánsai az LPS-bioszintézisben is hibásak Az rkp-2 régió az UDP-glükuronsav-szintézisben vesz részt Az rkp-3 régió kódolja a K R 5 antigénre jellemző pszeudaminsav bioszintézisét Az rkp-3 régió számos, csak a KPS-termelésért felelős gént tartalmaz Az rkp-3 régióban kódolt fehérjék hasonlóak különböző cukor-bioszintézis enzimekhez és KPStranszportfehérjékhez Az rkp-3 régió törzsspecifikus géneket tartalmaz Az rkp gének kodonhasználata horizontális géntranszferre utal Az rkpy gén két különböző poliszacharid bioszintézisét befolyásolja Az rkpy gén egy új típusú fehérjét kódol Az rkpy mutáns által termelt poliszacharid nem prekurzora a K R 5 antigénnek Az rkpy mutánsok egy Kdo-homopolimert termelnek Az rkpr a Kdo-PS bioszintézisében vesz részt Az RkpM fehérje a 16-3 fág receptorának alkotója Spontán fágreceptorhibás baktériumtörzsek izolálása A receptormutáció az rkp-3 régión belül található Az rkp-4046 az rkpm gén mutáns allélja Az rkpm4046 allélban egy missense mutáció található A 16-3 fág h génjének szerkezete A h5 host-range mutáció aminosavcserét okoz A fágreceptor több komponensből áll Egy K + /H + antiporter szükségés a növényen belüli szaporodáshoz A fix-2 régió génjei a K-transzportban és a gümőinvázióban egyaránt fontosak A pha régió membránfehérjéket kódol A pha régió DNS-szekvenciájának elemzése A phaa gén terméke szükséges a megfelelő K + -kiáramlás biztosításához A pha gének egy K + /H + antiportert kódolnak AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE Sejtfelszíni poliszacharidok és a szimbiózis Az rkpa rkpq gének szerepe Az rkp gének eredete és szerveződése A Kdo-PS bioszintézis génjei: rkpr, rkpst, rkpy A 16-3 fágreceptor és a K R 5 antigén bioszintézise Az pha gének szerveződése és szerepe a környzethez való alkalmazkodásban IRODALOMJEGYZÉK Saját közlemények jegyzéke ( ) 49 PP.dsc_komp3.doc

4 4 1. Előszó A szimbiotikus nitrogénkötés molekuláris biológiájával diplomám megszerzése, 1981 óta foglalkozom. Kandidátusi értekezésemet amelynek fő témája a szimbiotikus lucernagümő inváziójában szerepet játszó baktériumgének azonosítása volt Kondorosi Ádám vezetésével készítettem el a Szegedi Biológiai Központ Genetikai Intézetében. A megkezdett munkát azóta is folytatom. Sikeréhez jelentős elméleti segítséget kaptam Kondorosi Ádámtól (Institute des Sciences Vegetales, CNRS, Gif-sur- Yvette, France), és sokat tanultam a szegedi "nitrogénkötő csoport" volt szeniorjaitól, Kiss György Botondtól és Bánfalvi Zsófiától is. A kísérletek elvégzésében jelentős része volt egykori kollégáimnak, diplomadolgozóimnak, akik az elmúlt években sikeresen védték meg doktori munkáikat, nagyrészt e témához kapcsolódva. Köszönet illeti ezért Erich Grosskopfot, Petrovics Györgyöt, Endre Gabriellát, Kereszt Attilát, Kiss Ernőt, Nagy Enikőt! Rajtuk kívül hálás vagyok Kiss Péter barátom és kollégám önzetlen segítségéért. Mindannyiunk nevében köszönöm Sárai Erzsébet és Liptai Zsuzsa asszisztensek sok éven át tartó, megbízható munkáját. A hosszú szegedi évek után Pécsett folytattam a munkát, a formálódó PTE TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszéken. Az itteni kutatási feltételek jobbításáért, a kezdeti nehézségek legyőzéséért köszönet illeti Gábriel Róbertet, Raskó Istvánt és Orosz Lászlót, valamint új munkatársaimat: Kerepesi Ildikót és Hoffmann Gyulát! Legújabb eredményeink nem jöhettek volna létre Orosz László és Papp Péter elméleti támogatása, Miklósvári Zoltánné, Marica és Keidl Zoltánné, Judit pontos és szorgalmas labormunkája nélkül. Lelkes diákköri munkájával a sikerhez hozzájárult Békási Krisztina, Deák Veronika, Maász Anita és Pálvölgyi Adrienn, valamint Nagy Tibor PhD hallgatóm is. Közismert, hogy ezen a szakterületen az egyéni teljesítmény egyre nehezebben mérhető. Ahogy ez az előbbiekben felsorolt nevekből is kitűnik, a sikeres munkához csapatmunka szükséges. Egy olyan csapaté, ahol az egyéni teljesítmények és ambíciók összeadódnak. Legalább ilyen nagy szerepe van a különböző módszertani arzenállal és tudásháttérrel rendelkező csoportok együttműködésének is. A mi munkánk sem lehetett volna sikeres a poliszacharidkémiában járatos Russel W. Carlson és Bradley L. Reuhs (Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, Athens, Georgia, USA) tudása és segítsége nélkül, akikkel több mint tíz éve folytatunk közös kutatásokat, valamint az iontranszportfolyamatokat vizsgáló Tatsunosuke Nakamura (Institute of Biochemistry, Chiba University, Chiba, Japan) közreműködése nélkül. Mi is a közös munka célja? Régóta ismert, hogy a rhizobium baktériumok által a pillangós virágú növényeken indukált új növényi szervben, a szimbiotikus gümőben, a baktériumok mint különleges sejtorganellumok működnek, amelyek feladata a légköri nitrogéngáz ammóniává redukálása. Ezt a vegyületet a növények nitrogénforrásként már hasznosítani tudják. A szimbiotikus gümő kialakulása és működése feltételezi a két élőlény génjeinek összehangolt működését, regulációját, ami felismerési folyamatokon, jelcseréken keresztül valósul meg. Amíg a szimbiózis indukciójáról, a kezdeti kommunikációs folyamatokról (növényi inducerek, bakteriális Nod-faktorok) viszonylag sok ismeret gyűlt össze, addig a gümőfejlődés későbbi szakaszáról, a partnerek közötti további jelcseréről, a gümősejtek invázióját lehetővé tevő bakteriális funkciókról viszonylag keveset tudunk. Még inkább igaz volt ez munkánk kezdetekor. Éppen ezért a invázióhoz szükséges bakteriális gének megismerése érdekében korábban már azonosítottunk számos infekcióban hibás (Inf - ) Sinorhizobium meliloti (régebbi nevén Rhizobium meliloti) mutánst, amelyek nem képesek bejutni a lucernagümő belsejébe. E mutánsok segítségével azonosítottunk több olyan eddig még nem ismert géncsoportot, amelyek a fertőzési folyamatban szerepet kapnak. Kimutattuk, hogy e gének egy része egy felszíni poliszacharid termelését irányítja, míg más része a ph-adaptációban játszik szerepet. Dolgozatom ezen gének szerkezetének és szerepének meghatározását kíséri végig. PP dsc_komp3.doc

5 5 2. Irodalmi áttekintés A Rhizobiaceae családba tartozó talajbaktériumok szinte mindegyike olyan különleges tulajdonságokkal rendelkezik, amelyeket nem lehet csak a baktériumgenetika eszközeivel megismerni. Ezek a baktériumfajok ugyanis képesek átprogramozni bizonyos növényi differenciálódási és anyagcserefolyamatokat, ezzel biztosítva maguknak háborítatlan életteret és tápanyagutánpótlást a gazdanövény belsejében. Az átprogramozás az Agrobacterium fajok esetében meglehetősen egyedi és "diktatórikus" módon egy bakteriális DNS-szakasznak (T-DNS) a növényi sejtmagba juttatásával veszi kezdetét. A T-DNS növényi hormonok (auxin, citokinin) és opinvegyületek bioszintézisét kódolja. Ennek következtében egyrészt a transzformált sejtek hormonegyensúlya felborul, osztódni kezdenek, és például gyökérgolyva (crown gall) alakul ki, ami a növény megbetegedésével jár. Másrészt a transzformált szövet az adott Agrobacterium fajra jellemző opinvegyületet termel, amelyet csak a fertőző baktérium képes szén- és nitrogénforrásként hasznosítani, más talajbaktériumok nem. E folyamat révén az Agrobakterium egy egyedi életteret "erőszakol ki" magának, ahol védett környezetben "testre szabott" ellátásban részesül (89). A különböző Rhizobium és a hasonló elnevezésű fajok (közös néven rhizobiumok) az előbbinél kifinomultabb módszert alkalmaznak. Az átprogramozást jelcserék sorozata határozza meg, és a folyamat eredményeként egy új növényi szerv keletkezik, a szimbiotikus gümő. Ebben az esetben mindkét fél számára hasznos az együttélés, mivel a gümő belsejébe került rhizobiumok a növénytől származó tápanyagok energiájának segítségével képesek a légköri nitrogéngázt ammóniává redukálni. Ez az összefoglaló főleg a szimbiózis kialakulását és működését befolyásoló bakteriális géneket veszi számba, és áttekinti azokat a genetikai eszközöket, amelyek az elmúlt negyed évzázadban elvezettek a nitrogénkötés génjeinek azonosításától a teljes rhizobiumgenom megismeréséig Nitrogénkötés és szimbiózis Csak a prokarióta szervezetek között vannak nitrogénkötő (diazotrof) fajok, amelyek képesek a légköri nitrogéngáz hasznosítására. Jelentős részük önállóan, a fiziológiai körülményektől függően képes a nitrogéngázt ammóniává redukálni (szabadonélő nitrogénkötők, pl. Azotobacter, Clostridium, Klebsiella fajok), mások növényekkel állnak laza kapcsolatban (asszociatív nitrogénkötők, pl. Azospirillum fajok), míg az endoszimbiotikus nitrogénkötő baktériumok (pl. a Rhizobium fajok) csak a növényi sejtek belsejébe jutva, a növénnyel együttműködve képesek a nitrogénkötésre. A növények általában a szervezetük felépítéséhez szükséges nitrogént a talajban oldott nitrogéntartalmú szervetlen ionok (NO 3 -, NH 4 + ) felvételével nyerik. Azok a magasabb rendű növények viszont, amelyek az evolúció során nitrogénkötő mikroorganizmusokkal alakítottak ki endoszimbiózist, függetleníteni tudják fejlődésüket a talaj nitrogéntartalmától. Közvetve egy kimeríthetetlen nitrogénforrás áll rendelkezésükre, a földi légkör 78%-át kitevő nitrogéngáz. A Rhizobiaceae baktériumcsalád (Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales) nitrogénkötésre képes tagjai szinte kivétel nélkül mind a Leguminosae (hüvelyesek) családjába tartozó növényfajok valamelyikével alakítanak ki endoszimbiózist (1). Érdekes módon e két család tagjain kívül alig találunk példát az ilyenfajta együttműködésre. Összefoglaló néven rhizobiumoknak hívjuk az Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Rhizobium és Sinorhizobium fajokat. A rhizobiumok kutatásának fő célja elsősorban azoknak a bakteriális géneknek a megismerése, amelyek a szimbiózis kialakulását irányítják vagy a szimbiotikus gümő anyagcseréjében játszanak jelentős szerepet. Ebből a szempontból az egyik legjobban ismert baktérium a Sinorhizobium meliloti (régebbi nevén Rhizobium meliloti), a lucerna (Medicago sativa) és még néhány más pillangós virágú növény (Medicago, Melilotus, Trigonella) szimbiotikus partnere. A továbbiakban főleg ennek a párosnak a példáján keresztül szeretném összefoglalni eddigi ismereteinket Az endoszimbiózis kialakulása A rhizobium baktériumok a nitrogénkötést a szimbiotikus gümő belsejében végzik. A szimbiotikus gümő egy új növényi szerv, amely partnerspecifikus módon csak a megfelelő baktériumfaj hatására, általában a gazdanövény gyökerén jön létre ( ábra). Feladata a nitrogéngáz ammóniává redukálása és az így nyert nitrogén bekapcsolása a növényi anyagcserébe. A szimbiózis kialakulásának mikroszkóposan megfigyelhető első jele a baktériumok specifikus kötődése a gyökérszőrsejtekhez. A rhizobiumok többsége a gyökérszőrökön keresztül jut be a növény belsejébe. A fertőzési folyamat csak a gyökérszőrök néhány százalékánál sikeres. Kimenetelét befolyásolja a növény fiziológiai állapota, a szomszédos fertőzési helyek távolsága. A baktériumok megtapadása után a gyökérszőrsejt növekedése áthelyeződik a csúcsról a baktériumokkal szembeni oldalra és jellegzetesen meggörbül. A fertőzési ponton a régi sejtfal leépül, és az újonnan lerakódó belső sejtfal folyamatos növekedése révén kialakul egy csőszerű képlet, az infekciós fonal ( ábra). Ezen keresztül jutnak be a baktériumok a gyökérszőrsejt belsejébe, később pedig a növekedő és elágazódó infekciós fonalon keresztül fertőzik meg a gümősejteket. Néhány pillangósnál a fertőzés kevésbé specifikus módon, az oldalgyökér-kiágazódásoknál található nyílásokon keresztül megy végbe (155). A fertőzési ponttól sok sejtrétegnyi távolságra, a gyökér belső kéregsejtjei között dedifferenciáció, mitózis figyelhető meg (gümőprimordium). Egy új osztódó szövet keletkezik, a gümőmerisztéma ( ábra). A fertőzés után néhány nappal a gyökér felszínén már mikroszkóppal látható kidudorodás jelenik meg, és ennek merisztematikus zónájában sokszorosan elágazódó infekciós fonalak figyelhetők meg. Később a legtöbb proximális merisztémasejtben infekciós fonal végződik, és ezeket a sejteket elözönlik a baktériumok (59). A merisztéma mitotikus aktivitása több hétig megmarad. A gümő kéregrészében a merisztémától a legközelebbi gyökéredénynyalábig szállítónyalábok húzódnak. Rajtuk keresztül jutnak a gümőbe a különböző fotoszintátok, és kerül a növény többi részébe a kötött nitrogén aminosavak formájában. A gümő jellegzetes szövettani zónákkal rendelkezik: gümőmerisztéma, korai és késői szimbiotikus zóna, valamint öregedési zóna. Többféle gümőtípust is PP.dsc_komp3.doc

6 6 ismerünk, amelyek között a különbség a fertőzés stratégiájában, a morfológiai felépítésben és a merisztematikus aktivitásban van (155, 230). A fent leírtak leginkább az ún. indeterminált gümő kialakulására és felépítésére vonatkoznak, ahol a gümőmerisztéma hosszabb ideig, folyamatosan működik. A másik jellegzetes forma a determinált gümő, ahol a merisztéma viszonylag rövid ideig aktív. A mai fő kutatási erővonalak e két gümőtípust létrehozó pillangós rhizobium kapcsolat mentén szerveződnek (41, 222). Az egyik modellnövény, a Lotus japonicus determinált, míg a Medicago truncatula indeterminált gümőt hoz létre ábra: A szimbiotikus gümő kialakulása és szövettani felépítése Bal oldal: A gyökér keresztmetszetén látszik az infekciós fonal (IF) behatolása egy meggörbült gyökérszőrsejten (IRH) keresztül a külső kéregsejtekbe (OC). A gümőprimordium (NP) a belső kéregsejtek egy csoportjából alakul ki, amelyek visszanyerik osztódóképességüket. PCC: periciklus (perikambium) sejtek. Jobb oldal: A kialakult gümő hosszmetszetén megfigyelhető a gümőmerisztéma (NM) és a nitrogénkötő bakteroidokkal teli központi szövet (CT), amelyet baktériumokkal nem fertőzőtt perifériás szövet (PT) vesz körül. A baktériumok a gümősejtekbe endocitózis segítségével kerülnek be. Az infekciós fonal sejtfal nélküli végénél a növényi sejtmembrán befűződései egy vagy több baktériumot magában foglaló vezikulummá alakulnak. A sejt belsejébe került baktériumok amelyek tehát egy külön membránnal (peribakteroid membrán, PBM) vannak körülvéve általában képesek még néhányszor osztódni. Később fiziológiai, morfológiai változásokon mennek keresztül és ún. bakteroidokká alakulnak. A bakteroidot akár egy időleges sejtorganellumnak is tekinthetjük, amelyet a növény akkor importál a környezetből, ha a felhasználható nitrogénvegyületeknek szűkében van. A PBM kialakulását mindkét partner befolyásolja. Rajta keresztül nagyarányú anyagtranszport zajlik, sajátos transzportfehérjéket tartalmaz. A fertőzött sejtek szer nagyobb membránfelülettel rendelkeznek mint a fertőzetlenek. Intenzív fehérjeszintézis és anyagcsere folyik bennük. A legnagyobb mennyiségben előforduló növényi szimbiotikus fehérje a leghemoglobin. Ez az oxigén megkötése révén egyrészt biztosítja a megfelelő oxigénszegény (mikroaerob) környezetet az oxigénre érzékeny bakteriális nitrogenáz enzim működéséhez, másrészt az oxigénutánpótlást szállítja a bakteroidban zajló fokozott respirációhoz (7). Így a gümő belsejében a szabad oxigén koncentrációja akár százezred része is lehet (3-30 nm) a szokásos módon növesztett baktériumkultúrában található mennyiségnek (kb. 250 mm) Szimbiózisban hibás baktériumok Egy differenciálódási folyamat megismerésének igen fontos megközelítési lehetőségét nyújtja a "genetikai boncolás", a folyamatban hibás mutánsok előállítása és elemzése. A gümő morfológiáját és kialakulásának egyes lépéseit ismerni kell ahhoz, hogy a szimbiózisban hibás mutánsokat jellemezni tudjuk, és segítségükkel azonosíthassuk a megfelelő géneket. A szigorú gazdaspecifitás, a teljesen új növényi szerv morfogenezise, a baktérium-bakteroid átalakulás mind arra utalnak, hogy a szimbiózis kialakulásához jelentős számú növényi és bakteriális gén összehangolt működése szükséges. Soklépcsős szabályozásnak kell érvényesülnie nemcsak az egyedeken belül, hanem a partnerek között is. Ez pedig kommunikácós folyamatokat igényel növény és baktérium között. Ahhoz, hogy mindezeket a gének szintjén lehessen tanulmányozni, hatékony génátviteli rendszerekre és szimbiózisban hibás mutánsokra van szükség mindkét partner esetében (33, 231). A fenotípus alapján a baktériummutánsokat két csoportba sorolhatjuk. A Nod - mutánsok képtelenek létrehozni a gümőt, mert valamelyik gömőképzési vagyis nodulációs (nod) génben hibásak. A többi szimbiotikus gén működésének hiánya esetén a gümő kifejlődik, de nem funkcióképes (Fix - gümő), ezért az érintett géneket első megközelítésben fixációs (fix) géneknek nevezték el. Ez azonban túl általános meghatározás. A nod géneken kívül még számos gén felelős a szimbiózis kialakulásáért; ezeket két, egymástól alapvetően eltérő csoportba különíthetjük el. A gümőfejlődési gének hibája esetén a baktérium nem képes a kialakult gümő inváziójára (Inf - fenotípus, lásd később ndv, exo, rkp gének). A mutáns baktériumokkal való fertőzés következtében csak ún. "üres" gümők jönnek létre, infekciós fonalak és bakteroidok nélkül. Ezzel szemben a bakteroidok már megtalálhatók a gümőkben, ha a baktériumban keletkezett mutáció a nitrogénkötéshez vagy a gümőanyagcseréhez szükséges valamelyik gént érinti (lásd később: nif, fix, dct, cyc gének). Mára már olyan sok nod, illetve fix gén vált ismertté, hogy új rövidítéseket is be kellett vezetni. Ezek egy része pontosabban jelzi az adott gén szerepét is ( fejezet). A szimbiotikus baktériummutánsok izolálásának, a gének megismerésének előfeltétele, hogy megfelelő genetikai eszközrendszer álljon rendelkezésünkre. A következőkben ennek kidolgozásáról lesz szó A rhizobiumgenetika eszközei Konjugáció, kromoszómatérkép A rhizobiumgenetika a hetvenes években indult jelentős fejlődésnek, de a mai napig a génbevitel egyetlen, széles körben használatos útja a konjugáció. Ezért a géntárak készítéséhez, komplementációs kísérletekhez vagy bármiféle génsebészeti munka végén széles gazdaspecifitású, konjugatív vektorokat alkalmaznak. Az előállított klónokat előbb E. coli sejtekbe transzformálják, majd konjugáció segítségével juttatják be a különböző rhizobiumokba (21, 143). A genetikai információ átviteli módszerek közül a konjugáció a leginkább alkalmas nagyobb genomrészek transzferére, így a nagy távolságokat áthidaló és kevés markert tartalmazó kezdeti kromoszómatérképek megszerkesztésére. Mivel a különböző rhizobiumokban megfelelő konjugatív plazmidot nem találtak, ezért a Pseudomonas törzsekből származó, széles gazdaspecifitású, PP dsc_komp3.doc

7 7 a P-inkompatibilitási csoportba tartozó, ún. R-plazmidoknak és származékaiknak a használata terjedt el (RP4, R68.45). A térképezéshez kifejlesztett plazmidok közel random módon képesek különböző pontokon elindítani a kromoszóma transzferét, ezért a markerek közötti távolságokat a kapcsoltsági adatokból (kotranszfer) kapjuk meg. Nincs "perctérképezésre" lehetőség, mint az E. coli esetében. Mivel két pont kapcsoltsági értéke fordítottan arányos a köztük lévő fizikai távolsággal, ezért a kísérleti értékeket egy empirikus képlet segítségével additívvá kell tenni. Ezzel nagyjából megbízható és egymással összehasonlítható távolságértékeket kapunk (23, 126). A nyolcvanas évek elejére több rhizobiumnak is elkészült a cirkuláris kromoszómatérképe, amelyeket viszonylag kisszámú marker segítségével szerkesztettek meg (22, 126, 150). Ez a munka lényegében be is fejeződött, hiszen a térképezés elsődleges célja a szimbiózissal kapcsolatos gének elhelyezkedésének megismerése volt. A létrehozott tájékozódási rendszer pedig ehhez már megfelelő alapot biztosított. Annál is inkább, mivel az eredményekből kiderült, hogy sok rhizobiumnál a szimbiotikus gének jó része nem térképezhető a kromoszómára (21), hanem egy nagyméretű plazmidon helyezkedik el (lásd 2.3.) Transzformáció, transzdukció, bakteriofágok A transzformáció jelenségét a rhizobiumoknál is leírták, de hagyományos módszerrel legfeljebb néhány tucat transzformánst kaphatunk egy mikrogram plazmid DNS használata esetén (124). Elektroporáció segítségével feltehetően ennél nagyságrendekkel jobb eredmény érhető el, de a módszert eddig csak B. japonicum esetén (10 7 transzformáns/ µg DNS) írták le (103). A rhizobiumok számos bakteriofágja ismert. Ezek közül többel végeztek sikeresen speciális vagy általános transzdukciót (74, 215, 224). A legtöbb eredmény az S. meliloti törzsek fágjaival született. Ezek közül is kiemelkedik a 16-3 fág (225), amely az egyetlen részletesen tanulmányozott rhizobium fág. A 16-3 bateriofág az S. meliloti 41-es törzs temperált fágja, amely alakjában és több molekuláris sajátságában is emlékeztet a lambda fágra. Ismert részletes genetikai-fizikai térképe (56, 58, 162, 163), és több fontos gén, illetve lokusz molekuláris biológiai elemzése is megtörtént. Ezek közé tartoznak a fő represszort kódoló c gén (43, 44), a helyspecifikus rekombinációban szerepet játszó int és xis gének (212) és az immx régió (42). A lizogén állapot létrejöttében, a fág DNS integrációjában szerepet játszó attp (56, 57) és attb (164) régiókat is azonosították. A fág int génjét és attp régióját hordozó vektor kifejlesztésével (67) lehetővé vált bármely gén célzott, egy kópiás beépítése a baktériumkromoszóma attb helyén. Egy ún. "host range" mutáció izolálása és térképezése (162) pedig lehetőséget adott a fágreceptor azonosítására és a baktérium fág felismerési folyamat tanulmányozására (5.5. fejezet). Az egyetlen fágfertőzésen alapuló rendszer, amely alkalmas kozmid vektorok bejuttatására, az E. coli lambda fág rendszer elemeinek felhasználásával készült. Ebben az esetben a rhizobiumba bevitt, és ott megnyilvánuló lambdareceptorgén (malb) biztosítja, hogy a lambda fágrészecskékbe csomagolt DNS bejuthasson a receptort tartalmazó sejtekbe. Ezzel a módszerrel elvben egy kozmid géntár az E. coli transzfekció kikerülésével direkt bevihető a különböző mutáns rhizobiumokba, és kiválasztható a komplementáló klón. A módszer, minden előnye ellenére, mégis kuriózum maradt (146) A mutánsok előállítása A különböző mutánsok előállításában a hagyományos kémiai mutagéneket (NTG, salétromossav, bázisanalógok) gyorsan háttérbe szorították a transzpozonok. Sikerük annak köszönhető, hogy viszonylag véletlenszerűen képesek beépülni a genom bármely pontjára, és jelenlétükkel nemcsak elrontják az érintett gént, hanem az általuk hordozott antibiotikumrezisztencia révén meg is jelölik azt. Ráadásul egy transzpozon elég nagy ahhoz, hogy jelenléte és pontos helyzete egy adott DNS-szakaszon molekuláris biológiai módszerekkel is (fizikai térképezés, hibridizáció) könnyen meghatározható legyen. Ez pedig lehetőséget ad a mutációt szenvedett gén egyszerűbb izolálására. A transzpozonok alkalmazása különösen azoknál a géneknél könnyíti meg a genetikai munkát, amelyeknél a mutáció nem jár közvetlenül észlelhető fenotípussal. Ilyen a szimbiotikus gének nagy része is, hiszen csak a gazdanövény segítségével vizsgálható a mutáció következménye. A random transzpozíciós mutagenezis elvégzésére több rendszert is kifejlesztettek (217), amelyeknél a transzpozonforrás konjugációval juttatható be a rhizobiumsejtbe, de ott replikálódni nem képes ("suicide vector"). A transzpozon rezisztenciamarkerére szelektálva így ki tudjuk válogatni azokat a sejteket, amelyekben a transzpozon áthelyeződött a rhizobiumgenom valamely pontjára ( gyakorisággal), és feltehetően mutációt okozott. A transzpozont hordozó utódok között pedig nagyságrendekkel könnyebb egy adott mutánst kikeresni, mint a teljes mutagenizált populációban. A rhizobiumgenetikában a legkedveltebb transzpozon a Tn5, amely 5,8 kb nagyságú és kanamicin, bleomicin, valamint streptomicin rezisztenciagéneket hordoz. Rhizobiumban az első transzpozíciós eseményt követően nem mozog tovább, tehát stabil mutációt hoz létre. Ráadásul ez a mutáció általában poláris hatású, azaz egy többcisztronos transzkripciós egységbe beépülve megakadályozza az inszerció által nem érintett, de a promoter régiótól az inszerció miatt távol kerülő gének transzkripcióját (20). Az eredeti transzpozonnak számos változata használatos, amelyek eltérő antibiotikumrezisztenciát vagy különböző riportergéneket tartalmaznak ( táblázat). A Tn5-mob az RP4 plazmid mob régióját hordozza, amely a beépülés helyétől kiinduló DNS-transzfert segíti elő. Transzpozonok segítségével az irányított mutagenezis is megvalósítható, amely nagyon hasznos eljárás egy klónozott régió genetikai térképének elkészítésekor (48, 201). A kérdéses rhizobium DNS-szakasz (pl. egy kozmid klón) E. coli sejtekben történt random mutagenezise után a véletlenszerűen beépült transzpozonok pontos helye fizikai térképezéssel meghatározható. A kiválasztott mutációk konjugációval bejuttathatóak a rhizobiumsejtekbe. Ezt követően egy plazmidinkompatibilitáson alapuló szelekciós rendszer segítségével ki tudjuk válogatni azokat a baktériumokat, amelyekben a mutáció homológ rekombináció révén beépült a genom megfelelő pontjára, a vad típusú gént hordozó plazmid pedig elveszett. Az ismert helyzetű mutációk fenotípusának megállapítása után megkapjuk a mutagenizált régió genetikai térképét, amelyet rá tudunk helyezni a régió fizikai térképére. Az inszerció környékének pontos nukleotidsorrendje is meghatározható, a Tn5 végéhez tervezett szekvenáló primer segítségével. PP.dsc_komp3.doc

8 táblázat: A Tn5 transzpozon és néhány származéka transzpozon méret (kb) marker* ref.* Tn5 5,8 Km, Ble, Sm (20) Tn5lac 12,0 lacz (tkr), Km, Ble, Sm (134) Tn5phoA 7,8 phoa (tlc), Km, Ble, (147) Sm Tn5-GmSpSm 6,7 Gm, Sp, Sm (106) Tn5-Lux 6,6 luxab (tkr), Km (25) Tn5tac1 4,6 p tac, Km, laci q (37) Tn5-mob 7,8 mob, Km (218) Tn5-lacZ 8,2 lacz (tkr / tlc), Km (218) Tn5-luc 7,2 luc (tkr / tlc), Km (218) Tn5-Gm 8,2 Gm (218) Tn5-Tc 8,2 Tc (218) Tn5-gusA 8,1 gusa (tkr), Km (214) *rövidítések: Ble: bleomicin, Gm: gentamicin, Km: kanamicin, Sm: streptomicin, Sp: spektinomicin, Su: szulfonamid, Tc: tetraciklin, (tkr): transzkripciós fúzió, (tlc): transzlációs fúzió, ref.: referencia Klóntárak, génizolálás Az előzőekből látható, hogy nincs olyan általánosan használható módszer, amely alkalmas lenne tisztított DNSmolekulák közvetlen és hatékony bejuttatására a rhizobiumokba. Éppen ezért a genomot reprezentáló génkönyvtárakat is először E. coli sejtekbe kell bevinni in vitro pakolás, esetleg transzformáció segítségével. Olyan vektort célszerű alkalmazni, amely konjugáció révén átjuttatható rhizobiumba, így nemcsak a hibridizáció, hanem a genetikai komplementáció is használható módszer a különböző gének izolálására ( táblázat). Az egyik ismertebb első vektor az RK2 plazmidból készült plafr1, amely tetraciklinrezisztenciát, a lambda fág cos régióját, a mobilizáláshoz szükséges orit régiót és egy egyedi EcoRI helyet hordoz. Viszonylag nagyméretű (21,6 kb), de még így is kb idegen DNS építhető bele, hogy elérje az in vitro pakoláshoz szükséges nagyságot. Mivel nem hordozza a konjugációhoz szükséges összes gént, ezért a mobilizálásához egy további, ún. "helper" plazmidra vagy egy speciális E. coli törzsre van szükség, amely tartalmazza a transzferhez hiányzó géneket. A plafr1 vektorban EcoRI részleges emésztés segítségével elkészült génkönyvtárnak legalább 2000 egyedi klónt kell tartalmaznia, hogy megfelelően reprezentálja a rhizobium genomot (81). A különböző gének izolálására az esetleg elérhető heterológ próbák vagy a PCR alkalmazásán kívül csak a megfelelő mutánsok révén van lehetőség. A transzpozonnal előállított mutánsok esetén hibridizáció segítségével is azonosíthatjuk a keresett gént, miután bizonyítottuk, hogy a mutációt a transzpozon beépülése okozta, és a mutáns baktériumból klónoztuk a transzpozon beépülésének környezetét. Sokszor azonban az egyetlen járható út a genetikai komplementáció. Ilyenkor a mutáns baktériumba konjugációval bejuttatva a teljes géntárat, kikeressük a vad fenotípusú (komplementált) egyedeket valamilyen szelekció vagy teszt segítségével, majd izoláljuk belőlük a vad típusú gént hordozó kozmid klónt táblázat: Széles gazdaspecifitású konjugatív vektorok vektor 1 marker méret cos 3 inc 2 ( kb ) site klónozóhely 4 ref. 5 prk290 incp Tc 20,0 nincs EcoRI, BglII (53) plafr1 incp Tc 21,6 van EcoRI (81) pgs72 incp Tc, Km 13,0 van EcoRI, XhoI, HindIII (Km), SalI (Tc) (211) psf6 incw Sp, Sm 11,1 van HindIII, EcoRI, SalI, BamHI, PstI, (210) XbaI pkt230 incq Km, Sm 11,9 nincs XhoI, XmaI (Km), HindIII, BamHI (9) (Km) EcoRI SstI (Sm) pkt247 incq Ap, Su, Sm 11,5 van EcoRI, SstI (Sm) (9) pvk102 incp Tc, Km 23,0 van HindIII, XhoI, SalI (Tc) (125) pbbr1mcs (?) Cm, lacza 4,7 nincs sokféle (131, 132) 1: A felsorolt vektorok a prk2013 plazmiddal mobilizálhatók triparentális keresztezésben (53). 2: inkompatibilitási csoport; 3: tartalmazza a lambda fág cos régióját; 4: zárójelben a klónozóhelyeket tartalmazó rezisztenciagén; 5: referencia, (?) nem meghatározott, kompatibilis az incp, incq és incw plazmidokkal; Ap: ampicillin, Cm: kloramfenikol, Km: kanamicin, Sm: streptomicin, Sp: spektinomicin, Su: szulfonamid, Tc: tetraciklin rezisztenciagének. A szimbiotikus gének esetében ez sokszor munkaigényes feladat, hiszen a mutáns, illetve a vad fenotípus is csak növényi teszt segítségével állapítható meg. Ráadásul a legtöbb esetben a komplementáló klónt tartalmazó, vad fenotípusú baktériumok nem élveznek előnyt a mutánsokkal szemben, ezért a jelen lévő többség fenotípusa érvényesül. Ezekben az esetekben a géntárat olyan kisebb csoportokban kell a mutánsba bejuttatni, amelyekben még észrevehető a vad fenotípus jelenléte. A létrehozott csoportokat növényi teszt segítségével különkülön kell ellenőrizni a komplementáló klón jelenlétére (179). Több fix gént csak ezzel a módszerrel sikerült izolálni. A nod gének esetében azonban a növényi teszt kiváló szelekciós rendszer, hiszen csak a komplementáló PP dsc_komp3.doc

9 9 klónt hordozó baktériumok tudnak gümőt képezni, és túlnyomó többségükben ezek is izolálhatók vissza a gümőkből (144) A rhizobiumok genomja Ma már csupán néhány hónap és sok-sok pénz kérdése, hogy egy baktériumfaj teljes genomjának DNSszekvenciáját meghatározzák. Néhány éve már a rhizobiumok megismerését is segítik a genomprojektek. Genetikai eszköztár és kísérletek nélkül azonban egy csupasz szekvenciát még ma sem lehet teljes egészében értelmezni, funkcionálisan megismerni, csupán elolvasni Kezdeti felismerések A hetvenes évek végén több rhizobiumnak is elkészítették a kör alakú kromoszómatérképét (22). Az auxotrófia- és rezisztenciamarkerek mellett már néhány szimbiotikus gén kromoszomális helyzetét is meghatározták. Az R. leguminosarum és S. meliloti kromoszómatérképeit összehasonlítva megállapították, hogy a gének elrendeződése sok hasonlóságot mutat. Ennek ellenére a két faj között rekombináció alig mutatható ki. Ezzel szemben az R. leguminosarum, R. trifolii és R. phaseoli közötti átvitelnél sok esetben hasonlóan magas számú rekombináns nyerhető, mint az R. leguminosarum különböző törzsei közötti keresztezéseknél. Ez is arra utalt, hogy e három baktérium szoros taxonómiai kapcsolatban áll egymással. Ma már egy faj különböző variánsaiként tartjuk számon őket (R. leguminosarum biovar viciae / bv. trifolii / bv. phaseoli), amelyek eltérő gazdanövényekkel hoznak létre szimbiózist. A Rhizobium fajoknál sok szimbiózist érintő mutációt nem lehetett a kromoszómatérképen elhelyezni. Kiderült, hogy a rhizobiumgenom egyik meglepő sajátsága az, hogy nagyon sok fajban (Azorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium) több, egyenként a 100 kb méretet is meghaladó nagy plazmid található (174). Már a hetvenes években számos genetikai adat utalt arra, hogy a különböző törzsekben a nod és fix gének legalább egy része extrakromoszomálisan helyezkedik el. Például az, hogy plazmideliminálási módszerekkel Nod -, illetve Fix - mutánsokat lehetett izolálni (244), vagy az, hogy a különböző Rhizobium fajok egyes plazmidjait tartalmazó A. tumefaciens transzkonjugánsok képessé váltak a gümő fejlődését elindítani a megfelelő gazdanövényen (109, 127). A szabadonélő nitrogénkötő Klebsiella pneumoniae baktérium nif génjeivel homológ szekvenciákat szintén sikerült ezeken a plazmidokon kimutatni. Később az is kiderült, hogy a különböző nod gének a nif régióhoz nagyon közel helyezkednek el és, hogy a szimbiotikus gének ilyen csoportosulása általános jelenség (12, 160, 196). A kezdeti becslések szerint is világos volt, hogy a rhizobiumok sokkal nagyobb genommal rendelkeznek mint az E. coli. A fizikai térképek alapján a B. japonicum genomot 8,7 Mb, míg az S. meliloti genomot 6,5 Mb nagyságúra becsülték (107). Az első megismert szekvenciákból is látszott, hogy a rhizobiumgenom általában GC-gazdag, és a kódoló szakaszokon erős kodonpreferencia figyelhető meg, vagyis lényeges eltérések vannak az egyes aminosavakat jelentő alternatív kodonok előfordulási gyakoriságában. Az ismert géneket analizálva a szimbiotikus nod, nif és fix gének esetében viszonylagos AT-gazdagság figyelhető meg a kodonok harmadik pozíciójában, ezért viszonylag korán megszületett az az elmélet, hogy a szimbiotikus gének más baktériumból származnak, és kezdetben nem voltak szoros evolúciós kapcsolatban az "ősi" rhizobiumgenommal (lásd ). A nod, nif és a fix gének egy része az S. meliloti baktériumban is egy igen nagy molekulatömegű, ún. megaplazmidon (psyma) helyezkedik el ( ábra). A plazmid nagyságát elektroforetikus mobilitása alapján még megbecsülni is nehéz volt. Elektronmikroszkópos mérésekkel a hosszát 1,2 Mb-ban határozták meg (30, 31). A későbbi fizikai térképezés alapján ez 1,4 Mb-ra módosult, ami igen tekintélyes méret, hiszen az E. coli kromoszómának durván a harmada. Ráadásul kiderült, hogy az S. meliloti törzsek nem is egy, hanem két hasonló méretű megaplazmidot hordoznak (11). A másik (prme41c vagy későbbi nevén psymb) 1,7 Mb nagyságú (107). Ezen is találhatók szimbiózisban fontos gének, mint az exopoliszacharid-bioszintézist irányító exo, a dikarbonsavtranszportért felelős dct gének vagy a thiaminbioszintézisben szerepet játszó thi gének (lásd később) ábra: A nod, nif és fix gének elrendeződése az S. meliloti 41 psyma megaplazmidján. Fekete nyilak: közös nod gének; vonalazott és szürke nyilak: regulátorgének. A fekete háromszögek a nod "boxok" elhelyezkedését és irányát jelzik. A rhizobiumgenom aktív részét képezik a különböző inszerciós (IS) szekvenciák is. Ezek 1-3 kb nagyságúak, kópiaszámuk 2 és 12 között változik és mozgásukat több esetben megfigyelték. Az adatokból úgy tűnik, hogy több IS elem is "előszeretettel" ugrik a nif régióba (61, 202). Nemcsak az IS elemek fordulnak elő több példányban, hanem szimbiotikus gének vagy egész géncsoportok is. Ez PP.dsc_komp3.doc

10 10 természetesen jócskán megnehezíti a mutánsok révén való azonosításukat. Az R. l. bv. phaseoli esetében például a nif gének ismétlődnek többször a szimbiotikus plazmidon, az S. meliloti többször tartalmazza a fixknoqp régiót (186), illetve egyes fajok esetében a nodd génnek is több funkcióképes példánya van jelen (96, 97). Becslések szerint akár 200-féle, átlagosan 3,5 kb hosszú, kis példányszámú, ismétlődő szekvencia is előfordulhat a rhizobiumgenomban (149). Ez szokatlan jelenség más baktériumoknál. A nyolcvanas évektől kezdve rohamosan nőtt a megismert szimbiotikus gének száma. Különösen sokat tudtunk meg a gümőindukció bakteriális oldaláról és a nitrogénkötést irányító nif és fix gének szabályozásáról. De a "szimbiotikus genom" egyéb elemei, mint a különböző felületi poliszacharidok szintézisét irányító, a gümő bakteriális inváziójában szerepet játszó gének szintén nagy számban váltak ismertté ( fejezetek). A genom teljes feltérképezése a szekvenálás automatizálásának és a számítástechnika, bioinformatika exponenciális fejlődésének köszönhetően a kilencvenes évek közepétől vált lehetővé A rhizobium genomprojektek és eredményük 1997-ben közölték az első, szekvenciaszinten megismert rhizobium replikon szekvenciájának elemzését. Ez a Rhizobium NGR234 törzs 536 kb nagyságú szimbiotikus plazmidja (pngr234a) volt, amelyen 416 nyitott leolvasási keretet (potenciális gént) azonosítottak (80) ben vált ismertté az M. loti (114), 2001-ben az S. meliloti (88) és 2002-ben a B. japonicum (115) genom teljes szekvenciája. De megkezdték az R. etli és az R. leguminosarum bv. viciae genom szekvenciájának meghatározását is. A befejezett és folyamatban lévő bakteriális genomprojektekről a National Center for Biotechnology Information (Bethesda, Maryland, USA) honlapján naprakész adatok találhatók (154). Az S. meliloti 1021 törzsnek 6,7 Mb (6,7x10 6 bázispár) nagyságú genomja van (13, 34, 73, 88). A szokásos adatbázisokon (GenBank, EMBL) kívül a teljes szekvencia egy, erre a célra létrehozott honlapon is elérhető és elemezhető (203). Ahogy azt már a korábbi eredmények is jelezték, az S. meliloti genom, a 3,4 Mb nagyságú kromoszóma mellett, a nod és nif géneket hordozó psyma megaplazmidból (1,35 Mb) és a pexo-nak is nevezett, sok poliszacharidbioszintézis gént tartalmazó psymb megaplazmidból (1,68 Mb) áll ( táblázat). Az eddig megismertek között ez az egyik legnagyobb bakteriális genom, amely 6204 feltételezett fehérjekódoló gént tartalmaz. Ezek 60%-a ismert, vagy a számítógépes elemzések alapján jó közelítéssel prediktálható funkcióval rendelkezik, és csaknem 40% azoknak a feltételezett géneknek az aránya, amelyekhez bioinformatikai eszközökkel nem lehetett funkciót rendelni. Ezek között 8% semmilyen ismert fehérjével sem tartalmaz még csak részleges hasonlóságot sem. Ez utóbbi, teljesen ismeretlen funkciójú gének aránya a két megaplazmidon jóval magasabb, mint a kromoszómán ( táblázat). Egy kisszámú, főleg szimbiotikus funkciójú szekvenciától eltekintve a genomban nincs sok "új keletű" ismétlődés, viszont számos "rég történt" duplikáció nyomát hordozza. A gének 42 %-a (2589) besorolható az 548 paralóg géncsalád valamelyikébe. A paralógok kialakulása az evolúció során új alkalmazkodási funkciók kifejlődését segíthette elő. Eredetük közös, de funkciójuk már eltérő. Ezt jól tükrözi a transzportfolyamatokban szerepet játszó és a szabályozófunkcióval rendelkező gének nagy száma ( táblázat). A genom fejlődésében jelentős szerepet játszó inszerciós szekvenciák (IS) és fág-szekvenciák eltérő arányban vannak jelen az egyes replikonokon. A psyma plazmidon különösen a szimbiotikus gének környezetében magasabb a számuk, ami arra utal, hogy a szimbiotikus régiók szerveződésében jelentős a szerepük. Összesen 21- féle IS elemet sikerült a genomban azonosítani, amelyek közül néhány replikonspecifikus előfordulást mutat. A három replikon viszonylag új keletű együttlétére utalnak a GC-tartalom különbségei is. Legkésőbb talán az alacsonyabb GC-tartalommal és eltérő kodonhasználattal rendelkező psyma került a genomba, amely alig tartalmaz intergenikus mozaik elemeket (RIMEs) és A,B,C palindrom elemeket ( táblázat) táblázat: Az S. meliloti 1021 genom jellemzői (88) jelleg kromoszóma psyma psymb hosszúság (bp) G+C arány 62,7% 60,4% 62,4% fehérjekódoló régió 85,8% 83,2% 88,6% trns tmrns (1) rrns operon proteinkódoló gén átlagos proteinkódoló régió (bp) gén feltételezett funkcióval % 56,5% 64,4% teljesen ismeretlen 5% 11,5% 12,3% gén (2) regulátorgén (2) 7,2% 10,4% 10,5% LysR család (2,3) 0,9% 2,9% 1,2% ABCtranszporter 2,9% 3,3% 4,9% inszerciós elem és fágszekvencia RIME elemek 2,2% 3,6% 0,9% A, B, C palindrom szekvenciák (5) (1) tmrns: trns és mrns is található egy átírt RNS molekulán belül, (2) az összes fehérjekódoló régió százalékában, (3) LysR regulátorfehérjék lásd: (4) ABC-transzporter: ATP-kötő doménnel rendelkező alegységet is tartalmazó rendszerek, változatos transzportfunkcióval (ionok, aminosavak, peptidek, cukrok, poliszacharidok...), (5) a replikonméret százalékában. PP dsc_komp3.doc

11 11 Amióta ismert a megaplazmidok mérete, azóta kérdés, hogy valóban plazmidnak tekinthetők-e, vagy inkább igaz az, hogy az S. meliloti három kromoszómával rendelkezik. A két megaplazmid több tulajdonságában is hasonlít a pngr234a szimbiotikus plazmidra vagy az agrobaktériumok Ti és Ri plazmidjaira, mivel a replikációs kezdőpont mellett a repabc gének homológjai is azonosíthatók rajtuk. A psyma tartalmazza a plazmid transzfert irányító, feltételezett traacdg és orit szekvenciákat is, de nem találhatók meg rajta a trairmbf és a trbdjklfh homológok, amelyeket más rhizobium plazmidokon már azonosítottak. Kísérletek szükségesek annak eldöntésére, hogy ez a plazmid képes-e önállóan bármilyen recipiens sejtbe átjutni (13), de a szekvencia elemzéséből megállapítható, hogy a psyma inkább egy plazmidra hasonlít. A psymb csak az orit és a traa gének homológjait tartalmazza, és a másik megaplazmiddal ellentétben, alapvető háztartási géneket is hordoz: egy arginin trns gént ( Arg trna CCG ), a sejtosztódáshoz szükséges mincde gének homológjait, illetve asparagin bioszintézis (asnb, asno) géneket (73). A psymb replikonon elhelyezkedő thicosge és thid génekről már korábban is ismert volt, hogy hibájuk thiaminauxotrófiát okoz, ezért valóban esszenciálisak (75). Tehát a psymb biztosan hordoz kromoszomális bélyegeket is. Mindent összevetve az S. meliloti kromoszóma egy tipikus aerob, heterotróf baktérium jellegzetes génjeit hordozza, amely a psymb megaplazmid genetikai anyagával jócskán bővítette metabolikus kapacitását és a környezethez való alkalmazkodóképességét. Ez a talajban vagy a rhizoszférában nagy előnyt jelenthet. Jellegzetes módon a psymb kódoló kapacitásának 12%-át poliszacharid-bioszintézisben részt vevő gének és további 17%-át transzportfehérjéket kódoló gének alkotják (73). A psyma integrálódhatott utolsóként a genomba, amely a nodulációs képességet és a gümőben lévő alacsony oxigénkoncentrációhoz való alkalmazkodás funkcióit is kódolja. Ezen a replikonon a nitrogénvegyületek metabolizmusa, többek között a dinitrogén redukciójának képessége is kódolt (13). Mindezekről a következő fejezetek részletesen szólnak A nod gének szabályozása A növények meglepően sokféle szerves molekulát bocsájtanak ki a rhizoszférába nagy mennyiségben, ami akár 19%-át is jelentheti az általuk szintetizált szerves anyagnak. A nod gének inducerei a növényi másodlagos anyagcsere termékei, elsősorban a benzolgyűrűt tartalmazó, flavonoid típusú molekulák (2-fenil-1,4-benzopiron származékok). Egy adott növényfaj több, különböző vegyületet is kiválaszt, amelyek között serkentő és gátló hatásúak egyaránt előfordulnak. A különböző komponensek arányát a növény fiziológiai állapota és a talajban előforduló kötött nitrogén mennyisége is befolyásolja. A gyökér által kibocsájtott molekulák ( ábra) konkrét szerkezete már a gazdaspecifitást is befolyásolja, hiszen ezeket a jeleket nem minden rhizobium képes egyformán "érzékelni" (51, 76, 171, 173) A nodulációs gének Az S. meliloti psyma megaplazmidján eredetileg két nod régiót azonosítottak (128). Ezek vizsgálata során kiderült, hogy az egyik régió más rhizobiumokból származó génekkel funkcionálisan felcserélhető (közös nod gének), míg a másik olyan információt is hordoz, amely az S. meliloti lucerna közötti kapcsolatot határozza meg (gazdaspecifitási nod gének). Ezeknek a nod régióknak a részletes genetikai elemzése, a DNS-szekvencia meghatározása, valamint az itt talált gének szabályozásának vizsgálata során derültek ki a következők: (a) a nod gének expresszióját a gazdanövény által kiválasztott flavonoid típusú vegyületek idézik elő, (b) a nod gének regulációjában a nodd génnek van fontos szerepe, (c) a nod gének promoter régiójában található egy konzervatív szekvencia (nod box), (d) a nod gének egy diffuzibilis szignál termelését irányítják (nodulációs vagy Nod-faktor), ami gazdaspecifikus módon képes a gümőfejlődés elindítására. Más szóval: a baktérium és gazdanövénye között szignálcsere történik, kommunikálnak egymással (50, 170, 208, 220). Ezt a folyamatot mutatja a ábra ábra: A szimbiózis kialakulása és a szimbiotikus növényi sejt felépítésének vázlata Az ábra felső részén a jelcsere egyes lépései láthatók. A flavonoid növényi szignálra válaszként küldött bakteriális Nod szignál elégséges a gümőfejlődés elindításához. Az infekciós fonal teljes kifejlődéséhez és a baktériumok inváziójához többek között szükségesek az exo és ndv gének. Legalul egy szimbiotikus növényi sejt és a benne lévő bakteroid sematikus képe látható. PBM: peribakteroid membrán. A többi magyarázatot lásd a szövegben. A jel felfogásában központi szerepet játszik a NodD fehérje (152, 197), amely a LysR típusú bakteriális regulátorokhoz sorolható, és a nod (nol, noe) gének általános transzkripciós aktivátora. Előfordul minden rhizobiumban és a nod boxokhoz kapcsolódva biztosítja a nod gének azonos séma szerinti szabályozását (50, 170, 208, 220). A nod box egy 47 bp hosszúságú, erősen konzerválódott szekvencia, amely a transzlációs kezdőpont előtt 200 bp távolságra található (198). A konszenzusszekvencia PP.dsc_komp3.doc

12 12 felhasználásával összesen hat nod box kópiát (n1-n6) mutattak ki S. melilotiban. Ezek helyzetének meghatározásával sikerült újabb nod régiókat is azonosítani, amelyek szintén a már ismert nod-nif régióban csoportosulnak ( ábra). A nod boxhoz a NodD feltehetően dimer formában kötődik az inducer hiányában is. A nod box felismerése a NodD fehérje N-terminális felén található, erősen konzerválódott helix-turn-helix (HTH) DNS-kötő domén feladata. A C-terminális rész szekvenciája nagyobb variabilitást mutat a különböző forrásból származó fehérjék esetén. Valószínű, hogy ez a rész kerül közvetlen fizikai kapcsolatba az inducer (vagy inhibitor) molekulákkal. Ebben a régióban sikerült két olyan motívumot is azonosítani, amelyek különböző gerincesek sejtmagi receptorainak ligandkötő doménjeivel homológok (101). A megváltozott inducerspecifitással rendelkező, különböző pontmutáns és hibrid NodD fehérjék elemzése viszont azt jelezte, hogy a kölcsönhatásban a molekula számos pontja érintett (32, 110). A nodd gén mutációja Nod - fenotípust eredményez. Ennek bizonyítása azonban nem mindíg könnyű feladat, mivel a nodd gén akár öt kópiában is előfordulhat a genomban. Ráadásul a különböző kópiák által meghatározott fehérjék inducerfelismerése eltérő lehet. Ez a helyzet az S. meliloti esetében is, ahol a psyma megaplazmid különböző pontjain három funkcionális nodd és egy velük homológ syrm gén (97, 108, 151) is található ( ábra). A SyrM fehérje a nodd3 gén működését serkenti, de az exopoliszacharid-termelést is befolyásolja (62) ábra: A Sinorhizobium meliloti és Rhizobium leguminosarum bv. viciae baktériumok által termelt Nod-faktor szerkezete. Az R betűvel jelzett pozíciókban lévő módosítások befolyásolják a gazdaspecifitást. A syrm és nodd3 géneknek a nod gének nitrogénkontrolljában is szerepe van. Ebben a folyamatban magas ammóniakoncentráció esetén fejt ki gátló hatását az NtrR represszor. Az ntrr mutáns baktériumban ez a típusú gátlás nem működik. Ráadásul a glutaminszintetáz II (glnii) bakteriális gén expressziós szintje is megemelkedik, jelezve hogy az ntrr gén nemcsak a gümőképződést befolyásolja, hanem sokkal általánosabb szerepe van a nitrogénanyagcserében (60, 161). A legtöbb S. meliloti törzsben kimutattak egy represszort is (NolR), amely a NodD fehérjével közösen biztosítja a nod gének optimális működését (129). A nolr gén a kromoszómán található. Az általa kódolt fehérje szintén tartalmaz egy HTH-motívumot, és homológ a Bacillus subtilis XylR represszorával, de hasonlít a NodD fehérjékhez is. Konzerválódott kötőhelye megtalálható több nod box 3' végéhez közel. Valószínű, hogy a represszor ehhez a régióhoz kapcsolódva az RNS polimeráz kötődését akadályozza. Újabban más rhizobiumokban is kimutatták a működőképes nolr gént (122). Az elmondottakból érzékelhető, hogy a nod gének expresszióját több tényező együttes hatása befolyásolja. Bár a fő elemek közösek, a szabályozás finomabb mechanizmusai a kölönböző rhizobiumokban sokszor eltérnek egymástól. Még tovább bonyolítja a regulációról alkotott képet az, hogy egyes esetekben a LysR típustól eltérő szabályozó elemek is előfordulhatnak. A B. japonicum nodvw génjei például egy kétkomponensű regulációs rendszer elemeit kódolják, amelynek a gazdaspecifitás alakításában lehet szerepe (95). Nem minden gazdanövény nodulációjához szükségesek A nod gének szerepe egy bakteriális szignál szintézisében Már a kezdeti genetikai kísérletek is arra utaltak, hogy a nodulációs gének két csoportba oszthatók. A legtöbb rhizobiumban megtalálható, funkcionálisan egymást helyettesíteni tudó géneket közös nod géneknek, míg az egyes növények nodulálását befolyásoló géneket gazdaspecifitási nod géneknek nevezték el (55, 78, 128, 228). Ez utóbbiak előfordulása, természetüknél fogva, jellemző az egyes rhizobium fajokra, és nem találhatók meg mindenütt egységesen. A nod gének szabályozásának megismerésével párhuzamosan kiderült az is, hogy ezek a gének egy diffuzibilis szignál szintézisét kódolják, amely jellegzetes változásokat hoz létre a gazdanövény gyökerén ( és ábra). Így például a megfelelő flavon (luteolin) jelenlétében növesztett S. meliloti kultúra steril szűrlete gyökérszőr-deformálódást idéz elő a lucernán. Ha a nodabc géneket elrontják, ez az aktivitás nem észlelhető (229). Korábbról ismert volt már, hogy a nodh gén mutációja esetén megváltozik a baktérium gazdaspecifitása. Elveszíti gümőindukáló képességét lucernán, viszont képes nodulálni a bükkönyt (Vicia sativa), amely eredetileg nem gazdanövénye (111). Ezzel összhangban, a nodh mutáns steril szűrlete bükkönyön aktív, de lucernán nem(10). Más kísérletekben az S. meliloti gazdaspecifitási génjeit (nodfeg, nodh, nodpq) juttatták be az R. l. bv. trifolii baktériumba A létrehozott új törzs gümőket tudott indukálni a lucernán, de elvesztette ezt a képességét az eredeti gazdanövényen (Trifolium repens). A nodh vagy nodq mutációja esetén visszaállt az eredeti gazdaspecifitás (47, 71). Ezek az eredmények más hasonló vizsgálatokkal együtt azt jelezték, hogy a nodabc géneknek a Nodfaktor alapvázának a felépítésében, míg a gazdaspecifitási nod gének ennek a szerkezetnek a módosításában játszanak szerepet (51). A Nod-faktor számos fizikai-kémiai tulajdonsága (hőstabil, amfifil, kis molekulatömegű) ismert volt már, de olyan kis mennyiségben termelődött inducer jelenlétében is, hogy a szerkezet meghatározáshoz túltermelő törzset kellett létrehozni. Az egyik módszer erre a syrm és nodd3 aktivátor gének példányszámának megsokszorozása volt. Az analízis során kiderült, hogy az S. meliloti baktérium több hasonló szignált is termel, amelyek mind lipo-kitooligoszacharid molekulák (193). A fő komponens a titokzatosnak tűnő NodRm-IV(Ac,S) nevet kapta, ami azonban jól jellemzi felépítésének fontosabb sajátságait. Pontos szerkezete: N-acil-tri-N-acetilβ-1,4-D-glükózamin tetraszacharid, amely a redukáló cukor C6 pontján egy szulfátcsoportot hordoz. Az acilcsoport pedig C16 hosszúságú, a 2. valamint a 9. pozíciókban kettős PP dsc_komp3.doc

13 13 kötést tartalmaz, és a nemredukáló cukorhoz kapcsolódik. A ábra az S. meliloti és az R. l. bv. viciae által termelt Nod-faktor szerkezetét mutatja be, a táblázat pedig összefoglalja az S. meliloti nod génjeinek szerepét a Nodfaktor kialakításában (50). A nodabc gének általánosan előforduló, konzerválódott gének minden rhizobiumban. A Nod-faktor vázának bioszintzisét a nodc gén által kódolt N-acetil-glükózaminiltranszferáz enzim végzi (90) 2-5 molekula N-acetil-Dglükózamin (GlcNAc) alegység összekapcsolásával. A láncnövekedés a nemredukáló végen történik, UDP-GlcNAc felhasználásával. A nodb által kódolt deacetiláz (113) eltávolítja az elkészült N-acetil-glükózamin oligoszacharid első tagjáról az acetilcsoportot (nemredukáló vég, C2 pozíció; ábra), és helyére a noda terméke, egy aciltranszferáz(194) helyezi fel az acilcsoportot. A nodm gén egy glükózamin-szintázt kódol, amely közvetve az UDP-GlcNAc készletet segít növelni a sejtben. Rajta kívül más enzim is rendelkezik ezzel a funkcióval, ezért mutációja csak késlelteti a nodulációt (8). Az utóbbi években kiderült, hogy a közös nod gének is rendelkezhetnek gazdaspecifitást meghatározó sajátságokkal (170), azonban a legfontosabb gazdaspecifitási tényezők az alapváz különböző "dekorációját", módosítását végző enzimek és az őket kódoló gének. A következőkben néhány példa szemlélteti, hogyan is alakul ki az adott gazdanövényre specifikusan ható Nod-faktor. Az összes eddig megismert Nod-faktor szerkezetét és a felépítésükben fontos nod gén szerepét részletesen tárgyalja több, nemrég megjelent összefoglaló cikk (50, 170, 220). A nodef gének az N-acetil-glükózamin vázra kerülő zsírsav telítettségén keresztül befolyásolják a gazdaspecifitást ( táblázat). Az általuk kódolt enzimek relatíve telítetlen zsírsavat hoznak létre (221), amely szükséges a Trifolieae és Vicieae családokba tartozó gazdanövények nodulációjához. Érdekes módon a különböző gazdaspecifitású baktériumoknál a node nem pontosan ugyanazt a szerkezetet határozza meg. A R. leguminosarum bv viciae node gén jelenlétében egy C18 lánchosszúságú, egy cisz helyzetű kettős kötést tartalmazó zsírsav keletkezik, míg az R. leguminosarum bv trifolii node gén által kódolt fehérje egy C18/20 hosszú, cisz helyzetű kettős kötéseket nem tartalmazó, telítetlen zsírsav szintézisét eredményezi. A két fehérje 198 aminosav hosszú központi doménje csak 44 aminosavban tér el egymástól. Ez a rész felelős a specifikus módosításokért (24). A NodH egy szulfotranszferáz enzim, amely a redukáló végen (R2; ábra) helyez el egy szulfátcsoportot. A szulfátdoorként funkcionáló 3'-foszfoadenozin-5'- foszfoszulfát molekula szintéziséért a nodpq gének felelősek. Ez a csoport az S. meliloti gazdaspecifitásának fontos tényezője (141, 192). A Nod-faktor bioszintézisét meghatározó géneken kívül a szignál kiválasztásában részt vevő gének is ismertek. A nodij gének általánosan elterjedtek, és olyan membránfehérjéket határoznak meg, amelyek hasonlítanak a poliszacharidok kiválasztásában szerepet játszó fehérjékhez (70). A Nod-faktorok nagyon kis koncentrációban (10-12 M) is képesek a gazdanövényen gyökérszőr-deformálódást előidézni és 10-9 M koncentrációban már a kortikális sejtek osztódását, a gümőmerisztéma illetve a gümő kialakulását is indukálják. Más szóval: ezek a bakteriális szignálok önmagukban képesek egy növényi genetikai program, a gümő-organogenezis elindítására, amely program "végigfut" további "utasítások" nélkül is. Mindezek ellenére nemcsak a nod gének határozzák meg a gazdaspecifitást, és valószínű, hogy más szignálmolekulák is szerepet játszanak a szimbiózis teljes kialakulása során A gümőinváziót meghatározó bakteriális gének A szimbiotikus baktérium bejutása a gümő belsejébe, az infekció a gazdanövény által ellenőrzött folyamat, amely feltehetően újabb felismerési lépéseket hordoz magában ( ábra). Az Inf - mutánsok, ellentétben a Nod - baktériumokkal, el tudják indítani a gümőfejlődést, de nem képesek a kialakuló gümő belsejébe jutni. Ilyenkor a fertőzési folyamat akad el és "üres" gümők keletkeznek. Ezek szerkezete nagyon hasonló a Nod-faktor által indukált gümőkéhez. A szimbiózis kialakulásának ebben a fázisában a baktérium különböző felszíni poliszacharidjainak és a növényi környezethez való alkalmazkodást biztosító mechanizmusoknak jut a főszerep. A bakteriális felszíni poliszacharidok lehetnek a külső membránba ágyazott lipopoliszacharidok (LPS), a felszínhez szorosabban kötődő kapszuláris poliszacharidok (KPS vagy CPS) és a környezetbe kiválasztott exopoliszacharidok (EPS). Ezen struktúrák közül akár többnek is lehet szerepe egy adott szimbiózis kialakításában (79, 116, 220), amit jól szemléltetnek az S. meliloti különböző törzseinél kapott eredmények Az exopoliszacharidok és az infekció Az exopoliszacharidok nagy mennyiségben termelt extracelluláris poliszacharidok, amelyek a sejtfelszínen halmozódnak fel, illetve kiválasztódnak a környezetbe. Számos általános funkciójuk lehet, mint a környezeti stressz elleni védelem, a tápanyagok diffúziójának akadályozása vagy a különböző felszíneken való megtapadás. Ezért fontos szerepet játszanak mind a patogén, mind a szimbiotikus kapcsolatokban. A savas exopoliszachridok hexóz alegységekből felépülő, egyenes vagy elágazó láncú molekulák, amelyeken nemszénhidrát típusú szubsztituensek is lehetnek, mint az acetát, piruvát, szukcinát. Savas természetüket uronsav, piruvát és szukcinát elemek beépülésének köszönhetik. Érdekes összefüggés, hogy a determinált gümőt létrehozó szimbiózis kialakulásában az EPS-nek nincs meghatározó szerepe, de az indeterminált szimbiótikus gümő invázióban elengedhetetlen a megfelelő EPSstruktúrák jelenléte (98). Ezt a szabályt sokféle szimbiózis vizsgálata bizonyította már (79). Igaz az S. meliloti lucerna kapcsolatban is. Az S. meliloti által termelt fő exopoliszacharid a szukcinoglükán, amely egy elágazó heteropolipoliszacharid. Hét glükóz- és egy galaktózmolekulát tartalmazó alegységekből épül fel. Az alegységeken szukcinil, acetil és piruvil módosítások találhatók. A molekulák mérete általában dalton, ami sok ismétlődő egység összeépülésére utal (4, 138). A "high molecular weight" röviden HMW-EPS mellett egy kis molekulatömegű (LMW) frakció is kimutatható, amely mono-, di- és trimerekből áll (235). Az EPS-termelésben hibás exo mutánsok képtelenek a létrehozott gümő inváziójára, de az LMW-EPS frakció adásával ez a hiba kiküszöbölhető. Tehát az EPS nemcsak egyszerűen a környezeti tényezők ellen véd (erre alkalmasabb a HMW-EPS lenne), hanem szignál szerepe is lehet. Ezt bizonyítja, hogy csak a fajspecifikus EPS képes az előbbi kiegészítésre és az, hogy kis mennyiségben alkalmazva is hatásos (14, 235). GFP (zöld, fluoreszcens fehérjével) jelölt baktériumok és fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatok segítségével PP.dsc_komp3.doc

14 14 kimutatták, hogy a különböző exo mutánsok az infekciós fonal képződésének különböző stádiumaiban akadnak el (36). Az EPS-bioszintézis kezdeti lépésében hibás exoy (galaktozil-foszfotranszferáz) mutánsok még előidézték a gyökérszőr görbülését és meg tudtak tapadni a fertőzési helyen, de az infekciós fonal képződése azonnal leállt. Azok a mutánsok (exoh, exoz), amelyek már kész EPS-t szintetizálnak, de erről hiányoznak a szukcinil- vagy acetilcsoportok, az infekciós fonal továbbfejlődését is elősegítik, de az infekciós fonal itt sem képes a gyökérszőrsejt határát átlépni Az exopoliszacharidok bioszintézise A heteropoliszacharidok szintézise általában négy lépésre bontható. Ennek megfelelően rendelhetjük hozzá a táblázatban felsorolt exo géneket is a szukcinoglükán szintézisének egyes lépéseihez: (1) a nukleotid-cukrok szintézise, (2) az ismétlődő oligoszacharid alegység szintézise a nukleotid-cukrokból, egy sejtmembránba ágyazott lipidhordozó felszínén, (3) a módosítások (pl. szukcinil, piruvil) elhelyezése a kész oligoszacharidon, (4) a már kész poliszacharidlánc rákapcsolása az újonnan szintetizált alegységre úgy, hogy az előbbi saját lipidhordozóját elhagyja. Ettől a lépéstől nem teljesen független a kész EPS kiválasztása az extracelluláris térbe (138). A szukcinoglükánnak is nevezett EPS termelésében hibás S. meliloti 1021 törzs Exo - mutánsai mind Inf - fenotípust is mutatnak. A mutánsok segítségével izolálták az exo és exs géneket, és a bioszintézisben betöltött szerepüket is tisztázták. Az azonosított gének száma 26, amelyek közül 19 exo és 2 exs gén a psymb megaplazmid egy 27 kb nagyságú darabján található, a többi a kromoszómán helyezkedik el. E gének által kódolt fehérjék a prekurzorok és az ismétlődő alegységek szintézisét, "dekorációját", a polimerizáció folyamatát, a poliszacharid exportját, degradációját és mindezen folyamatok regulációját végzik (17, 140). A szukcinoglükánon kívül két további, teljesen eltérő szerkezetű poliszacharidnak is lehet szerepe az S. meliloti szimbiózisok kialakulása során. Az egyik egy új exopoliszacharid (EPS II), amelyet EPS-mutánsok izolálásakor fedeztek fel (93), a másik egy kapszuláris poliszacharid ( fejezet). Az expr vagy az ettől független mucr represszorgénben hibás S. meliloti 1021 törzs egy glükózt és galaktózt tartalmazó, diszacharid alegységekből álló, galaktoglükánnak vagy EPS II-nek nevezett poliszacharidot termel (93). A szukcinoglükánt megkülönböztetésül EPS I- nek is nevezik. Az EPS II bioszintézisét kódoló gének szintén a psymb megaplazmidon helyezkednek el. Egy 30 kb nagyságú szakaszon belül összesen 20 exp gén található négy transzkripciós egységbe rendeződve (18). Néhány exo gén (pl. exob, exoc) is szükséges az EPS II szintéziséhez, mivel az alegység felépítésében fontos UDP-galaktóz szintézisét irányítják (lásd később, ábra). Az EPS I-et nem termelő (pl. exoy - ), de az expr101 mutáció következtében az EPS II poliszacharidot termelő dupla mutánsok képesek a lucernával szimbiózisra lépni, de más gazdanövénnyel nem (93). A tisztított EPS II kis molekulatömegű (LMW) formájának biológiai aktivitását szintén kimutatták. A diszaharid egységből álló frakció már 7 pmol/növény mennyiség adása esetén is "ki tudta segíteni" a különböző exo mutánsokat az inváziós folymatban. A mucr - törzs ellentétben az expr101 mutánssal az EPS II-nek csak a HMW formáját termeli. Valószínűleg ez az oka annak, hogy a mucr - /exoy - törzs Inf - marad (94). Az expr és mucr gének tehát fontos szabályozó fehérjéket kódolnak, amelyek az EPS II termelését represszálják. Már több mint tíz éve ismert, hogy foszfátéhezés hatására az EPS II termelése fokozódik (243). Azóta azonosították és jellemezték a szabályozásban részt vevő expg és phob géneket is (17, 199, 220). A nod gének regulációjában részt vevő syrm gén szintén befolyásolja az EPS-bioszintézist (62) A kapszuláris poliszacharidok szerepe Az eddig elmondottakkal látszólagos ellentmondásban az S. meliloti 41 törzs exob mutánsa amely egyik EPS szintézisére sem képes minden egyes gazdanövénnyel működő szimbiózist tud létrehozni. E dolgozatban bemutatott kísérleteink jelentős része ennek az ellentmondásnak a feloldását adja, ezért ez a fejezet az általános vonatkozásokon kívül csak néhány fontosabb eredményt mutat be. A magyarországi rhizobiumkutatás kiindulópontja az S. meliloti 41 törzs (RM41) volt, amelyet Szende Kálmán izolált és kezdett el vizsgálni (225). Kondorosi Ádám és társai ebből a törzsből izoláltak egy "kompakt" kolóniamorfológiával rendelkező, nem mukoid törzset (AK631), amely ugyanúgy képes volt szimbiózisra a lucernával, mint az eredeti RM41 törzs (12). Praktikus okokból az AK631 lett minden további genetikai munka kiindulópontja. Csak jóval később derült ki, hogy az AK631 egy exob mutáns, amely egyáltalán nem termel exopoliszacharidot, és amelyet egy másik felszíni poliszacharid segít az inváziós folyamatban (182). A kezdeti genetikai, biokémiai vizsgálatok alapján ez az anyag lipopoliszacharidnak tűnt (28, 182). Később kiderült, hogy kapszuláris poliszacharid (KPS), és így a "nemtermelő", Inf - mutánsok segítségével a rhizobiumoknál elsőként egy KPS-bioszintézisben szerepet játszó géncsoportot sikerült azonosítani (172, 182). A kapszuláris poliszacharidok az LPS-hez hasonlóan a baktériumok felszínéhez kötött poliszacharidok, amelyek szintén erős immunogének lehetnek, ezért K-antigéneknek is nevezik őket. A KPS szerkezete, bioszintézise és a megfelelő gének jellemzése a különböző humánpatogén E. coli, Salmonella, Neisseria, Haemophilus, illetve a növénypatogén Pseudomonas és Erwinia törzsek vizsgálata révén váltak leginkább ismertté (26, 112, 191, 239). A különböző E. coli törzsek több mint 80-féle K- antigént termelnek, amelyek egyik jellegzetes csoportját a II. típusú K-antigének alkotják. Ezek egy konzerválódott ABC-transzporter komplex segítségével (KpsCMST) jutnak át a belső sejtmembránon (216), és α-glicerofoszfát molekulákon keresztül ágyazódnak a külső membránba. Nemcsak a transzportfehérjék szerkezete, hanem a gének elrendeződése is konzervatív. A törzsspecifikus alegységek szintéziséért felelős, egyedi géneket (szerotípus-specifikus 2. régió) két oldalról közreveszi a transzportért felelős géneket tartalmazó 1. és 3. régió (191, 239). Rhizobiumoknál a KPS jelenlétéről és kezdeti jellemzéséről elsők között R. Carlson laboratóriumából számoltak be egy R. fredii és az R. meliloti 41 törzs vizsgálata kapcsán. Kimutatták, hogy az S. meliloti 41 törzs egy K R 5 antigénnek elnevezett, törzsspecifikus poliszacharidot termel, amely felépítésében hasonló az E. coli törzseknél ismert II. típusú K-antigénekhez (187). A K R 5 antigén bioszintézisében szerepet játszó géneket azonosítottuk tehát először a fix-23 (új nevén rkp-1) PP dsc_komp3.doc

15 15 régióban, majd később az rkp-2 és rkp-3 régiókban ( fejezetek). Mára már ismert, hogy a K R 5 antigén diszacharid alegységei egy glükuronsavból és egy 5,7-diamino-3,5,7,9- tetradeoxi nonulozonsavból (pszeudaminsav, Pse) állnak, amelyen 7-N-acetil és 5-N-β-hidroxibutiril módosítások találhatók, így pontos rövidítése: Pse5NAc7N(β-OH-But) (187, 188; B. Reuhs személyes közlés). A K R 5 antigén termelését befolyásoló rkpz (lpsz) gén a psymb megaplazmidon található az S. meliloti 41 törzsnél, de az S. meliloti 1021 törzsben nincs jelen. Hiányában csak HMW KPS termelődik, ami nem tudja ellátni a LMW forma szerepét a szimbiózisban. Az RkpZ fehérje homológ az E. coli KpsC fehérjével, amelyről kimutatták, hogy befolyással van a termelt K-antigén méretére és exportjára (190). Az S. meliloti 41 törzsnél kapott eredmények érdekes példáját adták annak, hogy két felszíni poliszacharid hogyan helyettesítheti egymást az invázió folyamatában. Ennél a törzsnél mind az exob (EPS -, nemtermelő), mind a kölönböző rkp (KPS -, nem termelő) mutánsok képesek hatékony szimbiózist kialakítani a lucernával, és csak az exob/rkp (EPS -, KPS - ) kettős mutánsok mutatnak Inf - fenotípust (182). A kettős mutánsok az EPS-termelésben hibás S. meliloti 1021 exo mutánsokhoz hasonlóan az LMW EPS frakció adásával átsegíthetők az invázió elakadásán, de ugyancsak aktív ebben a tesztben a K R 5 antigén kis molekulatömegű frakciója is (169). Ez ismét megerősíti azt a feltevést, hogy ezeknek a felszíni poliszacharidoknak, illetve kis molekulatömegű származékaiknak szignál szerepük van az infekciós fonal fejlődésében, az invázió folyamatában. Mivel a szukcinoglükán (EPS I), a galaktoglükán (EPS II) és a K R 5 antigén szerkezetében teljesen különbözik egymástól, ezért a gazdanövény részéről felismerésükhöz más jelfogó apparátus (receptor) szükséges. Ezt mutatja az is, hogy a megvizsgált gazdanövények fertőzésére a csak szukcinoglükánt vagy csak K R 5 antigént termelő törzsek egyaránt képesek (182), de a csak galaktoglükánt termelő mutánsok egyedül a lucernát tudják fertőzni (93). Ugyanannak a baktériumnak más és más poliszacharidja lehet tehát fontos a különböző gazdanövényekkel kialakuló kapcsolatban. Nemcsak a noduláció, hanem az invázió folyamata is hordoz gazdaspecifikus felismerési lépéseket LPS mutánsok A Gram-negatív baktériumokban található lipopoliszacharidok három jellegzetes szerkezeti elemből épülnek fel: a membránba ágyazódó lipida, a konzerválódott "core" oligoszacharid régió és az ismétlődő oligoszacharid egységekből álló O-antigén. A KPS-hez hasonlóan az O-antigén is törzsre jellemző, nagyfokú variabilitással és immunogén aktivitással rendelkezik. Fonos szerepet tölthet be egy adott kórokozó patogenitásának mértékében (35). Rhizobiumoknál az utóbbi években indult meg az LPS szisztematikus szerkezeti jellemzése (79). Több rhizobiumnál az O-antigént érintő változások befolyásolják a szimbiózis kialakulását (49, 159, 176). Megjegyzendő, hogy az S. meliloti esetében az LPS szerepére általános és minden szimbiotikus kapcsolatra igaz következtetéseket a megfelelő mutánsok hiánya miatt eddig nem tudtak levonni. Talán a mutánsok hiánya is azt jelzi, hogy az LPS több baktérium növény kapcsolatnál nem fontos a szimbiózis szempontjából. Hiszen a genetikai munka kezdetén számos laboratóriumban elvégzett random mutagenezis nem eredményezett sokféle, LPS-hibás szimbiotikus mutánst. De az is elképzelhető, hogy több alternatív struktúra is megfelel ugyanarra a szerepre ahogy ez az EPS és a KPS estében már bebizonyosodott, és ezért nem sikerült nagyszámú mutánst izolálni. Ráadásul valószínűleg az LPS esetében is igaz, hogy baktérium- és növénypartner-függően lehet fontos vagy érdektelen egyik vagy másik felszíni poliszacharid jelenléte a gümőfejlődés során. Ennek tisztázása további kísérleteket igényel (79). Az S. meliloti LPS több tulajdonságában is eltér a szokásostól. Például az izolált LPS túlnyomó részén nincs meg a variabilitást hordozó O-antigén, így az ún. R-LPS (188). A különböző LPS-hibás mutánsok (lpscde, lpsl) általában nem érintettek szimbiotikus tulajdonságaikban (40, 117, 136). Az előzőekben felvázolt, "partnerfüggő" elképzelést támasztja alá az is, hogy az lpsb génben hibás baktériumok normál szimbiózist alakítanak ki M. sativa, de ineffektív szimbiózist M. truncatula növényekkel (136, 158). Több dolgozat is beszámol arról, hogy különböző rhizobiumfajokban megváltozik az LPS szerkezete a nod gének indukciójában is fontos flavonoidok hatására, vagy a szimbiotikus bakteroidok felszínén más, mint a szabadonélő baktériumban. Azt is leírták, hogy egyes Bradyrhizobium törzsek termelhetnek gümőspecifikus poliszacharidokat (NPS), de mindezen változások genetikai háttere általában még ismeretlen (79). Érdekes fenotípust eredményez az S. meliloti baca gén mutációja. Az infekciós fonal fejlődése nem akad el, a baktériumok kiszabadulnak a növényi sejtekbe az inváziós zónában, de nem képesek bakteroidokká alakulni. Csak ún. öregedő bakteroidok figyelhetők meg, amelyek általában a szimbiotikus gümő gyökérhez közeli (proximális) végén láthatók az ún. öregedési zónában. A baca386::tnphoa fúzió segítségével követett génexpresszió a legerősebb a bakteroid kialakulásakor, tehát ez a gén valamilyen módon szükséges a bakteroid differenciálódáshoz. A baca génnel homológ DNS-szekvenciát sok patogén genomban is ki lehet mutatni (92). Az invázióban feltételezett konzerválódott szerep bizonyítására G.C. Walker laboratóriumában kimutatták, hogy a Brucella abortus megfelelő génje szerepet játszik a patogenitásban (142). A baca a baktériumsejt felszíni tulajdonságait befolyásolja, bizonyítottan legalább az LPS szerkezetét, és ily módon lehet lényeges hatása a "krónikus intracelluláris infekció" elősegítésében, azaz rhizobiumok esetében a szimbiózis kialakulásában (72) Invázió és alkalmazkodás A már ismertetett poliszachardok általános funkciói közé tartozik a baktérium védelme a külső környezeti hatások ellen, de a felismerési folyamatokban való szerepük ennél fontosabb és érdekesebb kérdés. Ismerünk olyan bakteriális géneket is, amelyek egyértelműen csak a környezethez való alkalmazkodást segítik, szimbiózison kívül és szimbiózisban egyaránt. Hibájuk esetén a mutáns baktérium szintén elakad a fertőzési folyamatban ( ábra). Az ndvab géneket az Agrobacterium kromoszomális virulenciagénjeinek (chvab) segítségével azonosították, és irányított mutagenezisük révén bizonyították, hogy általános szerepük van a növény baktérium kapcsolatok kialakulásában. Hibájuk esetén az S. meliloti baktériumok Inf - fenotípust mutatnak, és nem termelik a ciklikus β-1,2- glükánt, amely a Rhizobiaceae család jellemző poliszacharidja. Nagy mennyiségben található a periplazmikus térben és kiválasztása függ a fiziológiai PP.dsc_komp3.doc

16 16 körülményektől. Az NdvB fehérje a poliszacharid szintézisében, míg az NdvA a transzportban vesz részt. Az összefoglaló cikkek általában a poliszacharidok felsorolásánál említik a β-1,2-glükánokat, és így a fent említett géneket is (79, 220), azonban ebben az esetben nem a termelt poliszacharid tulajdonságain van a hangsúly. A mutáns baktériumok ugyanis hipoozmotikus adaptációs képességüket is elveszítik. Dylan és társai ndv mutánsokból izoláltak olyan pszeudorevertánsokat, amelyek visszanyerték mind ozmotikus adaptációs, mind szimbiotikus képességüket, de nem termeltek β-glükánt. Ez pedig arra utal, hogy a fertőzés folyamatában nem a β- glükán jelenléte lényeges, hanem a baktérium megfelelő alkalmazkodóképessége a fontos, hogy el tudja viselni az infekciós fonalban található fiziológiai körülményeket (27, 64). Hasonló szerepet játszhat az exod gén is, amelynek hibája esetén a baktérium érzékenyebb az alkalikus körülményekre, de inváziós képessége helyreállítható megfelelően pufferelt közeggel (184, 185). Az S. meliloti kromoszómán található fix-2 mutáció szintén az inváziót akadályozza (179). E mutáció segítségével azonosított pha1abcdefg génekben minden egyes Tn5 inszerció K + -ionokkal szembeni érzékenységet okoz, amely lúgos körülmények között erőteljesebb, tehát ennek a géncsoportnak is a környezethez való alkalmazkodásban van szerepe. A szekvenciahasonlóságok és a fiziológiai kísérletek alapján valószínű, hogy a pha1 régió egy K + -effluxrendszer felépítését határozza meg (180). Ezeket a kísérleteket az 5.6. és 6.2. fejezetek tárgyalják részletesen Az invázió és a növényi védekezési mechanizmusok Elképzelhető, hogy a megfelelő felszíni poliszacharidok jelenléte a növényi védekezési mechanizmusok megnyilvánulását (is) gátolja. Kimutatták, hogy az S. melilot EPS I poliszacharid szupresszálhatja az M. sativa védekezési reakcióit (156, 157). Ezzel összhangban a B. japonicum exob mutánsokkal történő fertőzés során tízszeresre nőtt egy, a szója által termelt növényi antimikrobiális anyag, egy izoflavonoid (glyceollin) szintje. Ezt az indukciót normál esetben csak a növénypatogén baktériumok képesek kiváltani (165). A KPS jelenléte vagy hiánya szintén hatással lehet a védekezési mechanizmusokra. Az izoflavonoid-bioszintézis két fontos enzimét, a salkonszintázt és a salkonreduktázt kódoló géneknek gyors expresszióját és represszióját figyelték meg S. meliloti 41 baktérium levélbe történő injektálása után. Kimutatták, hogy a rövid indukcióért ami eltér egy patogén baktériummal való kezelés hatásától a K R 5 antigén és nem a szukcinoglükán a felelős. Az eredmények az mutatták, hogy a KPS részt vehet a korai felismerési folyamatokban (19). Nemcsak a poliszacharidhibás mutánsok indukálhatják a gazdanövény védekezési rendszerét. A ph-adaptációra képtelen fix-2 (pha1) S. meliloti mutáns szintén előidézi a salkonszintáz gén bekapcsolódását. Az infekciós fonal növekedése általában megáll, de ritkán előfordul, hogy egyes sejtekbe baktériumok jutnak be. Ilyenkor az öregedő, szeneszcens bakteroidokra emlékeztető képletek jönnek létre (100) A nitrogénkötés génjei A véletlenszerűen izolálható ineffektív (Fix - ) mutánsok nagy többsége képes a gümő inváziójára, és bakteroiddá alakulásuk is elkezdődik, de ezek a bakteroidok hamar öregednek és alakjuk rendellenes. Ezekben az esetekben a mutáció a nitrogénkötő apparátus valamely elemét vagy a bakteroid metabolizmusát érinti (nif és késői fix gének). A szimbiózis kialakulásának késői stádiumában ( ábra) nagyon sok gén expresszióját a csökkenő oxigénkoncentráció befolyásolja (77). Eddig 9 olyan rhizobium gént azonosítottak, amely a K. pneumoniae 20 nif génje közül valamelyikkel homológ. Ezeknél használatos a nif elnevezés. A többi nitrogénkötési gént fix génként jelölik, bár ez nem kevés zavart okoz. Számos, kezdetben szimbiózisspecifikusnak gondolt, ún. fix génről kiderült ugyanis, hogy általánosabb funkciót kódol és nemcsak szimbiózisban fontos. Ezek később a szerepüket jobban jelölő elnevezést kaptak ( táblázat). A szűkebb értelemben vett, késői fix és nif gének meghatározott csoportokat alkotnak a genomon belül, de nem helyezkednek el olyan közel egymáshoz, mint a K. pneumoniae nif génjei. S. melilotiban két fő csoportot különíthetünk el, amelyek egymástól nagyjából 200 kb távolságra, a psyma megaplazmidon találhatóak ( ábra). Az egyik csoport magában foglalja a nif és a nod géneket is, míg a másik csak fix géneket tartalmaz. Ez utóbbi csoport egy része (fixk, fixnoqp) a nif-fix régió másik oldalán, úgy 40 kb távolságra ismételten megtalálható (77) A nif és fix gének szerepe A nifhdk gének kódolják a nitrogenáz enzimkomplex egyes részeit. A homodimer Fe protein (dinitrogenáz reduktáz) szintéziséért a nifh, míg az α 2 β 2 szerkezetű FeMo fehérje (dinitrogenáz) α alegységéért a nifd, β alegységéért pedig a nifk gén felelős. A velük egy transzkripciós egységben lévő nife, valamint a különálló nifn és nifb gének a FeMo kofaktor szintézisét irányítják (46). A nifa egy transzkripciós aktivátor fehérjét kódol, és a fixlj, fixk génekkel együtt a nitrogénkötés szabályozásában van szerepe (2.6.2., ). A fixabcx operon által meghatározott fehérjéknek feltehetően a nitrogenáz komplex felé irányuló elektrontranszportban van szerepe. A fixx pedig, hasonlóan az fdxn génhez, egy ferredoxin homológ fehérjét kódol (66). A fixnoqp operon egy bakteroidspecifikus, membránba ágyazott citokróm oxidáz komplexet határoz meg, amelynek igen nagy az oxigénaffinitása (175). A szabadonélő diazotróf szervezeteknél a kötött nitrogén és az oxigén koncentrációja egyaránt fontos tényező a nif gének szabályozásában. Ez a kettős kontroll az általános nitrogénregulációs rendszeren (ntr) és a nif génekre ható nifla regulátorgéneken keresztül érvényesül. Szimbiózis esetén elsősorban az oxigénérzékelő rendszeré a főszerep, és az ntr rendszer hatása kevésbé érvényesül. Ez érthető is, hiszen a nitrogén szabályozó hatása a szimbiózis kialakulásakor a nod gének regulációján keresztül már érvényesült. Másrészt a bakteroidok "túltermelik" az ammóniát a növény számára, ezért fontos, hogy a nitrogénkötés ne álljon le a bakteroid megfelelő nitrogénellátottsága esetén. A különböző rhizobiumoknál a szabályozórendszer elemei azonosak, de fajra jellemző eltérések is megjelennek, ahogy az a nod gének regulációjában is megfigyelhető (145, 166) Az oxigénszint érzékelése: a fixlj és fixk gének A fixlj génpáros egy kétkomponensű (szenzor, regulátor) szabályozórendszer elemeit kódolja (45), amely PP dsc_komp3.doc

17 17 alacsony oxigénkoncentráció esetén aktiválja a fixk és S. meliloti esetében a nifa regulátorgént. Ezáltal közvetve bekapcsolja a nif operonokat, valamint több fix géncsoportot is ( ábra). A FixL fehérje egy oxigén-érzékelő, membránkötött hemoprotein foszfatáz/kináz, amelynek középső doménje tartalmazza a Hem csoportot, N-terminális része pedig az autofoszforilációért és a FixJ-foszforiláló (kináz) aktivitásért felelős. A FixJ transzkripciós aktivátor N-terminális részén található a foszforilációs hely, míg a C-terminális fele egy HTH DNS-kötő motívumot tartalmaz. Alacsony oxigénkoncentráció esetén a FixL foszforilálódik, majd a FixL-P a foszfátcsoport átadásával aktiválja a FixJ fehérjét. A FixJ-P pedig elősegíti a nif és fix operonok átírását ( ábra). Az oxigén hiánya nemcsak a FixL autofoszforilációját segíti elő, hanem a FixL-P foszfatáz aktivitását is gátolja, így a folyamat a FixJ-P keletkezésének (aktiválásának) irányába tolódik el (77) ábra: A nif és fix gének szabályozása. (A magyarázatot lásd a szövegben.) A regulációs lánc további közvetítő eleme a FixK fehérje, amely a Crp-Fnr transzkripciós aktivátorok családjába tartozik (15). Ezek közös jellemzője az N- terminális részen található öt, konzerválódott glicinmaradék, amelyek β-szerkezetű részeket választanak el, valamint a C- terminális részen lévő HTH-motívum. A család tagjai katabolikus gének aktiválásában, nitrogén- vagy kénasszimilációt, illetve anaerob respirációt irányító gének szabályozásában vesznek részt. S. meliloti esetén a FixK fehérje nemcsak a fixnoqp, hanem a fixghis operont is aktiválja ( ábra), és negatív hatással van a nifa expresszióra (77) Az rpon és a nifa szerepe más baktériumban is megtalálták. Speciálisabb funkciót látnak el a nitrogén-anyagcsere szabályozásában a σ 54 típusú alegységek, amelyeket az rpon (ntra) gén kódol, és szintén széles körben elterjedtek. A megfelelő S. meliloti gént is azonosították (195). Az RpoN-függő promoterek szerkezete teljesen eltér a jellegzetes (-35/-10) felépítésű E. coli promoterekétől. A transzkripciós kezdőponttól számított (-26/-11) pozíciók között található a rájuk jellemző 5'-tGGcac-n 5 -ttgca/t-3' konszenzusszekvencia. A σ 70 alegységgel rendelkező RNS polimerázzal ellentétben az RpoN alegységet tartalmazó komplex még nem képes a transzkripcióra. Ez csak akkor kezdődhet el, ha egy további pozitív regulátor is jelen van, amelynek aktivitását különböző fiziológiai szignálok befolyásolják. A NifA, NtrC, DctD fehérjék mind ilyen regulátorok, amelyeknek a szimbiózisban (is) szerepük van (77, 166). A NifA transzkripciós aktivátor fehérjét mint a nif gének regulátorát a K. pneumoniae baktériumban azonosították először. Általánosan elterjedt a nitrogénkötő szervezetek között, és nemcsak a nif, hanem más gének működését is szabályozhatja ( ábra). N-terminális része a legkevésbé konzerválódott. A középső részén található, erősen konzervatív domén nagy hasonlóságot mutat minden olyan regulátorral, amelyek az RpoN faktorral karöltve működnek. Feltehetően ez a szekvencia vesz részt az RNS polimerázzal való kölcsönhatásban. A központi domén alkotóeleme egy ATP-kötő motívum is. Feltételezik, hogy az RpoN-függő aktivátorok működéséhez az ATP-kötés/hidrolízis is hozzátarozik. A NifA C-terminális részén található a DNS-kötő HTHmotívum. Ennek első hélixe erősen konzerválódott az összes RpoN-függő regulátorban, míg a második hélix szekvenciája a NifA fehérjékre jellemző. Valószínű, hogy ez vesz részt a NifA-specifikus DNS-szekvencia (UAS, upstream activator sequence) felismerésében. Az UAS majdnem minden NifA regulálta promoterben elődordul, nukleotid távolságra a transzkripciós kezdőponttól. Érdekes módon jelenléte nem feltétele a NifA aktiváló hatásának. Hiányában vagy a NifA HTH-motívumának eltávolítása esetén a fehérje még képes elősegíteni az RpoN- RNS-polimeráz működését. Éppen ezért úgy tűnik, hogy szerepe inkább a promoter működésének árnyaltabb szabályozásában van azáltal, hogy koncentrálja és orientálja a regulátort a promoter régióban (77) A nifa gén szabályozása a különböző rhizobiumoknál eltérő lehet. S. meliloti esetén a gén transzkripciója elsődlegesen a NifJ-függő promoterről történik (p nifa ), amely a fixabcx operon után helyezkedik el. Szabadonélő vagy aerob körülmények között a p nifa -ról induló transzkripció minimális. Bakteroidoknál, illetve a mikroaerob körülmények között növesztett baktériumnál az aktivált FixJ-P indukálja a NifA fehérje termelését, és ez elősegíti a fixabcx gének átírását is. Ezek transzkripciója nem terminálódik a fixx gén után, hanem folytatódik a nifa génen keresztül is, így megemelkedik a NifA szintje (54, 232, 237). A nifa gén expressziójára a FixK fehérje negatív hatással van. A rhizobiális NifA fehérjék külön érdekessége, hogy oxigén jelenlétében inaktiválódnak. Így nemcsak a NifLJrendszeren keresztül érvényesül az oxigén gátló hatása, hanem közvetlenebb úton is (77). A bakteriális RNS polimeráz promoter felismerését az α 2 ββ'σ holoenzimbe beépülő σ alegység határozza meg. Az E. coli fő σ faktora a σ 70, amelynek homológjait számos PP.dsc_komp3.doc

18 Egyéb szimbiotikus gének A szimbiotikus gümőben a bakteroid által termelt ammónia átjut a növénybe, és itt épül be a különböző szerves vegyületekbe a glutaminsav glutamin bioszintézisen keresztül. A nitrogénkötés magas energiaigényét a növényi fotoszintézis fedezi. A fotoszintézis termékét, a szaharózt a növény háncs elemei szállítják a gümőbe, ahol a belőle keletkezett maleinsav transzportálódik a bakteroidba a dcta (dikarbonsavtranszport) gén által meghatározott permeáz segítségével. A szabadonélő baktériumban a dcta gén megnyilvánulásához a dikarbonsav inducer és a DctB szenzor kináz, valamint a DctD aktivátor szükséges. Ez utóbbi indítja el a dcta gén transzkripcióját az RpoN faktorral együtt. Érdekes módon szimbiózisban nem ez a szabályozórendszer működik. Ekkor a dcta a dctbd gének hiányában is aktiválódik (195). A cychjkl kromoszomális gének a c-típusú citokrómok biogenezisében vesznek részt, így szükségesek a szimbiózisspecifikus FixO és FixP fehérjék éréséhez is. Működésük ezért elengedhetetlen a nitrogénkötéshez, de a szabadonélő baktériumban is aktívak (118). A különböző rhizobiumokban számos génnek lehet befolyása a szimbiózis kialakításának hatékonyságára ( táblázat). Ezek előnyt jelenthetnek az adott baktérium számára a fertőzésben való versengés során, de nem feltétlenül szükségesek. Az nfe1 és nfe2 (nodule formation efficiency) géneket az S. meliloti GR4 törzséből írták le. Mindkét gén előtt RpoN-NifA-függő promoter található, de az nfe1 a szabadonélő sejtekben is átíródik. Az infekció során, a mikroaerob körülmények hatására mindkét gén aktiválódik. Az nfe1 5' vége homológ a nifh gén elejével és a fixabcx promoter régióval, ami azt jelzi, hogy ez a gén genetikai átrendeződés révén alakult ki, amelyben IS elemeknek is része lehetett. Az nfe2 gén terméke nem hasonlít egyik eddig ismert fehérjéhez sem, de tartalmaz egy HTH-motívumra emlékeztető részletet. Konkrét funkciójuk ismeretlen (219). A mos génekkel rendelkező rhizobiumok opinszerű vegyületeket képesek előállítani (rhizopinok), amelyeket a növénybe bejutott baktériumok hasznosíthatnak, ha tartalmazzák a lebontásukhoz szükséges moc géneket. Ez a stratégia nagyon emlékezet az Agrobacterium törzseknél tapasztaltakhoz (89). Két S. meliloti törzsnél is kimutatták, hogy a moc és mos gének a psyma megaplazmidon egymáshoz közel helyezkednek el. A mos gének NifA reguláció alatt állnak, és promoterrégiójuk nagy hasonlóságot mutat a nifh promoterrel. Az első ORF és a nifh gén eleje pedig szinte teljesen azonos (153). Hasonlóan az nfe1 génhez a mos promoter is genetikai átrendeződés következménye lehet. A gümőbe bejutott baktériumok a mos gének bekapcsolódásának köszönhetően olyan vegyülettel képesek "etetni" a rhizoszférában és az infekciós fonalban lévő társaikat, amelyet más törzsek nem tudnak hasznosítani. E gének birtokában túlélési esélyeik más talajbaktériumokkal szemben növekednek, de a gazdanövénnyel szimbiózisra képes moc géneket nem tartalmazó többi rhizobiummal szemben is. A rhizobiumok genomprojektjei (2.3.2.) segítségével felgyorsult a szimbiózisban szerepet játszó gének vizsgálata. A feltételezett gének adatbázisokkal való összehasonlítása révén számos olyan szekvenciát találhatunk, amelyeknek szimbiotikus szerepe lehet. Ennek bizonyítására a transzkripciós (transcriptome) analízis ad újszerű lehetőséget. Az első ilyen vizsgálat több, eddig ismeretlen S. meliloti gént azonosított, amelyek expresszióját a nod géneket is indukáló luteolin fokozta, vagy amelyeknek bekapcsolása szimbiotikus körülmények között történt meg (5). Az ismeretlen gének szerepének vizsgálatára a "fordított genetika" eszköztára is rendelkezésre áll, ahol egy meghatározott DNS-szakasz funkciójának kiderítése érdekében már a szekvencia ismeretében, utólag hozunk létre célzott mutációkat, és vizsgáljuk a mutánsok fenotípusát különböző biológiai tesztekben. Az S. meliloti genetikai elemzése, sok más baktériuméval együtt, ebbe a szakaszba lépett Szimbiotikus gének a pillangósokban Természetesen a szimbiózis eseményeinek megértéséhez elengedhetetlen a gazdanövény vizsgálata is. A téma genetikai megközelítése azonban nagyságrendekkel nehezebb, mint a baktérium esetében. Mivel ezen áttekintésnek nem célja a szimbiotikus növényi génekről szerzett ismeretek számbavétele, ezért csak néhány fontosabb összefoglaló cikkre, illetve kiragadott eredményre szeretném felhívni a figyelmet. A "növényes oldalon" először azok a biokémiai vizsgálatok hoztak értékes eredményeket, amelyekben a gümőspecifikus növényi fehérjéket, a nodulinokat jellemezték (137). A molekuláris biológiai módszerek fejlődésével azután különböző cdns klóntárak készítése, differenciál hibridizáció és DNS-szekvenciaanalízis révén lehetőség nyílt a szimbiotikus gümőben expresszálódó növényi gének azonosítására és szerkezetük megismerésére. E módszerek segítségével főleg a gömőben nagy mennyiségben megjelenő fehérjéket és az erősebben megnyilvánuló géneket (mrns) lehetett azonosítani (205, 231). Bár sok ismeret halmozódott fel, a legizgalmasabb kérdések a genetika alkalmazása (a megfelelő mutációk izolálása, genetikai térképezése) nélkül megválaszolatlanok maradtak. Ezek közé tartozik a különböző bakteriális szignálok érzékelésében, tehát a gazdaspecifitás kialakításában fontos növényi "jelfogó" mechanizmusok megismerése. Jó pár éve ismertek már nodulációban vagy a szimbiózis kialakulásának későbbi lépéseiben hibás mutánsok (33, 91, 99). Az első "igazi" nodulációs gént, genetikai eszközökkel L. japonicus esetén izolálták, ahol a mutáns növényt (nin-1) a kukorica Ac mobilis elem segítségével állították elő (207). Sajnos a nodulációban hibás mutánsok többsége kémiai vagy fizikai mutagenizálásból ered, így lényegesen munkaigényesebb az érintett gént izolálni. Ezen mutánsok genetikai, fiziológiai jellemzésével a Nod-faktor szignál transzdukciós útját több lépésre lehetett bontani. A mutánsok egy része nem mutatott semmilyen reakciót Nodfaktor kezelésre, és mikorrhiza (gombákkal való szimbiózis) kialakítására is képtelen volt. Ebbe a kategóriába tartozó mutációk aprólékos térképezésével, pozicionális klónozás segítségével azonosították az első Nod-faktor érzékelésben fontos növényi géneket, amelyek a szignáltranszdukciós úton a nin-1 génnél előbb jutnak szerephez (68, 223). Szintén a noduláció kezdetén van szerepe a növények által termelt lektineknek, azoknak a fehérjemolekuláknak, amelyeket a szimbióziskutatás kezdetén a baktériumok felszíni poliszacharidjai mellett a gazdaspecifitás fő meghatározójának tartottak. A lektinek szénhidrát-kötő fehérjék. A gazdanövény által kiválasztott lektinek képesek specifikus módon elősegíteni a megfelelő baktérium megtapadását a gyökérszőrön. Ennek megfelelően a gazdanövényből származó lektingén idegen pillangósba való átvitelével több esetben elő lehetett segíteni a lektinre specifikus baktérium gümőképzését a transzgenikus PP dsc_komp3.doc

19 19 növényen. Tehát a baktérium növény kapcsolatban szerepük van, ha különböző fontossággal is, a lektinek által közvetített felismerési reakciónak is (104, 119). Az elmúlt évben a szimbióziskutatók rengeteg munkát fektettek a nitrogékötő gümő kialakulásának és működésének megértésébe. A megszerzett tudás nemcsak az alapkutatás, hanem a mezőgazdaság és a környezetvédelem számára is fontos. A genomprojektek és a nitrogénkötő szimbiózisok sokféleségének tanulmányozása együtt segít megérteni, mely gének konzerválódtak, és hogyan lehet a nitrogénkötő-képességet más gazdaságilag fontos növényekre is kiterjeszteni (105) táblázat : Az S. meliloti néhány szimbiotikus génje. gén funkció ref. noduláció Nod-faktor szintézise (50, 170, 209) közös nod gének, - az alapváz szintézise nodm D-glükózamin-szintáz noda kitooligoszacharid-aciltranszferáz nodb kitooligoszacharid-deacetiláz nodc N-acetil-glükózaminil-transzferáz, kitooligoszacharid szintézis gazdaspecifikus nod gének - módosítások elhelyezése az alapvázon node nodf nodg nodh nodl nodpq egyéb nod gének telítetlen zsírsav szintézise, β-ketoacil-szintáz telítetlen zsírsav szintézise, acilkarrier-protein telítetlen zsírsav szintézise, β-ketoacil-reduktáz Nod-faktor szulfonálás, szulfotranszferáz a Nod-faktor 6-O-acetilálása a nem redukáló végen szulfát aktiválás nodij Nod-faktor kiválasztás nodn Nod-faktor termelés elősegítése nolfghi Nod-faktor kiválasztás? gén funkció ref. rkpa ketoacilszintáz rkpb aciltranszferáz rkpc dehidratáz rkpd enoilreduktáz rkpe ketoreduktáz rkpf ACP, acilcarrier-protein rkpgh zsírsav módosítás rkpj E.coli kpss homológ, RKP transzport? rkpz (lpsz) E.coli kpsc homológ, RKP lánchossz meghatározás (190) ciklikus glükán szintézis (27) ndva ndvb ciklikus glükán transzport ciklikus glükán szintézis UDP-glükózból Nitrogénkötés (77) nifh nifd nifk nife nifn nifb Fe-protein (dinitrogenáz reduktáz) FeMo-fehérje (dinitrogenáz) α alegysége FeMo-fehérje (dinitrogenáz) β alegysége FeMo-kofaktor szintézis FeMo-kofaktor szintézis FeMo-kofaktor szintézis regulátorgének nodd a nod gének transzkripciós aktivátora, több allél is lehet, gazdaspecifikus inducer felismerés nolr represszora több nod operonnak syrm inducertől független nod gén aktiválás ntrr nitrogén represszió fixabcx fixx fixnoqp fixn fixo fixp elektrontranszport a nitrogenázhoz ferredoxin homológ fehérje, bakteroidspecifikus citokrómoxidáz HemB- és Cu-kötő alegység monohem citokróm-c dihem citokróm-c Invázió EPS I bioszintézis (exopoliszacharid) (138, 140) exoy exof exoa, M, W exol;o; U exoz exoh exov exop, T, Q exob exoc exon exok exor exos, X glikozil transzfer, 1. reakció glikozil transzfer, 1. reakció glikozil transzfer, 2., 4., 7. reakció glikozil transzfer, 3., 5., 6. reakció acetilálás szukcinilálás piruvilálás polimerizáció, export UDP-glükóz epimeráz foszfoglükomutáz? (UDP-glükóz pirofoszforiláz homológ) lánchossz szabályozás? (glükanáz homológ) EPS I termelés represszora EPS I termelés reguláció EPS II bioszintézis (exopoliszacharid) (138, 140) exp expr mucr EPS II bioszintézis EPS II termelés represszora EPS II termelés represszora KPS-bioszintézis (kapszuláris poliszacharid) rkpa-f lipidhordozó szintézise? (123, 172) fixghis fixg fixi transzmembrán fehérjék, redox folyamathoz kapcsolt kationpumpa? ferredoxin-szerű fehérje kation-atpáz homológ fdxn ferredoxin homológ fehérje, elektrontranszport? cychjkl regulátorgének (77) fixl fixj fixk nifa citokróm-c biogenezis (FixO, FixP), citokróm-c hem liáz (118) membránkötött hemoprotein, FixJ foszfatáz/kináz, oxigén szenzor transzkripciós regulátor (fixk, nifa aktivátora) Crp-Fnr homológ transzkripciós aktivátor (fixnoqp, fixghis), de nifa represszor RpoN-függő pozitív regulátor, (nif, fixabcx, fdx, nfe, mos, gének) egyéb gének (195) dcta dctbd mos moc nfe dikarbonsavtranszport, struktúrgén dikarbonsavtranszport, kétkomponensű regulátor rhizopinszintézis (NifA-regulált) rhizopin hasznosítás kompetíció (NifA-regulált) PP.dsc_komp3.doc

20 Célkitűzések Munkánk hosszú távú célja, hogy megismerjük a szimbiotikus gümő inváziójában szerepet játszó bakteriális géneket, és ezen gének szerkezetének, funkciójának és szabályozásának ismeretében megértsük, hogy milyen mechanizmusok révén képes egy baktérium bejutni a gazdanövény sejtjeibe. E célok elérése érdekében korábban már azonosítottunk számos bakteriális mutációt, amelyek a fertőzési folyamatot akadályozták (infekcióban hibás, Inf - fenotípus). A mutánsok segítségével izoláltuk a folyamatban szerepet játszó DNS-szakaszokat (179). Két géncsoport további vizsgálatától remélhettünk új eredményeket, mivel ezekhez hasonlót más laboratóriumokban még nem találtak. A fix-23 régióról előzetes eredményeink alapján feltételeztük, hogy egy felszíni poliszacharid felépítésében vesz részt, amelynek funkciója hasonló az exopoliszacharidokéhoz. A fix-2 régió pedig a gazdanövényben lévő viszonyokhoz való alkalmazkodást segíti. Feltételeztük, hogy ez a géncsoport egy K + /H + antiportert kódol. Mindezek fényében célunk az volt, hogy: (1) megismerjük a fix-23 régióban elhelyezkedő gének szerkezetét és ezen keresztül pontosabban meghatározhassuk funkciójukat; (2) azonosítsuk az összes bakteriális gént, amely ennek az invázióban fontos poliszacharidnak a bioszintézisét meghatározza, és megismerjük szerkezetüket, valamint konkrét funkciójukat; (3) megismerjük a fix-2 régióban elhelyezkedő gének felépítését és az így nyert információ, valamint genetikai, fiziológiai kísérletek segítségével igazoljuk vagy cáfoljuk feltételezésünket, miszerint ez a régió egy K + /H + antiporter szerkezetét határozza meg. PP dsc_komp3.doc

21 21 4. Anyagok és módszerek 4.1. Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok Kísérleteinkben a Sinorhizobium meliloti 41 törzs "kompakt" kolóniamorfológiájú változatát (AK631) használtuk alaptörzsként, amelyről bizonyítottuk, hogy egy exob mutáns, így nem képes exopoliszacharidot (EPS) termelni (182). A mutáns változatokat ebben a genetikai háttérben hoztuk létre random vagy irányított transzpozíciós mutagenezis segítségével, Tn5 vagy Tn10 transzpozonszármazékokat használva. A mutáns törzsek pontos leírása, a mutációk helyzetének megállapítása megtalálható a megfelelő fejezetekben, illetve közleményekben. A kapszuláris poliszacharidot nem termelő mutánsok jellemzésére, illetve később izolálására a 16-3 bakteriofágot alkalmaztuk, amelyről kimutattuk, hogy nem képes a mutáns baktériumok felületéhez kötődni (182). A DNS-klónozás és szekvenciameghatározás céljából a széles körben elterjedt M13 fág, valamint a puc és pbluescript plazmidvektorokat alkalmaztuk. Gazdaként E. coli HB101, JM109 és XL1blue törzseket használtunk (172). Az alkalmazott táptalajok, antibiotikumkoncentrációk, a bakteriofágok növesztési körülményei, a fágteszt leírása megtalálhatók több publikációnkban is (181, 182). A receptormutáns baktériumok és a host range fágmutánsok izolálását az fejezet tartalmazza Géntárak, géntárklónok izolálása Az S. meliloti baktériummal folytatott genetikai munkánál a P1 inkompatibilitási csoportba tartozó prk290 és plafr1 konjugatív plazmidokat, és a plafr1 kozmidban elkészített S. meliloti 41 (AK631) géntár (181) egyes klónjait, illetve ezek transzpozont hordozó mutáns változatait használtuk. A legtöbb esetben az adott mutációt komplementáló géntárklónt növényi teszt segítségével izoláltuk, ahol a szimbiózisra nem képes, mutáns háttérbe bejuttatva a teljes plafr1 géntárat vagy annak egyes csoportjait a vad típusú gént hordozó baktériumok kimutathatók és visszaizolálhatók, mivel működő szimbiózist hoznak létre a lucernával (179). A későbbiekben a pvk102 vektorban (125) is készítettünk egy AK631 HindIII-géntárat (E. Grosskopf, nem közölt eredmények), valamint az Exo + RM41 törzs felhasználásával is előállítottunk egy plafr1 géntárat (Putnoky P., nem közölt eredmények) Transzpozonos mutagenezis A komplemetációval izolált, kilobázisnyi rhizobium DNS-szakaszokon belül direkt transzpozonos mutagenezissel határoztuk meg a számunkra érdekes gének elhelyezkedését. A lambda::tn5 vektorra kifejlesztett és általunk módosított módszert alkalmazva (48, 182) izoláltuk a kanamicinrezisztenciát hordozó, transzpozont tartalmazó kozmid klónokat E. coli sejtekben, majd fizikai térképezéssel meghatároztuk az inszerciók helyzetét. Ezekután az ismert helyzetű mutációkat homológ rekombináció segítségével juttattuk be az S. meliloti genomba (201). A mutáció okozta fenotípust növényi tesztek, fágtesztek, biokémiai és fiziológiai kísérletek segítségével határoztuk meg. A mutációk korrekt beépülését DNS-DNS hibridizáció segítségével ellenőriztük DNS-DNS hibridizáció A Southern-hibridizációt a direkt transzpozonos mutagenezis után létrehozott homogenota mutáns törzsek ellenőrzésére, illetve az egyes rkp gének más baktérium genomokban való jelenlétének vizsgálatára alkalmaztuk. A hibridizációs filtereket a szokásos kapilláris transzfer segítségével készítettük el (204). A hibridizációs próbaként alkalmazott DNS-fragmenteket [α 32 P]dCTP felhasználásával, "random priming" módszerrel jelöltük, és a szokásos módszerek szerint végeztük a hibridizációt, illetve a filterek mosását (204) Szubklónozás, a PCR és a DNS-szekvenciák meghatározás A direkt transzpozonos mutagenezis segítségével behatárolt DNS-szakaszoknak több restrikciós endonukleáz segítségével meghatároztuk a fizikai térképét, és nagyszámú, átfedő szubklónt készítettünk belőlük, amelyek alkalmasak voltak a szekvencia meghatározására. A kísérletek kivitelezéséhez nélkülözhetetlen DNS-izolálást, restrikciós endonukleáz emésztéseket, az in vitro DNSmanipulációhoz szükséges egyéb enzimek (ligázok, foszfatázok, exonukleázok, polimerázok) alkalmazását, a DNS-gélelektroforézist és a transzformációt a szokásos eljárások szerint végeztük el (204). A kérdéses DNS-szekvenciát a didezoxi láncterminációs módszer segítségével mindkét szálon meghatároztuk, az Amersham vagy a USB cégek által forgalmazott kitben megadott módszernek megfelelően. Az rkp-3 régióhoz kapcsolódó szekvenciameghatározásokat már egy ABI automata szekvenálókészülék segítségével végeztettük el. A polimeráz láncreakciót (PCR) DNS-szekvenciák detektálására, mutáns allélok izolálására használtuk, főleg a 16-3 fágreceptorral kapcsolatos munkánkban (178). A reakciókörülmények és az alkalmazott oligonukleotidok leírása ott megtalálható A meghatározott DNS-szekvenciák főbb jellemzői és regisztrációs számai Minden meghatározott DNS-szekvenciát beküldtünk az EMBL "Nucleotide Sequence Database" adatbázisba. A szekvenciák jellemzőit a 4.6. táblázat foglalja össze táblázat: A meghatározott DNS-szekenciák jellemzői a szekvencia regisztrációs a régió neve hossza ref. szám (bázispár) X64131 rkp-1 (korábban bp (123, 172) AJ fix-23 ) rkp bp (117) AJ rkp bp (120) AJ rkpy 5955 bp (189) X93358 phaa-g (korábban fix-2 ) AJ h (host range, 16-3 fág) 7888 bp (180) 2295 bp (178) PP.dsc_komp3.doc

22 A szekvenciák számítógépes kiértékelése A meghatározott DNS-szekvenciát és a belőle következtetett fehérjeszekvenciákat a University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG) programcsomag (52) segítségével elemeztük (TRANSLATE, MAP, FASTA, BLAST) VAX vagy UNIX rendszeren, illetve a világhálón elérhető programok és adatbázisok segítségét is igénybe vettük (177). A kódolt fehérjék valószínűsítésére, a hasonlóságok elemzésére a GCG-programcsomag CODONUSAGE és CODONPREFERENCE programjait (120), az NCBI honlapján elérhető BLAST (3) programot ( a feltételezett membránfehérjék elemzésénél a TopPred programot (38), a funkcionális domének predikciójára pedig a GCG MOTIFS programot, illetve az ExPASy Molecular Biology Server honlapon ( található eszközöket alkalmaztuk. A számítógépes predikciókat sok esetben biológiai kísérletekkel igazoltuk a Tn10LK és a TnphoA transzpozonok által létrehozott 'lacz és 'phoa transzlációs fúziók segítségével (123, 172, 180) A nyitott leolvasási keretek igazolása: Tn10LK és TnphoA transzpozonok Mindkét transzpozon egy promoter és transzlációs startkodon nélküli riportergént hordoz, amely transzlációs fúziók létrejötte után nyilvánul csak meg az eltalált gén promoteréről. A Tn10LK egy lacz (β-galaktozidáz), míg a TnphoA egy phoa (alkalikus foszfatáz) gént tartalmaz (147, 236). A phoa fúzió megnyilvánulásának másik feltétele, hogy a fúziós hely előtt kell lennie legalább egy transzmembrán doménnak, amely a létrejött fúziós fehérje C-terminális részét a periplazmikus térbe orientálja. Az alkalikus foszfatáz ugyanis csak itt válik aktívvá. A TnphoA segítségével így egyszerre határozhatjuk meg a transzmembrán fehérjék génjeinek helyes leolvasási keretét és a fehérjén a kifele irányuló transzmembrán domének elhelyezkedését (148). A transzpozonos mutagenezist a 4.3. fejezetben említett módszerrel, a megfelelő kozmid klónok felhasználásával végeztük el. A transzpozonok beépülésének pontos helyét az egyes fúziós helyek klónozása és DNS-szekvenciájuk meghatározása révén azonosítottuk. A β-galaktozidáz és az alkalikus foszfatáz aktivitásának meghatározására a szokásos eljárásokat alkalmaztuk (172, 180) A kapszuláris poliszacharid és lipopoliszacharid kimutatása A különböző S. meliloti törzsekből forrófenolos extrakcióval vontuk ki a poliszacharidokat, poliakrilamidgélelektroforézissel (DOC-PAGE ) választottuk el őket, és alciánkék festéssel mutattuk ki a gélen található különböző lánchosszúságú KPS- és LPS-sávokat (121, 172, 187). A baktériumsejtek felszínén lévő KPS-molekulákat fágteszt vagy KPS-specifikus poliklonális ellenanyag segítségével mutattuk ki (123) Fiziológiai kísérletek, a K + - és a Na + -transzport mérése A fix-2 (pha1) régió mutánsainak jellemzésére fiziológiai kísérleteket végeztünk. Meghatároztuk K- érzékenységüket és ennek ph-függését (180). Az iontranszport-mérésekhez a sejteket TA táptalajban növesztettük fel, majd 0,4 M NaCl, 10 mm KCl és 5 mm TRIS-HCl (ph:7,5) pufferben szuszpendáltuk. A megfelelő kezelések után ( fejezet) az intracelluláris K-, illetve Na-tartalmat lángfotometria segítségével elemeztük (180) Szimbiotikus növényi tesztek A különböző S. meliloti törzsek szimbiotikus képességét növényi tesztek segítségével határoztuk meg. Nitrogénmentes növényi táptalajon steril lucernacsíranövényeket fertőztünk a vizsgálni kívánt baktériumokkal. Az invázióra és nitrogénkötésre képes törzsek esetében a növényeken rózsaszín szimbiotikus gümők jelentek meg (2 3 hét). Ezek a növények 4 8 hét elteltével erőteljesen megnőttek és sötétzöldek voltak, szemben a sárgás színű és a nitrogénéhezés jeleit mutató, fertőzetlen vagy ineffektív gümőket hordozó növényekkel (179). PP dsc_komp3.doc

23 23 5. Eredmények 5.1. Az rkp-1 régió a KPS-szintézishez szükséges lipidhordozó előállítását kódolja Az rkp-1 géncsoportot a fix-23 mutáció segítségével azonosítottuk, és a mutációt komplementáló kozmid klónokat növényi teszt segítségével izoláltuk (179). A Tn5 transzpozon okozta mutáció a kromoszóma pyr-29 és pyr-2 markerei közelében térképeződött. A régió direkt Tn5 transzpozonos mutagenezise bizonyította, hogy több mint 10 kb kiterjedésű, az invázióban szerepet játszó géncsoport található ezen a ponton, amelyet genetikai komplementációs kísérleteink szerint négy komplementációs egység alkot ( ábra). Érdekes, hogy a géneket érintő mutációk nemcsak a szimbiotikus gümő invázióját gátolják. A mutáns baktériumok rezisztenssé válnak a 16-3 bakteriofággal szemben is (182). Ez utóbbi fenotípust a későbbiekben kiválóan fel tudtuk használni további gének izolálásában és a gének jellemzésében is Az rkp-1 régió génfúziókkal történő analízise Az rkp-1 régióban található gének szerepének megismerése céljából a régió bázissorrendjének meghatározását terveztük. A szekvenciaadatok kiértékelését segítendő a régiót hordozó kozmid klónon (ppp428) aktív 'lacz transzlációs fúziókat izoláltunk a Tn10LK transzpozon alkalmazásával ( és ábra). Ezek pontos elhelyezkedését és a fúzió irányát fizikai térképezéssel határoztuk meg, és a későbbiekben több reprezentatív fúzió pontos szekvenciáját is meghatároztuk. Eredményeink szerint minden aktív fúzió egy irányba mutatott, jelezve hogy az érintett gének transzkripciója azonos irányban történik. A fúziós szekvenciák pontos meghatározásával azt is igazolni tudtuk, hogy a régió DNS-szekvenciájának számítógépes elemzésével géneknek prediktált nyitott leolvasási keretek (ORF-ek) valóban fehérjéket kódoló szekvenciákat takarnak. Ezeket az eredményeket a feltételezett géntermékek fehérje-adatbázisokkal való összehasonlítása is megerősítette ( és fejezet) Az rkpabcdef gének a zsírsavszintáz doménjeihez hasonló alegységeket kódolnak Meghatároztuk az első komplementációs egységet lefedő teljes DNS-szekvenciát, és ennek számítógépes elemzése hat kódolórégió (ORF1-6, új nevükön rkpabcdef gének) meglétét valószínűsítette. A gének helyes behatárolását a Tn10LK transzpozonnal végzett fúziós kísérletek eredményei is megerősítették. Az egyes kódoló régiók egyforma orientációja és szoros egymás utáni elhelyezkedése arra utalt, hogy azok egy transzkripciós egységet alkotnak ( ábra). A feltételezett fehérjetermékek számítógépes elemzése meglepő eredményre vezetett. Ellentétben várakozásunkkal miszerint poliszacharid-bioszintézisben részt vevő fehérjékkel találunk hasonlóságokat az egyes fehérjék szignifikáns hasonlóságot mutattak a patkány zsírsavszintáz (FAS) multifunkcionális fehérje egyes doménjeivel. Így az RkpA a ketoacilszintáz, az RkpB az aciltranszferáz, az RkpC a dehidratáz, az RkpD az enoilreduktáz, az RkpE a ketoreduktáz, míg az RkpF az acilhordozó alegységgel mutatott erősebb hasonlóságot. Komplementációs kísérletekben a különböző rkp géneket az erős p lac promoter után beépítve sem sikerült a megfelelő hőérzékeny, letális E. coli mutánsoknál (fabbf, fabd) a vad fenotípust helyreállítani (172). Ez az rkp mutánsok fenotípusával együtt arra utalt, hogy az rkp gének feltehetően nem a "háztartási" zsírsavszintázt kódolják. Mivel ez az enzim létfontosságú, a megfelelő S. meliloti gének mutációjának is letális fenotípussal kellene rendelkeznie ábra: Az rkp-1 (fix-23) régió fizikai-genetikai térképe A függőleges vonalak a Tn5 inszerciók beépülési helyét jelzik. Az egyes inszerciók fölött feltüntettük az inszerció számát és a mutáció fenotípusát. Fix(-) jelzi, ha a mutáns baktérium nem képes a szimbiotikus gümő inváziójára. A 16-3 (R) azt jelenti, hogy az inszerciót hordozó baktériumokon a 16-3 bakteriofág nem képes szaporodni. A fizikai térkép (E: EcoRI) fölötti fekete vonalak a komplementációs egységeket jelzik (182). PP.dsc_komp3.doc

24 ábra: Az rkp-1 (fix-23) régió első komplementációs egységét alkotó gének. Felül: a függőleges vonalak azokat a Tn5 inszerciókat jelzik, amelyek beépülési helyét a DNS-szekvencia szintjén is meghatároztuk. Középen: a régió fizikai térképe (AluI, BalI, BamHI, BglII, EcoRI, HindIII, PstI, SalI, SmaI, SphI) és a feltételezett gének elhelyezkedése (csíkozott téglalapok) látható. Üres téglalapok jelzik a komplementációs egységek elhelyezkedését. Az ORF1 - ORF6 névvel jelzett gének később az rkpabcdef nevet kapták (123). Alul: a Tn10LK transzpozon segítségével izolált transzlációs fúziók helye és irányultsága látható. A négyzetekben számok jelzik az egyes fúziók által mutatott β-galaktozidáz enzimaktivitásokat. Legalul az inszerciók kódszáma látható ábra: Az rkp-1 (fix-23) régió II-IV. komplementációs egységét alkotó gének (a): A Tn5 inszerciók (függőleges vonalak) által okozott változások a 16-3 fággal szembeni rezisztencia (16-3 R), illetve a szimbiózis kialakulásának hiánya (Fix -). (b): Az rkp gének (A-J) és komplementációs csoportok (I-IV) helyzete a régió fizikai térképét ábrázoló szakaszon. (AluI, BamHI, EcoRI, HindIII, SacI, SacII, SalI, SmaI, SphI) (c) A DNS-szekvencia meghatározására felhasznált, első átfedő klónok (ppp775, ppp933), illetve a Tn10LK transzpozon segítségével izolált transzlációs fúziók helye és irányultsága látható ( fejezet). A négyzetekben számok jelzik az egyes fúziók által mutatott β-galaktozidáz enzimaktivitásokat. Legalul az inszerciók kódszáma látható. PP dsc_komp3.doc

25 Az rkpgh, rkpi és rkpj gének szerkezete Az rkp-1 régió II., III. és IV. komplementációs egységeinek DNS-szekvenciáját is meghatároztuk. Négy gént tudtunk ebben a régióban azonosítani ( ábra). Az rkpg gén terméke bizonyos aciltranszferázokkal mutat rokonságot. Az elemzés elvégzésekor a legerősebb hasonlóságot a HemA fehérjével mutatta, amely a deltaaminolevulinsav szintézisében játszik szerepet. A fehérjeszekvencián két feltételezett transzmembrán domén között megtalálható az a jellegzetes GTLSKTTSS motívum, amelyet a piridoxál-foszfát (PEP) prosztetikus csoport kötőhelyeként ismernek. Az rkph gén feltételezett terméke a ribitol típusú dehidrogenázokkal mutatta a legnagyobb hasonlóságot. Megtalálható rajta az erre az enzimcsaládra jellemző YCASKFALNGF motívum és egy feltételezett NAD(P)H kötőhely is. Az rkpi gén terméke hat feltételezett transzmembrán domént tartalmaz, de nem mutatott semmilyen ismert fehérjével hasonlóságot. Végül az rkpj gén terméke az E. coli KpsS fehérjéjével homológ, amely szükséges a kapszuláris poliszacharid sejtfelszínre történő transzportjához (123). A gének helyes meghatározását a Tn10LK transzpozonnal végzett fúziós kísérletek eredményei is megerősítették ( ábra) Az rkp gének egy új típusú poliszacharid bioszintéziséhez szükségesek Együttműködésben R. W. Carlson és B. Reuhs amerikai kutatókkal elvégeztük az rkp mutánsok felszíni poliszacharidjainak jellemzését. A fágtapadási tesztekből és a mutánsok által termelt poliszacharidok előzetes vizsgálatából már látszott, hogy az rkp-1 régió nagy valószínűséggel egy felszíni poliszacharid bioszintéziséhez szükséges. A különböző mutánsokból forrófenolos módszerrel kinyert és poliakrilamid gélen elválasztott poliszacharid-minták összehasonlításából kiderült, hogy nem az LPS ahogy azt korábban feltételeztük (182), hanem egy, a rhizobiumokban eddig még le nem írt poliszacharid termelődését gátolják a mutációk. A mutánsokból kimutatható LPS elválasztási mintázata ugyanis megegyezett a kontroll törzsével (AK631), ami világosan látszott azokon a géleken, amelyeknél az LPSspecifikus ezüstfestéses módszert alkalmaztuk. A kapszuláris poliszacharidok kimutatására használatos alciánkék-ezüstfestéses módszerrel viszont csak a kontroll baktériumból tudtunk kimutatni egy, az LPS-nél alacsonyabb mobilitású, tehát nagyobb molekulatömegű, nagy mennyiségű anyagot, amely a mutánsokból hiányzott ( ábra). A festési eljárás a mutáns baktériumokból készített minták esetén is láthatóvá tett egy kisebb molekulatömegű, sok elkülönült sávban futó anyagot is, amelyet a poliszacharid sokkal kevesebb alegységből álló változatának gondoltunk. Amerikai partnereink a poliszacharid tisztításával és előzetes kémiai analízisével bizonyították, hogy ennek egyik fő komponense valószínűleg a keto-deoxi-oktulonsav (Kdo) vagy annak származéka. A fágtapadási tesztek eredményeit a vad típusú baktériumok felhasználásával készített poliklonális ellenanyaggal végzett immunoblott kísérletek megerősítették. A nagy molekulatömegű, Kdo-tartalmú poliszacharid valóban a vad típusú baktérium felszínén található, és az rkp-1 mutánsok többségéből teljesen hiányzik ( ábra) ábra: Az rkp-1 régió génjei és a mutánsok KPS-termelése (A) Az rkpa-j gének elhelyezkedése. (B) A mutánsokból izolált poliszacharid DOC-PAGE elválasztási képe. LMW/HMW: kis/nagy molekulatömegű KPS. PP.dsc_komp3.doc

26 26 Eredményeink és partnereink itt nem említett egyéb vizsgálatai is arra utaltak, hogy az S. meliloti 41 egy törzsspecifikus poliszacharidot termel, amely felépítésében nagyon hasonló az E. coli törzsek esetében leírt II. típusú K- antigénekhez, azaz kapszuláris poliszacharidokhoz (172). Ez az S. meliloti 41 törzsre jellemző kapszuláris poliszacharid később a K R 5 antigén nevet kapta (187). Mára már ismert, hogy a diszacharid alegységek egy glükuronsavból (GlcA) és egy 5,7-diamino-3,5,7,9-tetradeoxi nonulozonsavból (pseudaminsav; Pse) áll, amelyen 7-N-acetil és 5-N-βhidroxibutiril módosítások is találhatók, így pontos rövidítése: Pse5NAc7N(β-OH-But) (187, 188; Reuhs és Glushka, nem közölt eredmények) Az rkp-1 régió feltételezett szerepe a KPSbioszintézisben Előző eredményeink jelezték, hogy a KPS termelésében szerepet játszó rkp-1 régió génjei (rkpabcdef és rkpghi) egy zsírsavszintáz komplexet kódolhatnak, amely nagy valószínűséggel a KPS-bioszintézishez szükséges lipidhordozó molekulák előállítását, módosítását végzi (123, 172). Az rkpj gén pedig a poliszacharid transzportjához lehet szükséges. Az a tény, hogy az rkp-1 mutánsok még termelik a KPS kisebb molekulatömegű, változó lánchosszúságú változatait amelyek a sejten belül halmozódnak fel (ellenanyaggal a sejtfelszínen nem mutathatók ki, ), azt jelzi, hogy az rkp-1 régió által meghatározott lipidhordozó csak a KPS-bioszintézis befejezéséhez és transzportjához szükséges. Valószínű, hogy a bioszintézis első része egy más típusú lipidhordozó segítségével valósul meg. Nem találtunk tehát az rkp-1 régióban olyan géneket, amelyeknek a cukor alegységek bioszintézisében vagy a KPS polimerizációjában lehetne szerepe. Ezért a további munka célja ezeknek a géneknek az azonosítása volt Az rkp-2 régió mutánsai az LPS-bioszintézisben is hibásak Az rkp-2 régióban elhelyezkedő gének behatárolásához szintén az irányított Tn5 mutagenezis módszert alkalmaztuk. Egy 5.5 kb nagyságú BamHI fagmenten belül sikerült olyan inszerciókat azonosítanunk, amelyek deoxikolsav (DOC) érzékenységet, 16-3 fágrezisztenciát és Inf - fenotípust eredményeztek. Más mutációk csak deoxikólsav- (DOC) érzékenységet okoztak. Ez utóbbi fenotípus E. coli és más Gram-negatív baktérium esetében is bizonyos LPSbioszintézishibák előfordulását jelzi. Megvizsgálva a mutánsok által létrehozott KPS és LPS elválasztási képét, DOC-PAGE segítségével igazoltuk, hogy azok valóban hibásak az LPS-szintézisben is. A mutánsok KPS szerkezete korrelált a fágszenzitív / Inf - fenotípussal, azaz a fágrezisztens/inf - mutánsok esetén nem tudtunk kapszuláris poliszacharidot kimutatni, míg a többi törzsnél a KPSmintázat a kontroll törzsével (AK631) megegyezett ( ábra). Ez arra utalt, hogy legalább két, különböző funkcióval rendelkező gén található ebben a régióban Az rkp-2 régió szükséges a KPS és az LPS bioszintéziséhez is A KPS-bioszintézisben szerepet játszó új géncsoportok azonosítása Az új gének azonosítása céljából először egy random Tn5 transzpozonos mutagenezist végeztünk az S. meliloti 41 törzsön (AK631). A lehetséges mutánsok kiszelektálására a 16-3 bakteriofágot alkalmaztuk, amelyről feltételeztük, hogy nem képes szaporodni egyetlen KPS-bioszintézisben hibás mutánson sem, így azok a fág jelenlétében is képesek telepeket alkotni. A fágrezisztens törzsek közül először kiválogattuk azokat, amelyek nem tudták a felületükön megkötni a bakteriofágot, majd genetikai komplementációs kísérleteket végeztünk a mutációk helyének megállapítására. Hat újonnan izolált mutáns törzs fágérzékenységét nem tudtuk az rkp-1 régió bejuttatásával helyreállítani, így feltételeztük, hogy az ezekben lévő mutációk még ismeretlen rkp géneket érintenek. A már jól bevált módszerrel (növényi teszt, 4.2.) izoláltuk az új mutációkat komplementáló kozmid klónokat az S. meliloti géntárból, és restrikciós térképezéssel, hibridizációs, valamint komplementációs kísérletek segítségével jellemeztük őket. Két, egymástól független régiót tudtunk így azonosítani. Az elsőt, amelyet a pat330 kozmid klón képvisel, rkp-2, a másodikat amely sokkal nagyobbnak tűnt, mivel csak két kozmid (pat399, pat401) tudta lefedni rkp-3 régiónak neveztük el (117) ábra: rkp-2 mutánsok poliszacharidjainak DOC-PAGE elválasztási képe KPS: ezüstfestés alciánkék kezelés után. LPS: ezüstfestés Nameta-perjodát kezelés után. A nyíl a vad típusú mintában jelen lévő, de a mutánsok esetében hiányzó LPS-sávot mutatja. A KPSmintázat csak a Tn5(207) mutáció esetében változik. Az inszerciók helyzete az ábrán látható Az rkp-2 régió az UDP-glükuronsav szintézisében vesz részt Meghatároztuk a Tn5 mutagenezissel behatárolt régió DNS-szekvenciáját és a szekvenciaadatokat számítógéppel elemeztük, illetve a feltételezett géntermékek szekvenciáját összehasonlítottuk különböző fehérje-adatbázisokkal. Két, azonos irányba mutató leolvasási keretet (ORF) találtunk a mutációk által érintett szakaszon. Az ORF1 által kódolt aminosav-szekvencia jelentős hasonlóságot mutatott olyan epimerázokkal, amelyek szubsztrátjai különböző nukleotid-difoszfo-cukorszármazékok. PP dsc_komp3.doc

27 27 A legnagyobb hasonlóságot a CapI fehérje mutatta, amely a Staphylococcus aureus kapszuláris poliszacharid bioszintézisében, nevezetesen az N-acetil-aminogalakturonsav szintézisében játszik szerepet. Egy másik, közeli rokon fehérje a Streptococcus pneumoniae UDPgalakturonsav epimeráz (Cap1J) enzime. Az ORF2 által feltételezhetően kódolt fehérje szekvenciája jelentős homológiát mutatott különböző nukleotid-difoszfo-cukor dehidrogenázokhoz. A legnagyobb egyezést az UDP-glükóz dehidrogenázokkal kaptuk. A különböző mutánsokban található Tn5 inszerciók helyét szekvenciaanalízissel is meghatároztuk. Megállapítottuk, hogy csak az ORF2-ben lévő mutációk eredményeztek KPS -, fágrezisztens és Inf - fenotípust [Tn5(207) az ábrán], ezért az érintett gént rkpk génnek neveztük el. Az ORF1-ben található mutáció csak az LPS szerkezetét befolyásolta [Tn5(238) az ábrán], ezért ez egy rhizobiális LPS génnek tekinthető, amely az lpsl nevet kapta. A vad típusú, valamint az rkpk, illetve az lpsl génekben hibás baktériumból szolubilis fehérje-preparátumot készítettünk, és meghatároztuk a minták UDP-glükózdehidrogenáz aktivitását. A kontroll törzsben a specifikus enzimaktivitás 1.82 mu mg -1 min -1 volt. Azokban a törzsekben, amelyek a Tn5(231) vagy a Tn5(207) mutációt hordozták (rkpk gén) ez az aktivitás nem volt kimutatható, viszont a komplementáló kozmidot tartalmazó mutáns törzsekben az aktivitás közel kilencszerese volt a kontrollértéknek (117) ábra: Az rkp-2 régió azonosított génjei Felül a pat330 kozmid inszertjének fizikai térképe látható. E: EcoRI, B: BamHI. A téglalappal jelzett és az ábra alsó felén kinagyított szakasz DNS-szekvenciáját határoztuk meg. Alul a számokkal jelzett Tn5 inszerciók fenotípusa és a gének elhelyezkedése látható. Fix - : invázióra képtelen, Doc S : deoxikolsav-érzékeny, 16-3 R : 16-3 fágra rezisztens ábra: Az rkp-3 régió mutációs analízise A függőleges vonalak az egyes Tn5 inszerciók helyét jelzik. A vonalak hossza a feliratnak megfelelően a fenotípust jelzi. A Tn5(158), Tn5(168) inszerciók (szürke négyzet) a fágrezisztenciát okozó mutációkhoz hasonlóan, gátolják az inváziót (Inf - fenotípus). A többi inszerció fenotípusa a vizsgált szempontok tekintetében nem különbözik a vad típusú baktériumétól. PP.dsc_komp3.doc

28 ábra: Az rkp-3 régió génjei és a mutánsokra jellemző KPS elválasztási képe Felül: A Tn5 inszerciók helyét mutató függőleges vonalak hossza jelzi a mutációk fenotípusát. Hosszú: Inf -, 16-3 S, közepes: Inf -, 16-3 R, rövid: Inf +, 16-3 S. A DNS-szekvencia elemzése és a mutánsok fenotípusa hat rkp gén meglétét bizonyítja (szürke és fekete nyilak). A hetedik (rkpz) gén bázissorrendje és szerepe már ismert volt (28, 190). A fehér nyilak által képviselt gének mutációja nem befolyásolja a szimbiózis kialakulását vagy a KPS-termelést (további magyarázat a jelen és az fejezetben). Alul: A mutánsokra jellemző poliszacharid DOC-PAGE elválasztási képe. LMW/HMW: kis/nagy molekulatömegű KPS Az rkp-3 régió kódolja a K R 5 antigénre jellemző pszeudaminsav bioszintézisét Fágrezisztens mutánsok és komplementációs kísérletek segítségével azonosítottuk a pat399 és pat401 kozmidok klónok által képviselt rkp-3 régiót (117). Feltételeztük róla, hogy az S. meliloti 41 törzsre jellemző kapszuláris poliszacharid, a K R 5 antigén jellegzetes cukor alegységének (pszeudaminsav, Pse) a bioszintéziséért lehet felelős Az rkp-3 régió számos, csak a KPS-termelésért felelős gént tartalmaz A gének elhelyezkedését az rkp-3 régióban is irányított Tn5 transzpozonos mutagenezissel állapítottuk meg. Több mint 40 mutációt hoztunk létre a régióban, és minden mutáns törzset megvizsgáltunk a 16-3 fággal szembeni érzékenységre, KPS- és LPS-termelésre, valamint szimbiotikus tulajdonságokra is ( ábra). Eredményeink azt jelzik, hogy az rkp-3 régió ellentétben az rkp-2 régióval több mint 20 kb kiterjedésű és számos rkp gént tartalmaz. Minden inszerciós mutáns, amely hibás volt a KPS termelésben, egyben Inf - fenotípust is mutatott, kivéve a Tn5(158) és Tn5(168) mutációt hordozó törzseket. Érdekes módon ez utóbbi kettő érzékeny volt a 16-3 fágra. Nem találtunk az rkp-3 régióban olyan mutációt, amely az LPS termelést is befolyásolta volna. Érdemes még megemlíteni, hogy a DOC-PAGE analízis alapján a régió mutánsai három csoportra oszthatók. A Tn5(35), Tn5(66) és Tn5(232) inszerciót hordozó mutánsok viszonylag nagy mennyiségű, KPS-re jellemző festődést mutató anyagot termelnek, amely a gélen a kis molekulatömegű régióban jelenik meg (5.4. fejezet). A Tn5(158) és Tn5(168) mutációt hordozó baktériumok (amelyek fágérzékenyek maradtak) szintén termelnek egy kis molekulatömegű anyagot, még kimutatható mennyiségben. Ezekkel ellentétben a harmadik csoport mutánsaiból KPS-szerű anyagot nem tudtunk kimutatni, tehát a bennük lévő mutációk a bioszintézis alapvető lépéseit érinthetik ( fejezet) PP dsc_komp3.doc

29 táblázat: Az rkp-3 régió génjei Rkp protein motívum (feltételezett funkció) homológ protein eredet fehérje funkciója azonos/ hasonló (%) Ref. RkpL NAD-függő epimerázok/ dehidratázok (dndp-hexóz dehidratáz/ epimeráz) Jhp0778 Cap5E FlmA Helicobacter pylori Staphylococcus aureus Aeromonas caviae cukor-nukleotid-szintézis UDP-glükóz epimeráz O-antigén-bioszintézis 54/70 42/58 53/69 (2) (206) AAD45656 RkpM DegT/ DnrJ/ EryC1/ StrS ( amino-cukor bioszintézis protein vagy aminotranszferáz) FlmB SpsC WlbF Aeromonas caviae Methanococcus jannaschii Bordatella bronchiseptica O-antigén-bioszintézis Poliszacharid szintézis amino-cukor-szintézis 66/79 35/56 35/50 AAD45657 (29) CAA07666 RkpN RkpO (Pse-aktiválás) (transzferáz) NeuA NeuA KpsU FlmD FlaR SpsG/H Aeromonas caviae E.coli E.coli Aeromonas caviae Caulobacter crescentus Methanococcus jannaschii O-antigén-szintézis CMP-NeuNAC-szintézis CMP-KDO-szintézis O-antigén-szintézis flagelláris protein poliszacharid-szintézis 59/73 26/42 28/54 37/52 32/46 27/48 AAD (242) (168) AAD45659 U27302 (29) RkpP acetiltranszferázok (transzferáz) FlaG SpeG Caulobacter crescentus E. coli flagelláris protein acetiltranszferáz 38/56 26/48 U28867 (87) RkpQ (Pse szintézis) NeuB NeuB NeuB Aeromonas caviae Helicobacter pylori E.coli O-antigén-szintézis sziálsav-szintáz NeuNAC-kondenzáció 64/78 42/59 32/50 AAD45660 (227) (6) RkpR (KPS-export a periplazmikus téren keresztül) KpsE BexC CtrB E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis KPS-export protein 28/50 27/51 27/50 (200) (133) (85) RkpS ABC transzporter (KPS-export a sejtmembránon keresztül) KpsT BexA CtrD E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis KPS-export protein 48/67 44/65 47/66 (167) (133) (85) RkpT ABC-2 típ. transzporter (KPS-export a sejtmembránon keresztül) KpsM BexB CtrC E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis KPS-export protein 31/56 25/57 24/55 (167) (133) (85) RkpZ (lánchossz-meghatározás) LpsZ KpsC LipA R. meliloti E.coli Neisseria meningitidis LPS-módosító protein KPS-export protein KPS-módosító protein 100/0 40/56 37/53 (28) (168) (86) Az rkp-3 régióban kódolt fehérjék hasonlóak különböző cukor-bioszintézis enzimekhez és KPStranszportfehérjékhez Az elmúlt évek során a Tn5 mutagenezissel behatárolt régiók ( ábra) és a fontosabb Tn5 inszerciók beépülési helyének bázissorrendjét is meghatároztuk. A szekvenciaadatokat elemezve számos új gént sikerült azonosítani ( ábra), amelyek feltételezett terméke valamilyen cukor-, illetve poliszacharid-bioszintézisben részt vevő, ismert fehérjéhez hasonló. Az átlagos hasonlóság minden esetben 50 % körüli. Bár ez nem elég nagy ahhoz, hogy a fehérjék szerepét megbízhatóan prediktálni lehessen, mégis jó irányt adhat e gének szerepét elemző további munkáknak. Az rkp-3 régióban a szekvenciaanalízis adataiból kiindulva négy transzkripciós egység meglétét feltételezhetjük ( ábra). Azok a nyitott leolvasási keretek, amelyek a feltételezett rkplmnopq géneket reprezentálják, egy irányban és szorosan egymást követve helyezkednek el. E gének hibája általában a KPS-szintézis teljes elmaradásához vezet. Kivételt képeznek az rkpo génben hibás mutánsok, amelyek még termelnek egy kis molekulatömegű anyagot és rossz hatásfokkal ugyan, de tudja őket fertőzni a 16-3 fág is. Szimbiózis kialakítására viszont, a többi mutánshoz hasonlóan, nem képesek. Érdekes, hogy az rkpo génben elhelyezkedő Tn5 inszercióknak nincs poláris hatása, hiszen az rkpp és rkpq mutánsoknál "enyhébb" fenotípussal rendelkeznek. Poláris hatás esetén ugyanolyan fenotípusnak kellene megjelennie mindhárom esetben. Az rkplmnopq géncsoporttól jobbra és velük ellentétes irányultsággal helyezkednek el az rkpr, valamint az rkpts transzkripciós egységek. Ezeket a géneket csak az PP.dsc_komp3.doc

30 30 általuk kódolt, feltételezett fehérjékre való tekintettel soroltuk az rkp gének közé, talán kissé elhamarkodottan. Látszólagos ellentmondásban a feltételezett funkciókkal az rkpr, valamint az rkpts génekben bekövetkezett mutációk nem befolyásolják a KPS-bioszintézist ( ábra) és nincsen semmilyen negatív hatásuk a szimbiózis kialakulására. Pedig az RkpR fehérje nagyfokban hasonlít a KpsE fehérjére, amelynek hiányában nincs KPS-szintézis a mutációt hordozó E. coli baktériumban. Ugyanez vonatkozik az RkpS és RkpT feltételezett fehérjékre is, amelyek homológok a KPS transzportjához nélkülözhetetlen ABC-transzporter alegységeket alkotó KpsT és KpsM E. coli fehérjékkel ( táblázat). Az rkp-3 régióban található az rkpz gén is, amelyről mások már korábban beszámoltak. Az rkpz (korábbi nevén lpsz) a KPS-bioszintézis késői szakaszában játszik szerepet. A mutánsok egy megváltozott molekulatömegű poliszacharidot termelnek és sérültek az invázió folyamatában (28, 190). A fent felsorolt és az táblázatban bemutatott eredmények megerősítik azt a feltételezést, hogy az rkp-3 régió hordozza azoknak a géneknek jelentős részét, amelyek a KPS diszacharid alegységének felépítésében vesznek részt táblázat: Az rkp génekkel homológ szekvenciák jelenléte rokon baktériumokban Génspecifikus hibridizáció Baktérium* rkpl rkpm rkpn rkpr rkps rkpz rkpk rkpe rkpj M. loti A. tumefaciens A. rhizogenes R. galagae S. meliloti NRG S. meliloti NRG S. meliloti S. meliloti S. meliloti 1322* nt nt ++ nt nt nt nt nt nt S.fredii USDA S. fredii USDA S.fredii USDA R. sp. NGR R.leguminosarum R. trifolii ANU A. caulinodans R. spheroides X. campestris (-) nem tudtunk kimutatni hibridizációt, azaz a gén nincs jelen vagy nem eléggé konzerválódott, (+) gyenge, (++) közepes vagy (+++) erős hibridizációs jelet kaptunk, azaz a szekvencia jelen van a genomban (nem feltétlenül funkcióképes), (nt) nem tesztelt. (*): a táblázatban nem szereplő, de az rkpc, rkpn és rkpy szekvenciák jelenlétére vizsgált további S. meliloti törzsek a következők: 2011, F51, GR4, Ve8, cc2003, S26, 311, cc2013, U45, Balsac, Sa10, V7, 102F51, SU47, cc Az rkp-3 régió törzsspecifikus géneket tartalmaz Az eddig megismert kapszuláris poliszacharidok törzsre jellemző variációt mutatnak, bár közös szerkezeti elemeik is vannak. Ez azt jelenti, hogy az újonnan megismert rkp gének között törzsspecifikus "egyedi" gének is lehetnek, amelyek nem találhatók meg a rokon fajokban, de még más S. meliloti törzsekben sem. A KPS szerkezete, illetve a különböző rkp gének jelenléte fontos tényezői lehetnek egy gazdanövény sikeres inváziójának. Ezért fontos, hogy megismerjük egy adott KPS szerkezetét, illetve a KPSbioszintézis genetikai hátterét. DNS-hibridizációs kísérletek segítségével vizsgáltuk a különböző rkp régiókat reprezentáló gének előfordulását 20 különböző S. meliloti tözsben és más rokon baktériumokban. A gazdaspecifikusnak feltételezett rkp-3 szekvenciák (rkpm, rkpn) valóban csak az S. meliloti 41 törzsben voltak kimutathatóak. Ellenben az rkp-3 régióban elhelyezkedő, KPS-transzportért felelős (feltételezett) rkpr és rkps szekvenciákat más Sinorhizobium fajokban megtaláltuk. Ehhez hasonlóan az rkp-1 és rkp-2 régióba tartozó és szintén általánosabb szerepet ellátó rkpe, rkpj illetve rkpk szekvenciákat szintén megtaláltuk más rokon törzsekben (5.3.3.táblázat) Az rkp gének kodonhasználata horizontális géntranszferre utal Baktériumokban a fajok közötti géncserére vagy génátadásra sokkal gyakrabban kerülhet sor, mint magasabbrendű szervezetekben. Ennek a "horizontális géntranszfer"-nek a nyomait az egyes kódoló szekvenciák eltérő kodonhasználatában is felfedezhetjük. Az rkp gének DNS-szekvenciájának elemzése során észrevettük, hogy több gén eltérő GC-tartalommal rendelkezik, illetve más kodonokat részesít előnyben (kodonpreferencia), mint egy átlagos rhizobium gén. Hogy ezt a jelenséget pontosabban leírjuk, számítógépes elemzések segítségével elkészítettük számos gén kodonhasználati táblázatát és összehasonlítottuk azokat egymással. Az elemzések alapján (4.7. fejezet) legalább három csoportba tudtuk a vizsgált szekvenciákat besorolni. Az alap "háztartási" gének rendelkeztek a legnagyobb GC-tartalommal (62%), és a legmagasabb volt a kodonok "lötyögő", harmadik pozíciójában a GC-arány. Az rkpop, rkpz és rkpy gének kodonhasználata ettől merőben eltért. A kódoló szakaszok GC-tartalma sokkal kisebb volt PP dsc_komp3.doc

31 31 (55%), és ennek megfelelően a kodonok harmadik pozíciójában a GC-arány alig haladta meg az 50%-ot. A vizsgált szimbiotikus génekre jellemző értékek az előző két csoport értékei között helyezkedtek el. Jellemző példát mutat az ábra. Az arginint jelentő hat kodon közül három végződik G vagy C bázisra. Míg a "háztartási" gének 85%-a és a szimbiotikus gének 75%-a tartalmaz G vagy C bázis a harmadik pozícióban, addig a fent említett rkp géneknél ez az arány csak 55%. A tirozin kivételével az összes többi aminosav kodonjainak összehasonlítása hasonló eredményre vezetett. Ez azt jelentheti, hogy a törzsspecifikus rkp gének legalább egy csoportja olyan baktériumból származik, amelynek kodonhasználata merőben eltér az S. meliloti kodonhasználatától. Evolúciós léptékkel mérve ezek a gének viszonylag új keletűek az S. meliloti 41 törzs genomjában, ezért GC-tartalmuk még nem növekedett az "ősi" génekre jellemző szintre. hordoz ismert domént vagy motívumot. Egyedüli jellegzetessége, hogy feltételezhetően 2 vagy 3 transzmembrán domént tartalmaz, néhány predikcióra alkalmas program értékelése szerint Az rkpy mutáns által termelt poliszacharid nem prekurzora a K R 5 antigénnek Ha az rkpy mutáns által termelt poliszacharid a K R 5 antigén bioszintézisének valamiféle köztes terméke, akkor a K R 5 antigén bioszintézisét egyértelműen gátló mutációknak ennek a kisebb molekulatömegű poliszacharidnak a termelését is meg kell akadályoznia. A kérdést kettős rkp mutánsok létrehozásával meg lehet válaszolni. E mutánsok létrehozásához egy rkpy spontán mutációt használtunk fel. A 16-3 fág segítségével szelektált fágrezisztens baktériumokat elöbb az általuk termelt poliszacharid vizsgálatával jellemeztük (DOC-PAGE), és kiválasztottuk azokat, amelyek az rkpy::tn5 mutánsokhoz hasonló, egyedi poliszacharid mintázatot mutattak ( ábra). Az rkpy gént hordozó BamHI fragment ( ábra) bejuttatásával a kiválasztott mutánsok esetében helyreállítható volt a vad típusú K R 5 antigén termelése. Ezzel bizonyítottuk, hogy ezek a mutánsok valóban az rkpy génben sérültek, ahogy azt a DOC-PAGE elemzés is mutatta. A kettős rkp mutánsok létrehozásához az rkpy3222 allélt hordozó NE3222 törzset használtuk ábra: Az arginin és threonin kodonhasználat az rkp géneknél Az rkpop, rkpz és rkpy gének kodonhasználata lényegesen eltér a háztartási, de a szimbiotikus génekétől is. Az ábra a vizsgált génekben az egyes kodonok használati arányát mutatja. Mindkét aminosav esetében az utolsó oszlopsor (3. G+C) mutatja azon kodonok arányát, amelyek harmadik pozíciójában G vagy C található Az rkpy gén két különböző poliszacharid bioszintézisét befolyásolja. Az rkp-3 régió jobb oldalán Tn5 inszerciót tartalmazó mutánsok ( ábra) egy, csak rájuk jellemző, viszonylag kis lánchosszúságú poliszacharidot termelnek ( ábra), szimbiózisban képtelenek a növény inváziójára és rezisztensek a 16-3 bakteriofágra. A mutánsok által létrehozott poliszacharidról feltételeztük, hogy az a K R 5 antigén prekurzora. Célul tűztük ki a mutációk által érintett gén(ek) megismerését és a termelt KPS jellemzését Az rkpy gén egy új típusú fehérjét kódol A Tn5(35), Tn5(66) és Tn5(232) mutációk segítségével azonosított, mintegy 6 kb nagyságú régiónak meghatároztuk a bázissorrendjét, valamint a mutáns fenotípust eredményező transzpozon inszerciók pontos beépülési helyét. Az érintett régióban egyetlen, az átlagosnál jóval hosszabb, nyitott leolvasási keretet találtunk, amelyet rkpy génnek neveztünk el ( ábra). A gén 1011 aminosavból álló, feltételezett terméke nem mutat hasonlóságot semmilyen adatbázisban lévő fehérje szekvenciával, nem ábra: Az rkpy gén szerkezete és a mutánsok poliszacharidtermelése A régió fizikai térképe fölött a K R 5 antigén termelését érintő Tn5 inszerciókat hosszú függőleges vonal jelzi. A meghatározott szekvencián az rkpy gént jelentő ORF mellett még egy másik, feltételezett kódoló régió eleje is megtalálható (PK), amelynek feltételezett terméke proteinkinázokkal mutat hasonlóságot. Ez utóbbi gént érintő Tn5(205) inszerciónak, illetve a régióban izolált Tn5(215) és Tn5(50) inszercióknak a baktériumok növekedésére, szimbiotikus képességére vagy poliszacharidtermelésére semmilyen hatását nem észleltük. A DOC-PAGE gélképek: (1) kontroll, vad típusú KPS (AK631), (2) rkpl::tn5(187), (3) rkpo::tn5(158), (4) rkpq::tn5(121) (5) rkpy::tn5(66). A nyíl az rkpy mutánsokra jellemző poliszacharidsávra mutat. LMW/HMW: kis/nagy molekulatömegű KPS. PP.dsc_komp3.doc

32 táblázat: Az rkp kettős mutánsok poliszacharid termelése törzs genotípus termelt KPS 3222 rkpy3222 rkpy 4141 rkpy rkpa::tn5(666) rkpy 4140 rkpy3222+ rkpb::tn5(665) rkpy 4139 rkpy rkpc::tn5(644) rkpy 4199 rkpy rkpk::tn5(207) rkpy 4201 rkpy rkpl::tn5(187) rkpy 4202 rkpy rkpm::tn5(212) rkpy 4200 rkpy rkpq::tn5(124) rkpy Az egyszeres mutánsok poliszacharid termelését az , , ábrák foglalják össze.az rkpa, rkpc, rkpb, rkpk, rkpl, rkpm, rkpq gének mutációi a dupla mutánsokétól teljesen különböző, általában poliszacharidot nem-termelő fenotípust eredményeztek. Az rkpy3222 mutáció mellé, homológ rekombináció segítségével, külön-külön bejuttattunk olyan Tn5 inszerciókat, amelyek az rkp-1, rkp-2 és rkp-3 régiók reprezentáns génjeit érintették. E mutációk helyzetét korábbi munkáink révén már szekvenciaszinten is meghatároztuk (117, 120, 123, 172), tehát pontosan tudtuk, hogy mely géneket érintik (5.1.2., , , ábra). A kettős mutánsok létrehozzása után DOC-PAGE segítségével jellemeztük az általuk termelt poliszacharidokat. Eredményeinket az táblázat foglalja össze. Látható, hogy a második rkp mutációnak nincs hatása az rkpy3222 allél fenotípusára nem tűnik el a kisebb molekulatömegű poliszacharid, tehát valószínű, hogy a két bioszintézisút, az rkpy gén kivételével, nem tartalmaz közös elemet Az rkpy mutánsok egy Kdo-homopolimert termelnek A genetikai kísérletek nem támasztották alá, hogy az rkpy mutánsok által termelt poliszacharid a K R 5 antigén prekurzora. A cukorkémiai vizsgálatok hasonló eredményre vezettek. Az rkpy mutáns baktériumból származó poliszacharidot Bradley Reuhs laboratóriumában elemezték. A mutánsok által termelt poliszacharid és a K R 5 antigén 1D NMR spektruma jelentősen eltért egymástól, ami bizonyítja, hogy a két tisztított poliszacharidot nem azonos építőkövek alkotják. Az elemzések szerint a K R 5 antigén diszacharid egységekből áll (GlcA és Pse5NAc7N(β-OH-But); fejezet), az rkpy mutánsok pedig egy homopolimert termelnek, amely 3-deoxi-D-manno-oktulozonsav (Kdo) egységekből épülő fel (Kdo-PS). A 2D NMR analízis eredménye szerint a polimer a következőképpen írható fel: [->7)-beta-D-Kdop-(2->]. Ez a szerkezet, a K R 5 antigénnel együtt, sok hasonlóságot mutat az Escherichia coli kettes csoportba tartozó K-antigénjeivel Az rkpr a Kdo-PS bioszintézisében vesz részt. Mivel az rkpr és rkpst gének közvetlenül az rkplmnopq gének mellett helyezkednek el, és termékük a KPS-transzportfehérjékhez hasonló, feltételeztük, hogy a K R 5 antigén transzportjában van szerepük. Ezt azonban a létrehozott mutánsok fenotípusa nem igazolta, mivel az inszerciók nem gátolták a K R 5 antigén bioszintézisét ( fejezet). Az rkpr génnek nevezett szakaszon sikerült aktív 'phoa transzlációs fúziót izolálnunk (TnphoA), amely bizonyította, hogy az rkpr egy membránfehérjét kódoló, működő gén. Az fejezetben leírt kísérletek után kézenfekvő volt, hogy megvizsgáljuk az rkpr gén szerepét a Kdo-PS bioszintézisében. A létrehozott rkpr / rkpy kettős mutáns nem volt képes a Kdo-homopolimer termelésére ( táblázat), ezért feltehető, hogy az RkpR és valószínű, hogy az RkpS és RkpT fehérjék is ennek a polimernek a transzportjában nélkülözhetetlenek táblázat: Az rkpr gén szerepe a Kdo-PS termelésében törzs genotípus termelt KPS AK631 K R 5 PP4250 AK631 rkpr::tnphoa(4035) K R 5 PP3222 AK631 rkpy3222 Kdo-PS PP4205 AK631 rkpy rkpr::tnphoa(4035) nincs 5.5. Az RkpM fehérje a 16-3 fág receptorának alkotója Munkánk során szerettük volna tovább pontosítani ismereteinket a K R 5 antigén szimbiózisban betöltött szerepét illetően. Arra voltunk kíváncsiak, hogy létezik-e olyan funkcionális molekularészlet, bioszintézisben bekövetkező utólagos módosítás, amelynek hiányában a szimbiózis az infekciós lépésben elakad. Erre kísérletes bizonyíték az EPS esetében már van (139). A kapszuláris poliszacharid szerkezetének gazdaspecifikus vonatkozásait olyan feltételezett mutáns baktériumtörzsek izolálása révén szerettük volna megismerni, amelyek felszínén a K R 5 antigén módosult változatban van jelen. Ezen fenotípust okozó genetikai mutáció(k) helyének pontos behatárolásával a feltételezett gazdaspecifitásért felelős gén(ek) meghatározható(k), és esetleg a bioszintézisben részt vevő ismeretlen gének azonosítására is lehetőség nyílhat Spontán fágreceptorhibás baktériumtörzsek izolálása Első célunk olyan baktériummutánsok izolálása volt, amelyek felszínén módosult szerkezetű K R 5 antigén van jelen. Mivel feltételeztük, hogy a K R 5 antigén egyúttal receptorként szolgál a 16-3 fág számára (182), ismét a bakteriofágot alkalmaztuk szelekciós eszközként. Ebben az esetben azonban nem egyszerűen a fágra rezisztens mutánsokat kerestünk, hanem olyanokat, amelyeken host range fágmutánsokat is lehet izolálni. Ez a fenotípus azt jelenti, hogy a baktériummutáns felszínén a fágreceptor módosult formában van jelen, és a fágpopulációban előforduló spontán mutánsok között találhatók olyan egyedek, amelyek képesek felismerni ezt a módosult receptort. Egy ilyen mutációt sikerült is találnunk körülbelül 100 függetlenül izolált fágrezisztens mutáns baktérium átvizsgálása során. Ezt GH4046 törzsnek, míg az általa hordozott mutáns allélt rkp-4046 lokusznak neveztük el, gyanítván, hogy az rkp gének valamelyike sérült a mutánsban. A GH4046 törzsön izolált host range fág (16-3 h5) oldalán is elindult a jelenség vizsgálata ( fejezet). PP dsc_komp3.doc

33 A receptormutáció az rkp-3 régión belül található A mutáns gén azonosításához első lépésben meg kellett állapítanunk, hogy az rkp-4046 mutáció eddig még nem azonosított vagy már ismert rkp gént érint-e. Ennek eldöntésére genetikai komplementációs kísérleteket végeztünk. A GH4046 törzsbe egyenként bejuttattuk az rkp-1 (ppp428), rkp-2 (pat330), rkp-3 (pat399, pat401) régiókat hordozó kozmidklónokat. A fágérzékenység helyreállását vad típusú 16-3 fággal teszteltük. Az rkp-1 és rkp-2 régiók bejuttatásával nem tudtuk helyreállítani a vad fenotípust. A teljes rkp-3 régiót két átfedő kozmid klón tartalmazta ( ábra), mivel a régió több mint 50 kb kiterjedésű. Ezek közül a pat401 nem, míg a pat399 képes volt a fágérzékenység helyreállítására, tehát az rkp mutáció az rkp-3 régión belül, annak bal oldali szakaszán található Az rkp-4046 az rkpm gén mutáns allélja A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy az rkp-3 régión belül melyik gén sérült allélja az rkp Újabb komplementációs kísérletek során olyan kozmidklónokat juttattunk be a GH4046 törzsbe, amelyek ismert helyzetű Tn5 transzpozon inszerciót hordoztak egy-egy rkp génben ( ábra). Ha a bejuttatott kozmid klónban a transzpozon nem ugyanazt a gént érinti, mint a GH4046 törzsben lévő rkp-4046 mutáció, akkor minden bioszintézisgén legalább egy, hibátlan kópiája jelen van a sejtben, vagyis komplementáció történhet, a K R 5 antigén bioszintézise helyreáll. A Tn5 inszerció esetleges poláris hatása befolyásolhatja az eredményeket. A komplementáció hiányát vagy megtörténtét ismét fágteszt segítségével állapítottuk meg. Eredményeink szerint csak a pat399 rkpm::tn5 klón nem tudta helyreállítani a vad fenotípust ( táblázat), ami azt jelenti, hogy a GH4046 baktériumtörzs az rkpm egy mutáns allélját hordozza. Ezt rkpm4046 allélnak neveztük el táblázat: A GH4046 törzs jellemzése komplementációs kísérletekkel fágérzékenység bejuttatott kozmid h5 komplementáció nincs kozmid R S nincs pat399 (vad típus) S S van pat399 orf140::tn5(174) S S van pat399 rkpl::tn5(187) S S van pat399 rkpm::tn5(212) R S nincs pat399 rkpn::tn5(107) S S van pat399 rkpo::tn5(168) S S van pat399 rkpp::tn5(105) S S van pat399 rkpq::tn5(124) S S van A GH4046 törzs a vad típusú 16-3 fágra rezisztens (R), a 16-3 h5 fággal szemben pedig szenzitív (S). A vad típusú baktériumot mindkét fág fertőzi. A kísérlet eredményei alapján csak a pat399 rkpm::tn5(212) kozmid nem tudta helyreállítani a vad fenotípust, amiből az következik, hogy a keresett mutáció az rkpm génben van ábra: Fágreceptorhibás törzsek kapszuláris poliszacharid mintázata. A vad típusú (RM41) törzs kapszuláris poliszacharidja egy magas (HMW) és egy alacsony (LMW) molsúlyú komponensből áll. A mutáns GH4046 törzs nem termel kapszuláris poliszacharidot. A GH4178 és a GH4180 később izolált mutánsok ( fejezet), amelyek szintén a fágreceptorban hibásak (DOC-PAGE elválasztási kép). Poliakrilamid-gélelektroforézis segítségével kimutattuk, hogy a GH4046 törzs egyáltalán nem termel kapszuláris poliszacharidot ( ábra). Ebből a szempontból pontosan úgy viselkedik, mint az előzőleg már jellemzett rkpm::tn5 mutáns. Viszont a Tn5 inszerciót hordozó mutánson hostrange fág nem izolálható, azaz ennek felszínéről a receptort alkotó struktúra feltehetően eltűnt, vagy jelentősen megváltozott. Mindez arra utal, hogy kezdeti feltételezésünkkel ellentétben a 16-3 fág receptora valószínűleg nem a K R 5 antigén. A receptor alkotóeleme, az RkpM fehérje és az rkpm4046 allél egy különleges mutációt hordoz, amely egy megváltozott szerkezetű fágreceptort eredményez Az rkpm4046 allélban egy missense mutáció található Az rkpm gén pontos bázissorrendjét már meghatároztuk (120), ami lehetővé tette a mutáns allél izolálásához (PCR), illetve szekvenálásához szükséges oligonukleotidok megtervezését ( ábra). Meglepő módon az rkpm4046 allél elemzésekor két missense mutációt is találtunk, ezért nem tudtuk eldönteni, hogy mi az oka a fágreceptor megváltozásának. Mivel a vad típusú gén szekvenciája az AK631 törzsből származott, a GH4046 mutánst pedig az RM41 törzsből izoláltuk, feltételezhető volt, hogy a két mutáció egyike egyedüli okozója az RkpM fehérje funkcióvesztésének, a másik pedig a két törzs közötti eltérést jelentő, ún. "neutrális" mutáció (polimorfizmus). Miután az RM41 törzsből is meghatároztuk az rkpm gén bázissorrendjét, megállapítható volt, hogy az rkpm4046 mutáns és az rkpm41 vad típusú allél között csak egy eltérés van, a gén 3' végének közelében: a vad típusú allél leucint (L 252 ) meghatározó TTG kodonja fenil-alanint (P 252 ) jelentő TTC kodonná változott ( ábra). Az rkpm41 (RM41) és az rkpm631 (AK631) allélok között talált különbség az RkpM fehérje funkcióit nem befolyásolja, mivel mindkét törzs termeli a K R 5 antigént és érzékeny a 16-3 fágra. PP.dsc_komp3.doc

34 34 Az RkpM fehérje szekvenciájának elemzésekor a legnagyobb hasonlóságot (82%) a Pseudomonas aeruginosa WbpE fehérjével kaptuk (DegT/EryC fehérjecsalád), amelynek pontos funkciója ismeretlen. TopPred programmal végzett elemzés szerint az RkpM három transzmembrán domént tartalmaz (50-70, 73-93, ), amelyek úgy épülnek be a membránba, hogy a fehérje C-terminális része a periplazmikus tér felé néz ábra: A különböző rkpm allélokban azonosított missense mutációk hatása A középen található kettős vonal jelképezi az rkpm gént, amely mellett látható az alkalmazott primerek neve és helyzete. A szürke nyilak az allélok által meghatározott fehérjéket jelképezik, amelyekben feltüntettük a missense mutációk következtében kialakult aminosav-különbségeket. A fehér négyzetek a feltételezett transzmembrán doméneket mutatják. A függőleges nyilak a missense mutációk irányát és helyzetét jelzik. Az 5' végen, a nyitott leolvasási keret elejét jelző ATG előtt több mint 300 bp kódoló kapacitás található, az ugyanabban a leolvasási keretben lévő TGA transzlációs stop kodontól számítva. Elképzelhető ezért, hogy a kódoló régió nem szokványos módon jóval az első ATG előtt kezdődik. Transzlációs kezdetként az itt található "in frame" GTG, de a TTG vagy CTG kodonok is szóba jöhetnek. A 16-3 fág eddig megismert génjei esetében két ATGtől eltérő iniciátor kodon létét bizonyították a géntermék N- terminális aminosavainak meghatározásával. Az int gén GTG (212) míg az immx régió egyik kódoló szekvenciája CTG kodonnal kezdődik (42). A feltételezett H fehérje szekvenciájának meghatározásához mi az első "in frame" TTG kodont használtuk. Ez a kodon a meghatározott DNSszekvencia 85. bázisánál kezdődik, és megelőzi egy GGAG motívum, ami riboszóma-kötőhelyként szolgálhat. Az így létrehozott, 703 aminosavból álló fehérjét összehasonlítottuk a fehérje-adatbázisokkal (SwissProt, TrEMBL), de nem találtunk szignifikáns azonosságot más ismert fehérjékkel, csak a Mesorhizobium loti egy feltételezett fehérjéje mutatott vele 30 %-os azonosságot (E value = 5e-49) A 16-3 fág h génjének szerkezete Egy host range (h6) mutáció körülbelüli helyzetét a fág genetikai-fizikai térképén Palágyi Zsuzsanna azonosította Orosz László laborjában "marker rescue" technikával. Az eredmények szerint a pzs5 klón [BamHI(29)-BamHI(36) fragment], illetve a pzs10 klón [BamHI(34)-BamHI(36) fragment] tartalmazta a mutációt ( ábra). Az érintett gén bázissorrendjét, illetve a mutáció természetét nem határozták meg. Mivel a fágreceptor mutációjának elemzése során több host range fágmutánst is azonosítottunk, ezért elhatároztuk, hogy a h gén szerkezetét és a host range mutáció természetét is megvizsgáljuk. A h6 mutációt a 6,19 kb nagyságú "D" EcoRI fragment területére eső 1,16 kb BamHI fragmenten belül azonosították, ezért a pdh1 kozmid klón segítségével ezeket a DNS-szakaszokat izoláltuk először ( ábra). A BamHI(34)-BamHI(36) fragment nukleotidszekvenciáját elemezve egyetlen olyan leolvasási keretet találtunk, amelyről feltételezni lehetett, hogy a H fehérjét kódolja. Azonban sem a feltételezett gén eleje, sem a vége nem volt rajta ezen a fragmenten, ezért további szubklónok segítségével mindkét irányban tovább folytattuk a szekvencia meghatározását. Végül a feltételezett h gént egy SphI-StuI fragmenten tudtuk lokalizálni ( ábra). A gén végénél azonosítottunk egy transzkripcióterminációs szignálra hasonlító szekvenciát, amelynek jelenléte megerősíti, hogy az azonosított ORF egy valós gént takar. A.gén kódoló részének kezdőpontját azonban nem tudtuk egyértelműen azonosítani ábra: A 16-3 fág h génjének azonosítása és a h5 mutáció jellemzése Felül: a 16-3 fág genomjának fizikai térképe látható. A h a hostrange mutáció helyzetét, míg a vízszintes vonalak a megfelelő klónozott szakaszok hosszát jelzik. Alul: a h gén fizikai térképe, a h5 mutáció helyzete és az általa okozott változás látható. Az kör a h gén előtti "in frame" stop kodont, a szürke téglalapok lehetséges GTG, TTG és CTG start kodonokat, a fekete téglalap az első ATG start kodont, az fehér téglalapok a transzkripció-terminációs szignál helyét jelzik A h5 host range mutáció aminosavcserét okoz. A fágreceptor mutáns GH4046 baktériumon a vad típusú fágpopuláció egy töredéke (kb fág közül) "visszanyerte" fertőzőképességét. Feltételeztük, hogy ezek a fágok egy host-range mutációt hordoznak a farki rostot meghatározó génben, és ez teszi lehetővé a megváltozott RkpM4046 receptorfehérje felismerését. Két, random kiválasztott mutáns fág izolálása után célunk a mutáns allélok (h5, h15) pontos szerkezetének felderítése volt. Mindkét genomból PCR segítségével megsokszoroztuk a h régiót két, erre a célra tervezett oligonukleotid primer alkalmazásával. A fragmentek nukleotidszekvenciáját ezekkel és további két oligonukleotid segítségével határoztuk meg. Mindkét allél esetében pontosan ugyanolyan missense mutációt találtunk a feltételezett H fehérjét kódoló régióban. Ahol a vad típusú fág esetében GGC, azaz glicint kódoló triplet volt, ott a mutánsokban PP dsc_komp3.doc

35 35 GAC kodont találtunk, ami aszparaginsavat határoz meg (5.5.5.ábra). A h5, h15 allélokban lévő missense mutáció bizonyítja, hogy a feltételezett h gén által kódolt fejhérje szerepet játszik a fágreceptor felismerésében. Az aminosavcsere helye arra utal, hogy a kódolt fehérje C-terminális része fontos szerepet tölt be ebben a folymatban A fágreceptor több komponensből áll. Többféle mutáns allél jellemzése révén a receptor - bakteriofág kölcsönhatás pontosabban jellemezhető, ezért szerettük volna megvizsgálni, hogy az előzőekhez hasonló fágreceptor és host range mutációkat milyen más pozíciókban lehet még izolálni. Újabb mutánsizolálási kísérletek segítségével sikerült azonosítanunk egy új típusú receptormutációt (GH4180) és egy új host range fágmutációt (h109), amelyek eltérően viselkedtek az előzőekben megismertekhez képest. Az új mutánsokat is komplementációs ( táblázat) és DOC-PAGE kísérletekben ( ábra) jellemeztük. Az eredményekből kiderült, hogy a GH4180 törzs mutációja nem az rkpm génben található és nem is az rkp-3 régió bal oldalán helyezkedik el, mivel ezzel a DNSszakasszal (pat399) nem lehetett a mutációt komplementálni. A fágérzékeny fenotípus csak a pat401 kozmid bejuttatásakor állt helyre, ami arra utal, hogy a mutáció az rkpz vagy az rkpy génben lehet. Mivel a GH4180 mutáns által termelt poliszacharid az rkpz mutánsok által termelt poliszacharidhoz hasonló elválasztási képet mutat ( ábra), valószínűbb, hogy a fágreceptort érintő mutáció ebben az esetben az rkpz génben található. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a fágreceptort nemcsak az RkpM fehérje alkotja, hanem más összetevője is van, feltehetően az RkpZ táblázat: Fágreceptor-mutációk és host range mutáns fágok jellemzése. törzs bejuttatott kozmid fágteszt h5 RM41 nincs S S S GH4046 nincs R S R 16-3 h109 GH4046 pat399 S S nt GH4046 pat399 rkpm::tn5 (212) R S nt GH4180 nincs R S S GH4180 pat399 R S S GH4180 pat401 S S S S = fágérzékeny (transzkonjugáns esetén komplementáció van), R = fágrezisztens, nt = nem tesztelt Érdekes, hogy a fág esetében is hasonló eredményre jutottunk. A 16-3 h109 mutáns elemzésekor a h génben nem találtunk mutációt, így azt kell feltételeznünk, hogy a változás ebben az esetben más gént (fehérjét) érint. Ezek szerint elképzelhető, hogy a fág több fehérjéje is részt vesz a fágreceptor felismerésében Egy K + /H + antiporter szükségés a növényen belüli szaporodáshoz Az rkp régiók mellett a fix-2 kromoszomális géncsoportnak is szerepe van a növény inváziójában, mivel a régióban mutációt hordozó baktériumok sem képesek behatolni a kialakuló gümő belsejébe. Érdekes és a gének funkciójának megértése szempontjából meghatározó felismerésünk volt az, hogy a mutáns baktériumok érzékenyek a K + -ionok jelenlétére, különösen lúgos phértékek mellett ábra: A pha (fix-2) régió szerveződése. (A): Az izolált Tn5 inszerciók helyzete és Fix (Inf) fenotípusa látható legfelül. A régió fizikai térképe (E: EcoRI) alatt az izolált komplementáló kozmid klónok vannak feltüntetve. (B): A téglalap által jelölt DNS-szakasz szekvenciáját határoztuk meg. A szekvencia elemzése alapján következtetett génsorrend és az aktív TnphoA mutációk helyzete és iránya látható az alsó részen. Minden inszerció korrekt transzlációs fúziót hozott létre az érintett pha génben. E: EcoRI, B: BamHI, Sp: SphI, Sa: SalI A fix-2 régió génjei a K-transzportban és a gümőinvázióban egyaránt fontosak. Kísérleti körülményeink között már 10 mm KCl jelenléte is letális hatásúnak bizonyult a mutánsokra, holott a kontroll sejtek akár 500 mm koncentráció mellett is képesek osztódni. Ez arra utalt, hogy a mutánsok hibásak valamilyen K-transzportot érintő és egyben a környezet kémhatásához való alkalmazkodást elősegítő mechanizmusban. A fix-2 mutációt komplementáló DNS-szakasz izolálása után szintén direkt Tn5 transzpozonos mutagenezis segítségével állapítottuk meg, hogy a régió 6 kilobázispár kiterjedésű, és ezen a szakaszon belül minden egyes Tn5 inszerció azonos fenotípussal rendelkezik.( ábra). A "ph-adaptáció" kifejezés után a régiónak a pha elnevezést adtuk, hogy jobban körülírjuk az itt található gének funkcióját A pha régió membránfehérjéket kódol Az előző fejezetben leírtak alapján feltételeztük, hogy a régiónak a K-transzportban van szerepe. Ebből adódik a következtetés, hogy az itt elhelyezkedő gének (legalább részben) transzmebrán fehérjéket kódolnak. A feltételezés kísérletes bizonyítására alkalikus foszfatáz (phoa) transzlációs fúziókat hoztunk létre a TnphoA tanszpozon segítségével. PP.dsc_komp3.doc

36 36 A phoa fúziós fehérje ugyanis csak abban az esetben lesz aktív, ha az eltalált idegen génben a fúziós pont előtt legalább egy transzmembrán domént vagy szignálpeptidet meghatározó kódoló szekvencia található, és ehhez a megfelelő orientációban és "in frame" csatlakozott a TnphoA transzpozon által hordozott phoa szekvencia. Az aktivitás megléte tehát kísérletes bizonyítéka annak, hogy a vizsgált fehérje transzportálódik a periplazmikus térbe, vagy legalább egy része belenyúlik abba. Az egész pha régióban azonos irányban beépült, aktív 'phoa transzlációs fúziókat tudtunk izolálni, amelyek igazolták feltételezésünket ( ábra). A régió nukleotidszekvenciájának és a TnphoA fúziós pontok szekvenciájának elemzése megerősítette mindezeket ( fejezet) A phaa gén terméke szükséges a megfelelő K + - kiáramlás biztosításához Feltételezésünket támasztják alá a kezdeti K + -transzport mérések is, amelyekben először kimutattuk, hogy csak a K + - transzport sérült a mutáns baktériumokban, a Na + -transzport nem. A kísérletekben Tatsunosuke Nakamura (Institute of Biochemistry, Chiba University, Chiba, Japan) volt segítségünkre. Alkalikus ph-értékeknél membránpermeábilis aminok hatására a sejtek belső ph értéke lúgos irányban tolódik el, mivel a neutrális amin, mint például a dietanol-amin (DEA), bejutva a sejtbe egy protonnal pozitív töltésűvé válik, csökkentve ezzel a belső H + -koncentrációt. Ilyenkor lehet szerepe egy K + /H + antiporternek, amely K + -ionokért cserébe protonokat juttat a sejtbe, visszaállítva így az optimális belső ph-értéket. Méréseink szerint DEA adása után a vad típusú S. meliloti sejtek képesek voltak a K + kiáramoltatására, igazolva ezzel, hogy létezik bennük egy ilyenfajta, a belső ph-t szabályozó mechanizmus. A phaa génben Tn5 inszerciót hordozó mutáns belső K + -koncentrációja DEA adása után is tovább emelkedett ( ábra), jelezve az ionés ph-homeosztázis felborulását, ami feltehetően a sejtek pusztulását eredményezi A pha gének egy K + /H + antiportert kódolnak ábra: A Pha fehérjék másodlagos szerkezete A számozott, függőleges téglalapok jelképezik a számítógépes elemzéssel jósolt transzmembrán doméneket. A 'PhoA fúziók helyét és számát a vízszintes téglalapok jelképezik. A PhaF fehérjénél a fehér téglalap olyan transzmembrán domént jelez, amelynek létét a számítógépes elemzés sem prediktálta biztosra. out: belső membrán külső része (periplazma), in: a belső membrán citoszol felőli oldala A pha régió DNS-szekvenciájának elemzése A Tn5 transzpozonos mutagenezis által behatárolt DNSszakasz nukleotidszekvenciáját is meghatároztuk. A szekvencia elemzése szerint a pha géncsoport hét cisztronból áll (phaabcdefg, ábra), amelyek feltételezett termékei jellegzetes transzmembrán doméneket hordozó fehérjék. A TnphoA transzlációs fúziók pontos szekvenciáját megismerve a számítógépes elemzés által jelzett transzmembrán domének elhelyezkedését sok esetben igazolni tudtuk ( ábra). A régióban kódolt leghosszabb fehérje a PhaA, amely valószínűleg 17, míg a PhaD 13 transzmembrán domént tartalmaz, de eredményeink szerint az összes többi pha gén is ún. integrális membránfehérjéket kódol. Mivel a pha géncsoportban hibás baktériumok mind érzékenyek a K + ionok jelenlétére és a lúgos ph értékekre, ezért feltételezhető volt, hogy ezek a gének egy ph regulációban szerepet játszó K + -efflux rendszer (egy K + /H + antiporter?) elemeit kódolják (180). A K + /H + antiporter aktivitásának vizsgálatára az E. coli esetében már régóta használatosak a kifordított membránvezikulumok. A vezikulumokban a K + /H + antiporter a külső K + -koncentráció növelésekor K + -ionokat szállít a belső térbe és H + -ionokat bocsájt ki. A növekvő külső H + -ionkoncentráció egy fluoreszcens festék segítségével nyomon követhető. Az S. meliloti vadtípusú és pha mutáns baktériumokból megpróbálkoztunk kifordított membránvezikulumokat izolálni, de a vad típusú minták esetében sem tudtuk az alapvető antiporter-aktivitásokat (K + /H +, Na + /H + ) kimutatni. Alternatív lehetőségként a pha géneket hordozó kozmidklónt juttattuk be egy olyan E. coli törzsbe, amelyből minden antiporter gént eltávolítottak (TO114, nhaa, nhab, chaa). Ha a kozmidklón hordoz antiporter géneket, és azok kifejeződnek az E. coli sejtekben, akkor a törzsből készített membrán vezikulumokban ezt az aktivitást ki kell tudnunk mutatni. Negatív kontrollként a ppp2480 kozmidszármazékot alkalmaztuk, amelyen a phaa gént egy Tn5 inszerció inaktiválta. Az ábrán látható, hogy KCl adásakor a vad típusú pha géneket tartalmazó E. coli mintákban gyenge ph-változás, azaz H + -kiáramlás volt mérhető. A phaa::tn5 mutációt hordozó kozmid esetében ez nem következett be. Valószínű tehát, hogy a pha gének egy K + /H + antiportert kódolnak. PP dsc_komp3.doc

37 ábra: A K + -kiáramlás a pha mutáns sejtekben gátolt A kontroll méréseket (AK631) az üres, míg a mutáns baktériummal [AK631 phaa::tn5(328)] kapott eredményeket a fekete szimbólumok jelzik. (A): Az intracelluláris K-tartalom változása 0,4 M NaCl, 50 mm Tricin-NaOH (ph:8,9) vagy 0,4 M NaCl, 50 mm dietanol-amin-hidroklorid (DEA, ph:8,9) kezelés hatására. (B): Az intercelluáris Na-tartalom változása az (A) pontban megadott körülmények között. (C): Az intracelluláris K + - ( ) vagy Na + -tartalom ( ) változása 0,4 M KCl, 50 mm DEA (ph:8,9), 0,4 % glükóz hatására ábra: A pha gének K + /H + antiportert kódolnak Az E. coli antiportereket nem tartalmazó TO114 ( nhaa, nhab, chaa) törzsbe bejuttatuk a ppp664 (pha + ) (A), a ppp684 (pha + ) (B) vagy a ppp2480 (phaa1::tn5) (C) kozmidklónokat. Ha a bejuttatott DNS K + /H + antiportert kódol, akkor a transzformánsokból készített kifordított membránvezikulumok KCl adására ( ) H + -ionokat bocsájtanak ki. Ez ph-változást okoz, ami egy fluoreszcens fesék segítségével mérhető (fluorescence quenching). PP.dsc_komp3.doc

38 38 6. Az eredmények értékelése 6.1. Sejtfelszíni poliszacharidok és a szimbiózis Munkánk kezdetekor már ismert volt az, hogy a baktérium által termelt exopoliszacharidok (EPS) meghatározó szerepet játszanak a rhizobiumok és növénypartnereik között létrejövő szimbiotikus kapcsolatban. Úgy tűnt, hogy az ún. "indeterminált" gümőt létrehozó fajoknál csak az EPS jelenléte szükséges a fertőzési folyamatban, míg az ún. "determinált" gümőt eredményező kapcsolatokban a lipopoliszacharidé (LPS) a főszerep, és más sejtfelszíni molekula nem vesz részt a folyamatban (116) Az rkpa rkpq gének szerepe Az rkp-1 (fix-23) régió kezdeti elemzésekor kiderült, hogy az EPS-en kívül egy másik sejtfelszíni struktúra is játszhat hasonló szerepet az invázióban (182). A létrehozott mutációk nemcsak az invázió folyamatát gátolták, hanem rezisztenciát okoztak az S. meliloti 41 törzsre specifikus 16-3 fággal szemben. Kimutattuk, hogy a rezisztencia oka a sejtfelszín megváltozása, a fágreceptor és egyben egy sejtfelszíni poliszacharid eltűnése. A rendelkezésre álló adatok alapján akkor úgy gondoltuk, hogy az érintett poliszacharid az LPS. Az rkp mutánsok és az általuk termelt poliszacharidok elemzése révén azóta sikerült bizonyítani, hogy ez a másik felszíni szerkezet a rhizobiumoknál addig még nem ismert kapszuláris poliszacharid, amely nagyon hasonló az E. coli törzseknél már jól jellemzett II. típusú K- antigénekhez (172, 187). A Gram-negatív baktériumok poliszacharidbioszintézise több, egymást követő lépésben folyik. Először a nukleotid-cukor-difoszfát prekurzorok szintézise történik meg, majd az ismétlődő alegység polimerizációja következik egy lipidhordozón úgy, hogy a monoszacharid komponensek hozzáadása annyi lépésben történik, ahány tagból az alegység áll. Ezután következhet az elkészült alegység "dekorációja", a különböző szubsztituensek hozzáadása (piruvát, szulfát, acetát... stb.). Végül a kész alegységre a saját lipidhordozójáról áthelyeződik a már előbb elkészült poliszacharidlánc. A kész poliszacharid sejtfelszínre való transzportja a lánc bioszintézisének befejezése után történik meg (240). Kooperációs partnereink már meghatározták több S. meliloti és S. fredii törzs által termelt KPS szerkezetét is. Az általunk vizsgált S. meliloti 41 törzs az időközben bevezetett nevezéktan szerint a KR5 antigént termeli, amely diszacharid alegységekből épül fel. Az alegység egy glükuronsavból és egy pseudaminsavból áll, amelyen 7-Nacetil and 5-N-β-hidroxibutiril módosítások is találhatóak ( fejezet). A pontos kémiai szerkezet meghatározása mellett talán általánosabb érdeklődésre számot tartó eredmény az, hogy kiderült: a hét glükóz- és egy galaktózmolekulát tartalmazó alegységekből álló exopoliszacharidot (EPS I) egy teljesen más kémiai szerkezettel rendelkező poliszacharid (KR5 antigén) képes helyettesíteni a gümősejtek fertőzése során. Ha az exopoliszacharidoknak szerepe van a felismerési folyamatokban mint ahogy ezt feltételezik akkor két, teljesen eltérő kémiai szerkezet esetén hogyan valósulhat ez meg? Az ellentmondás talán feloldható azzal, ha feltételezzük, hogy a kétféle szerkezetet két különböző, csak az egyikre vagy a másikra specifikus növényi mechanizmus ismeri fel. Létezik is egy olyan lucernamutáns, amelyet a KPS - és EPS + S. meliloti 41 törzs képes fertőzni (RM41), de a KPS + és EPS - (exob -, AK631 törzs) nem (Kiss György Botond személyes közlése). Elképzelhető, hogy ebben a lucernamutánsban a KPS-felismerő mechanizmus sérült, míg az EPS-felismerő mechanizmus jól funkcionál. Az rkp-1 régió génjeinek, illetve azok feltételezett termékeinek szekvenciájából és a mutánsok által termelt poliszacharid elválasztási képéből ( ábra) arra következtettünk, hogy a régió egy lipidhordozó bioszintézisét irányítja, amely a KPS-bioszintézis késői fázisában és a KPS sejtfelszínen való megjelenéséhez szükséges. Az is valószínű, hogy a KPS egy bizonyos lánchosszúságig (8-15 ismétlődő egység) egy másik hordozón készül el (123). Eredményeinket megerősíti Epple és társai munkája is (69), amelyben bizonyították, hogy az rkpf ahogy azt a szekvencia elemzéséből feltételeztük valóban egy acilhordozó (ACP) fehérje. Érdekes különbség derült ki az S. meliloti 1021 genomprojekt befejezése után. Amíg az általunk vizsgált S. meliloti 41 törzsben hat külön kódoló szekvencia van (rkpabcdefg), és így hat önálló alegység alkotja a feltételezett zsísavszintáz komplexet, addig az S. meliloti 1021 törzsben az érintett kódoló szekvenciák fuzionáltak, és együtt alkotják az rkpa1021 gént, amely a patkány zsírsavszintázhoz (FAS) hasonlóan egyetlen, nagy multifunkcionális fehérjét kódol (203). Mivel világossá vált, hogy az rkp-1 régió nem tartalmazza a cukor-alegységek bioszintéziséhez szükséges géneket, célul tűztük ki ezen gének izolálását, szerkezetük és funkciójuk meghatározását. A gének azonosításához szükséges mutánsok izolálásában és jellemzésében a 16-3 fág kiváló eszköznek bizonyult. Sikerült két további rkp régiót azonosítanunk, amelyek az rkp-2 és rkp-3 nevet kapták. Az rkp-2 régióban azonosítottuk a K R 5 antigén diszacharid alegységeit alkotó egyik cukor-komponens (glükuronsav, GlcA) bioszintéziséért felelős rkpk gént. A szekvenciaanalízis segítségével és a mutánsok biokémiai vizsgálatával azt is megállapítottuk, hogy az RkpK fehérje egy UDP-glükóz-dehidrogenáz, amely feltehetően az UDPglükóz UDP-glükuronsav reakciót katalizálja. Ez a fehérje illetve az általa készített UDP-glükuronsav mind a KPS, mind az LPS bioszintéziséhez szükséges, mivel a génben hibás mutánsok mindkét makromolekula létrehozásában sérültek. A régióban egy másik gént is azonosítottunk (lpsl), amelynek terméke a fehérjeadatbázisokkal való öszehasonlítás alapján valószínűleg egy UDP-glükuronsav epimeráz enzim, ami UDPglükuronsavból UDP-galakturonsavat készít. A mutánsok genetikai-biokémiai elemzéséből valószínű az is, hogy ez a gén az rkpk génnel együtt részt vesz az LPSbioszintézisben ( ábra), de nem szükséges a KPS létrehozásához. Eredményeink és az ismert irodalmi adatok alapján az tűnik valószínűnek, hogy a GlcA bioszintézisében az RkpK fehérjén kívül egyes exo gének által kódolt enzimek vesznek részt. Első lépésként a glükóz-6-foszfát konverzióját glükóz- 1-foszfáttá a foszfoglükomutáz enzim végzi, amelyet S. melilotiban az exoc gén kódol ( ábra). Az exoc mutációi egyaránt érintik az EPS I, az EPS II, az LPS, valamint a ciklikus β-glükán bioszintézisét (28), tehát központi és esszenciális szerepe van. Hasonló funkciójú gén nem található az S. meliloti genomban. A glükóz-1-foszfát reverzíbilis átalakulását UDP-glükóz molekulává egy UDP- PP dsc_komp3.doc

39 39 glükóz-pirofoszforiláz enzim végzi, amelyet az exon gén is kódolhat. Az exon mutációi azonban nem szüntetik meg teljesen az EPS termelését (16), így feltételezni kell legalább még egy, hasonló funkciójú gén részvételét a folyamatban. Eredményeink szerint az UDP-glükózt az rkpk gén által kódolt UDP-glükóz-dehidrogenáz oxidálja UDP-glükuronsavvá ( ábra) ábra: Az RkpK és LpsL fehérjék szerepe az LPS- és KPSbioszintézisben A glükuronsav (GlcA) a K R 5 antigén egyik alkotója. A glükóz-6- foszfátból az ExoC és valószínűleg az ExoN enzimek készítenek UDP-glükuronsavat. Ebből az LpsL epimeráz szintetizál UDPgalakturonsavat, ami szükséges a vad típusú LPS bioszintéziséhez. A harmadik izolált régió az rkp-3, amelynek analízisével bizonyítottuk, hogy az ott található gének nagy része (rkplmnopq) elengedhetetlen a KPS-bioszintézishez és feltehetően a diszacharid ismétlődő egység másik cukorösszetevőjének a pszeudaminsav származék, Pse5NAc7N(β-OH-But) felépítéséhez szükséges. A számítógépes szekvenciaelemzések eredményei is ezt támasztják alá. Az táblázat foglalja össze az egyes gének feltételezett funkcióját. Nem várt fenotípust mutat az rkpo::tn5 inszerciós mutáció, mert a mutánsok termelik és exportálják alig kimutatható mennyiségben ugyan a nagy molekulatömegű (HMW) KPS-t. A szekvenciahasonlóság alapján az RkpO fehérje lehetne a Pse-transzferáz, amely a Pse beépítéséért felelős. Ha ez így lenne, akkor a mutáns baktérium KPS-bioszintézise egy alapvető enzimet nélkülözne, és ezért nem szabadna semmiféle KPSmolekulának termelődnie. Feltételezhetjük ezért, hogy mégsem az RkpO fehérje a Pse-transzferáz, vagy kell lennie még egy, a transzferáz funkcióját ellátó enzimnek. Az rkpo::tn5 mutánsok fenotípusa azért is érdekes, mert erről a génről feltételezzük, hogy az rkplmnopq transzkripciós egység része. Ezért a poláris hatás következtében az rkpo::tn5 inszerciónak, hasonlóan az rkpp::tn5 és rkpq::tn5 mutációkhoz, meg kellene akadályozni a KPS szintézisét. Mivel eredményeink szerint ez nem történik meg, elképzelhető, hogy az rkppq gének saját promoterról íródnak át bár a szekvencia elemzése ezt nem valószínűsíti vagy az is lehet, hogy az rkpo::tn5 mutációknak nincs poláris hatása. Ezt az ellentmondást egy részletesebb analízis eredménye oldhatja csak föl Az rkp gének eredete és szerveződése Bizonyítottuk, hogy a kromoszomális rkp-1 és rkp-2 régió génjei szélesebb körben elterjedtek, mivel a Sinorhizobium genuszon belül, DNS-hibridizációs kísérletekkel, mindenütt ki tudtunk mutatni hasonló szekvenciákat. Az rkp-3 régió viszont jórészt valóban törzsspecifikus (KR5 antigén specifikus) géneket tartalmaz, amelyek más S. meliloti törzsekben nem fordulnak elő. Ez érthető is, hiszen például az S. meliloti NRG247 törzs KR6 antigénje glükóz és szialinsav, az S. meliloti NRG185 törzs KR7 antigénje pedig N-acetil-glükózamin és Kdo egységekből épül fel (188) és ezek bioszintéziséhez teljesen más enzimek szükségesek. A jövőben tervezzük ezen, törzsspecifikus KPS gének analízisét is, amely lehetővé tenné a különböző KPS-struktúrák szimbiózisban betöltött szerepének részletesebb vizsgálatát. A különböző S. meliloti gének GC-tartalmának és kodonhasználatának elemzésével azt is kimutattuk, hogy a K-antigén specifikus gének viszonylag fiatal alkotói a genomnak. Tehát a rhizobiumok esetében is igaz az, amit az E. coli és más patogén baktériumoknál is feltételeznek: a K- antigén specifikus géncsoportok horizontális géntranszferral kerülnek a genomba, biztosítva ezzel a felszíni struktúrák változatosságát, ami fontos tényezője lehet a baktérium és a gazdaszervezet között kialakuló kapcsolatnak. A K R 5 antigént is alkotó pszeudaminsavat (Pse) eredetileg Pseudomonas törzseknél fedezték fel. Emiatt már néhány évvel ezelőtt felfigyeltünk arra, hogy az RkpM fehérje pont a P. aeruginosa WbpE fehérjéjére hasonlít a legjobban (82% azonosság). Szerettük volna tudni, hogy található-e olyan Pseudomonas géncsoport, amelynél az rkpl - rkpq csoporthoz hasonló a homológ gének elrendezése. A választ 2002-ben Raymond és társai munkája adta meg (183), amelyben 20 különböző szerotípusba tartozó P. aeruginosa törzsnél izolálták a megfelelő géneket, és meghatározták DNS-szekvenciájukat. Legalább 11-féle különböző géncsoportot tudtak elkülöníteni, amelyek feltételezésük szerint az O-antigén szerotípusra jellemző bioszintézisét irányítják. Az O-antigén az LPS variabilitását adó poliszacharidlánc, tehát ugyanúgy sejtfelszíni antigén, mint a KPS. Összehasonlításokat végezve kimutattuk, hogy a P. aeruginosa O9 szerotípust képviselő törzsében pontosan ugyanolyan sorrendben helyezkednek el a homológ fehérjéket kódoló szakaszok (AF498420; ORF_6 ORF_11), mint az rkp-3 régióban (rkpl rkpq). Tehát az S. meliloti 41 törzs, horizontális géntranszfer révén, valóban kaphatta ezt a "géncsomagot" egy Pseudomonas törzstől. De a szintén alacsony (49%) GC-tartalmú O9-es O- antigént meghatározó gének (183) ugyanúgy "új jövevénynek" számítanak a magas (61%) GC-tartalmú Pseudomonas genomban, mint az S. meliloti 41 genomban. Az adatbázisok elemzésével egyelőre nem juthatunk közelebb az rkpl rkpq.gének eredetéhez. PP.dsc_komp3.doc

40 ábra: Az S. meliloti 1021 törzs rkp-3 régiója Az S. meliloti 41 törzsnél megismert rkp gének közül csak az rkpr, rkpst és rkpz található itt meg több, poliszacharidbioszintézisben feltételezetten szerepet játszó (moc, kps) és sok ismeretlen funkciójú gén társaságában. Munkánk során az rkp gének szerveződéséről is képet kaptunk. Kiderült, hogy S. meliloti esetében ezek a gének nem mind helyezkednek el egy csoportban, mint ahogy azt a sokféle K-antigént termelő E. coli törzsek esetében "megszoktuk"(191, 239), de az rkp-3 régióban mégis együtt található a legtöbb, a K R 5 antigén bioszintézisében fontos gén. A konzerválódott feltehetően egy transzportfolyamatban szerepet játszó rkpst és rkpr génekről viszont kimutattuk, hogy nem a K R 5 antigén, hanem egy másik poliszacharid, a Kdo-PS megjelenésében játszanak fontos szerepet. Az rkp-3 régiónak megfelelő DNS-szakasz az S. meliloti 1021 törzsnél az 1,68 Mb nagyságú psymb megaplazmid részét képezi (73). A megaplazmid 14%-a poliszacharidbioszintézisért felelős géneket tartalmaz, amelyek között legalább az rkp-3 régió génjei törzs- és nem fajspecifikusak, hasonlóan az E. coli K-antigéneket meghatározó régióihoz. A 1021 törzsnél hiányzik a régióból a legtöbb általunk meghatározott rkp gén, de az rkpr, rkpst és rkpz egy csoportban megtalálható. Ezek közelében az rkpz és rkpt géneknek még egy kópiája azonosítható ( ábra) A Kdo-PS bioszintézis génjei: rkpr, rkpst, rkpy Mutációk segítségével azonosítottuk az rkp-3 régió jobb oldalán elhelyezkedő rkpy gént. A gén feltételezett fehérjeterméke egy 1011 aminosavból álló transzmembrán fehérje lehet, amely semmilyen más ismert fehérjével nem mutat hasonlóságot. Funkciójára csak a mutánsok elemzése alapján következtethetünk. Az rkpy::tn5 mutánsok sem képesek a növény inváziójára, és nem mutatható ki belőlük a vad típusra jellemző KPS. Termelnek viszont egy kisebb molekulatömegű anyagot, amelyről feltételeztük, hogy az a sejtfelszínen megjelenő K R 5 antigén prekurzora. Várakozásainkkal ellentétben kettős mutánsok előállításával kimutattuk, hogy az rkpy mutánsokra jelemző poliszacharid termelésében nem vesznek részt a már ismert rkp gének (rkpa - rkpq). Az egyes géncsoportokat reprezentáló gének elrontása esetén nem szűnik meg az rkpy mutánsra jellemző ismeretlen poliszacharid termelése, míg ugyanezen mutációk legtöbbje a vad típusú genetikai háttérben teljesen megszünteti a K R 5 antigén termelését. Ezek szerint az rkpy mutánsok által létrehozott poliszacharid nem lehet a K R 5 antigén kisebb molekulatömegű változata. Ezt a feltételezést igazolta az rkpy mutánsokból tisztított poliszacharid elemzése is, amiből kiderült, hogy az egy Kdo-egységekből álló homopolimer (Kdo-PS). Eredményeink szerint tehát az rkpy gén sérülése révén megszűnik a K R 5 antigén bioszintézise, és elindul egy Kdohomopolimer termelése. Semmilyen más rkp génnek a hibájából ez nem következik be, így az RkpY fehérje valamiféle szabályozó (kapcsoló) funkciót láthat el a két poliszacharid bioszintézisében. Korábban feltételeztük (120), hogy a kész K R 5 antigén az rkpst és az rkpr gének termékeinek (ABC-transzporter és KpsE periplazmikus protein homológok) segítségével juthat a sejtfelszínre. Ezek a fehérjék nagyon hasonlóak a megfelelő E. coli KPS-transzport fehérjéihez, de a géneket érintő mutáció nem állítja le a KPS-bioszintézist, ahogy az a homológ E. coli gének esetében bekövetkezik (191, 239). Hogy eredetileg az rkpst és az rkpr géneket mégis az rkp gének közé soroltuk, annak az az oka, hogy a K R 5 antigén bioszintézisét meghatározó gének veszik őket közre (rkpl - rkpq "balról" és lpsz "jobbról"; ábra). Az eddig leírt KPS-bioszintézis géncsoportok pedig hasonló, konzervatív felépítést mutattak, ahol a törzsspecifikus bioszintézis-gének mellett közvetlenül a transzportot irányító, minden törzsben azonos, konzerválódott gének találhatók (239). Az 5.4. részben genetikai és biokémiai bizonyítékot szolgáltattunk arra, hogy az rkpr génnek a Kdo-PS bioszintézisében van meghatározó szerepe, ami az S. meliloti 41 törzsben csak az rkpy gén meghibásodása esetén termelődik. Valószínű tehát, hogy az rkpr mellett lévő rkpst gének ( ábra) szintén a Kdo-PS transzportjában vesznek részt. Ezt a feltételezést a közeljövőben kísérletekkel szeretnénk igazolni. A Kdo cukormolekula és Kdo-homopolimer bioszintézisét kódoló génekről nincsenek ismereteink. Elképzelhető, hogy nagy részük a kromoszómán és nem a psymb megaplazmidon helyezkedik el, mivel a Kdo fontos, nem törzsspecifikus eleme az LPS-nek is. Érdekes, hogy kulcsszavas kereséssel az S. meliloti 1021 genomprojekt SRS-rendszerén (203) csak egy CMP-Kdo-szintázzal homológ fehérjét kódoló gén (kdsb) egy-egy kópiáját lehet megtalálni, azokat is különváltan, a két megaplazmidon A 16-3 fágreceptor és a K R 5 antigén bioszintézis A fágrezisztenciát okozó baktériummutációk és a mutáns baktériumon izolálható host range fágmutációk elemzése bepillantást ad a felismerési mechanizmusok PP dsc_komp3.doc