A molekuláris biológia eszközei

Átírás

1 A molekuláris biológia eszközei I. Nukleinsavak az élő szervezetekben Reverz transzkripció replikáció transzkripció transzláció DNS DNS RNS Fehérje DNS feladata: információ tárolása és a transzkripció szabályozása helye eukariótáknál: sejtmag + mitokondriumok( kbázis) RNS fajtái: mrns (hnrns), trns, rrns, ribozimok feladata: fajtánként más Fehérjék: (enzimek, szerkezeti fehérjék, receptorok, stb.) Nukleinsavakkal kapcsolatos fontosabb enzimek: polimerázok, nukleázok, ligáz foszfatázok, kinázok, (proteinázok)

2 II. Replikáció DNS polimeráz (DNS függő DNS polimeráz, irány: 5 3, RNS primer az elején, repair) dntp-k (datp, dctp,dgtp,dttp) Puffer (pl. Tris vagy foszfát; megfelelő ph, pl. 7.2, megfelelő sókoncentráció: Na +, Mg 2+ ) Ligáz (Okazaki fragmentumok)

3 III. Transzkripció RNS polimeráz (DNS függő RNS polimeráz, irány: 5 3 ) Transzkripciós faktorok (fehérjék) NTP-k (ATP, CTP, GTP, TTP) Puffer (pl. Tris vagy foszfát; megfelelő ph, pl. 7.2, megfelelő sókoncentráció: Na +, Mg 2+ )

4 Represszor fehérje * III. Transzkripció 2. (génműködés/szabályozás, a laktózoperon működése) Laktóz RNS polimeráz + Glükóz + Glükóz + Laktóz Fogalmak: operon(több génből álló működési egység) iniciátor/promóter régió pozitív és negatív szabályozás: transzkripciós faktor (itt a CAP fehérje) (camp kell a fehérje kötődéshez, ami nincs, ha van glükóz) represszor fehérje/gén az operátor régióhoz kötődik {fokozó (enhancer) régió } * * - Glükóz + Laktóz Lac operon működése: + Glükóz : a represszorfehérje képződik, hozzákötődik a laktózbontó enzim génjének operátor régiójához gátolva ennek átíródását + Laktóz : laktóz jelenlétében a represszor fehérjét a laktóz kititrálja, így elvileg íródhatna a laktózbontó enzim génje, de az átíráshoz a CAP fehérje és camp is szükséges, ami csak glükóz hiányában teljesül * Represszor fehérjét kódoló gén

5 IV. Reverz transzkripció (retrovírusok) Reverz transzkriptáz Rnáz H DNS polimeráz Integrálódás a gazdasejt genomjába RNS DNS-RNS heteroduplex DNS DNS-DNS duplex Reverz transzkriptáz (RNS függő DNS polimeráz, irány: 5 3 ) Rnáz H aktivitás (heteroduplex hasítás) dntp-k (datp, dctp,dgtp,dttp) Puffer (pl. Tris vagy foszfát; megfelelő ph, pl. 7.2, megfelelő sókoncentráció: Na +, Mg 2+ )

6 V. mrns érés, Transzláció mrns szerkezete prokarióták / eukarióták (élesztő), exonok / intronok mrns érés (splicing, alternatív splicing, hibás szabályozás betegségek) poli A farok, 5 -CAP (fordított irányú metilált G) in vitro transzlációs rendszerek, (fehérjeszintézis gátlásának vizsgálata, GFP, Green Fluorescent Protein)

7 VI. Enzimek, mint molekuláris biológiai eszközök Nukleázok Közös bennük, hogy a nukleinsavak foszfodiészter kötéseit képesek hasítani. Típusok Exonukleázok(polimerázoknak is van ilyen aktivitásuk) Endonukleázok DNázok, RNázok Exonukleázok A nukleinsavat a végéről kezdik el hasítani. Különböző helyeken hasíthatnak, így a termék is különböző lehet (Pl. S1 nukleáz egyszálú DNS-t v. RNS-t hasít, 5 -foszfát termékek képződnek; Snake Venom Phosphodiesterase, SVPD hasonló) Nukleinsavak lebontásos vizsgálata (+foszfatázok használata)

8 VI. Enzimek Restrikciós endonukleázok 1. Endonukleázok 1960-as évek H. Smith, W. Arber, D. Nathans Funkció Gazdaspecificitás (a prokariótáknál vették észre, hogy meg tudja különböztetni a szervezet a saját és idegen DNS-t) -> Baktérium védekező mechanizmusa: saját DNS metilálása, idegen DNS hasítása Kettős szálú DNS mindkét szálának hasítása Általában 4-8 bázis hosszú felismerő/hasító hely (ált. palindrom szekvencia) Hasítás után tompa/egyenes vagy ragadós vég (blunt end, sticky end) 5 -foszfát és 3 -OH marad a hasítás után mindkét szálon (van kivétel! NciI) Elnevezés (baktérium után amiből izolálták + római számok időrendben Hinf I, EcoRI) Típusok (Az enzimek nevében a római szám nem az enzim I. II. vagy III. típusára utal, hanem csak arra, hogy időrendben mikor fedezték fel. Ez két teljesen független dolog semmi közük egymáshoz.) I. és III. Felismerés specifikus, de a hasítás nem. Ahányszor látja az enzim a felismert szekvenciát hasít egyet, de véletlenszerűen akárhol (tandem enzim: metiláz és nukleáz egyben) II. Specifikus felismerőhely és ott vagy attól nem messze, de pontosan meghatározott helyen hasít. (Nem tandem enzim, ezért szétválasztható a metiláz és nukleáz.)

9 VI. Enzimek Restrikciós endonukleázok 2. Példák SmaI...GGG CCC......CCC GGG......GGG CCC......CCC GGG... XmaI...G GGCCC......CCCGG G......G GGCCC......CCCGG G... BSpRI, HaeIII...GG CC......CC GG......GG CC......CC GG... EcoRI...G AATTC......CTTAA G......G AATTC......CTTAA G...

10 VI. Enzimek Restrikciós endonukleázok 3. Példák HpHI...GGTGANNNNNNN N......CCACTNNNNNNN N......GGTGANNNNNNN N......CCACTNNNNNNN N... HinfI...G ANTC......CTNA G......G ANTC......CTNA G... HindIII...GTPy PuAC......CAPu PyTG......GTPy PuAC......CAPu PyTG... N: akármilyen bázis lehet; Pu: csak purin bázis lehet (A, G); Py: csak pirimidin bázis lehet (C, T)

11 VI. Enzimek Egyéb fontos enzimek Ligáz (DNS összeragasztása, 5 -foszfát és 3 -OH szükséges hozzá) Kinázok, foszfatázok (foszfát bevitele/levágása) Proteinázok, (+Rnázok, Dnázok) DNS/RNS/fehérje tisztítási műveleteknél használhatók

12 VII. Klónozás célok, lehetőségek, eszközök baktériumok, mint munkafelület

13 VII. Klónozás DNS hordozók = Klónozó vektorok Klónozó vektorokkal szemben támasztott követelmények: önállóan replikálódjon be lehessen vinni élő sejtbe (transzformálható legyen) legyenek markerek benne (szelekciós lehetőség) 1. Plazmid vektorok Plazmid önálló osztódásra képes kis méretű extrakromoszómális kettős szálú DNS gyűrű feladatuk általában egy-két, a baci számára fontos gén hordozása (pl. antibiotikum rezisztenciagének) baktérium Genomi DNS gyűrű bizonyos baktériumok pl. klóramfenikollal kezelve úgy osztódnak, hogy CSAK a plazmid osztódik, de a genomi DNS nem! Ca 2+ tartalmú oldattal kezelve a baci sejtek transzformálhatók plazmidokkal (~ 0.1%)

14 VII. Klónozás Plazmidvektor felépítése Rezisztenciagén 1. Markergén 2. Replikációs origó Restrikciós hasítóhelyek

15 VII. Klónozás 1. DNS emésztése 2. plazmidok hasítása 3. ligálás (rekombináns plazmid DNS) 4. transzformálás

16 VII. Klónozás 5. Szelekció 1 6. Szelekció 2 (Pl. β-galaktozidáz gén sérül, ha sikeres volt a klónozás, a DNS bekerült a plazmidba -> fehér színű telep.)

17 VII. Klónozás Lehetőségek: klóntárak készítése adott gének kikeresése, majd klónozása, sokszorozása a klónozott gén vizsgálata fehérjék termeltetése (in vitro transzlációs rendszerben vagy baciban kiválasztás )

18 VII. Klónozás 2. Vírus vektorok (fágok, λ-fág) Előnyök: nagyobb méretű DNS Klónozható (75-106%) (8-20 kbázis) jobb transzformáció (~10%) Hátrány: pl. minimális méretű klónozandó DNS szükséges

19 VII. Klónozás 3. Kozmidok Olyan vektor, ami plazmidként és fág DNS-ként is tud viselkedni, mert van benne replikációs origó a plazmidként történő szaporodáshoz, de van benne olyan szekvencia ( cos hely), ami a fágfehérjébe történő bepakolódáshoz kell. Így baciban könnyen szaporítható és vírusként lehet vele transzformálni. Beépíthető akár 40 kbázis idegen DNS is. 4. Élesztő (YAC=Yeast Artificial Chromosomes) Élesztősejtekben szaporodni képes vektor, amibe akár 100 kbázis nagyságú idegen DNS is bevágható. Rendelkezik replikációs kezdőponttal (ARS: Autonomously Replicating Sequence) Van benne centromer régió (CEN) és telomer végek, amik szintén a replikációhoz szükségesek Élesztő DNS rész, ami helyettesíthető (max. 100 kbázis) LEU2 régió (szelekciós marker leucinmentes táptalajon csak a transzformált sejtek nőnek ki). Léteznek élesztő-baktérium vektorok is.

20 VIII. cdns könyvtárak AAAAAAA AAAAAAA affinitás krom. szil. hordozóhoz kötött polit v. mágneses szeparálás AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA rrns, trns, m RNS TTTT TTTT TTTT TTTT AAAAAAA RNS-ek a sejtből TTTT TTTT TTTT csak m RNS-ek Reverz transzkriptáz Rnáz H / lúgos hidrolízis DNS polimeráz Klónozás, Vizsgálat m RNS DNS-RNS heteroduplex DNS DNS-DNS duplex